专利名称：抑制血管生成的模型和方法
技术领域：
本发明涉及血管生成及其抑制领域。更具体来说，本发明涉及使用光动力治疗来抑制新血管形成。
背景技术：
光动力治疗(PDT)是首先被提议用作治疗恶性肿瘤的方法。在该方法中，给受治疗者施用光敏剂例如卟啉衍生物或酞菁；据信光敏剂优先集中在肿瘤组织内。然后用具有适当波长、并能被光敏剂吸收的光照射肿瘤组织，该光敏药物的衰变导致药物再生并破坏或损害周围组织。
PDT用于治疗肿瘤已经确立了很多年，开始时是使用血卟啉衍生物(HPD，卟啉混合物)和更有效的HPD衍生物(卟菲尔钠)，卟菲尔钠描述在例如US4932934中。除了治疗肿瘤以外，PDT还被用于治疗动脉粥样硬化斑块(如US4577636所述)和皮肤疾病(如US4753958所述)。如US4878891和US4727027所述，PDT还被用于从血液和体液中根除病原体。
在例如US5171749中描述了称为“绿卟啉”的一类特别有用的光敏剂，该文献引入本发明以作参考。
如US5770619所述，据发现PDT通常能有效地破坏和损害新血管形成区域，同时无需将光敏剂靶向递送到目的区域。如US5798349所述，这可特别应用于治疗眼睛疾病，特别是老年黄斑变性。如US5756541所述，还已发现眼睛的光动力治疗能改善视力。如US5776966所述，已发现光动力治疗也能用于选择性地灭活一些白细胞，US5807881对此作了进一步描述。如US5368841所述，已发现当局部提供给患病关节时，光动力治疗还能用于治疗类风湿性关节炎。如第08/759318号US专利申请所述，使用光动力治疗能将移植排斥反应减到最少。
所有上述专利文件都引入本发明以作参考。
因此，已发现PDT能用于多个领域，包括治疗涉及新血管生成、炎症、和免疫反应的病症。然而，迄今为止，没有认识到PDT可预防以及治疗新血管生成。因此，现在已经发现，作为本发明的结果，PDT能用于在比现有技术所认为的阶段要早很多的阶段治疗与多余的新血管生成有关的病症。
本发明公开本发明基于下述发现在维持细胞生存能力的条件下，PDT能令人惊奇地抑制新血管形成，而不是破坏或损害已有的新血管。这使得PDT能用于比现有技术所认为有用的治疗要早的治疗方案中。因此，例如，可以在早很多的时期治疗老年黄斑变性(AMD)。
因此，一方面，本发明涉及在个体中抑制新血管形成的方法，所述方法包括给所述个体施用光敏化合物，用能被该光敏化合物吸收的一定波长的光照射个体中欲防止新血管形成的目标区域，由此抑制了该目标区域中的新血管形成，其中光敏剂的浓度和照射的时间以及强度使得其中新血管形成被阻止的组织保持生存能力。其中发现这种目标区域的特定指征包括预防AMD的脉络膜和形成血管瘤的潜在血管密集区域。该治疗还可用于防止虹膜、视网膜和角膜中的新血管形成。
附图简述附
图1显示的是分析小管形成的定制宏。
附图2是表明染料木黄酮对ECV304血管生成和存活力的影响的图。
附图3是表明治疗24小时后PDT对ECV304血管生成和存活力的影响的图。
实施本发明的方式本发明提供了基于下述发现的治疗方法在其中维持基础组织存活力的条件下，PDT抑制了新血管形成。
这一发现可用下述模型系统证实将内皮细胞、优选内皮细胞系的培养物在基质载体上以基本上二维方式培养，因此可直接观察小管形成。该基质载体一般包被有二维表面，并且把预培养的细胞铺在该基质上。优选的内皮细胞系是得自ATCC的人脐带静脉细胞系(ECV304)。能支持可观察的培养物和形成的小管的优选基质是Matrigel，其是从小鼠肉瘤提取的溶解的基膜制备物，并购自Becton-Dickinson(Bedford，MA)。然而，可使用能支持内皮细胞培养物和适当培养物的所有基质。例如，在支持生长和增殖中使用胶原凝胶载体是众所周知的。
这种模型系统的可用性及其在评价光动力治疗中的应用非常重要，这是因为可优化合适的方案以通过直接方式防止血管生成和维持存活力。代表欲治疗组织的细胞例如角膜、视网膜细胞、脉络膜、或者欲阻止其中的新血管生成的任何其它组织可用作测试组织。适合任何所需光敏剂的参数也可通过该方式得以证实。
本发明的优点是，可在其中欲防止形成新血管的组织的存活力得以维持的光动力治疗条件下防止新血管形成。因此，必须调整治疗条件以使得维持对组织的亚致死作用，同时获得阻碍新血管形成的效果。控制该结果的参数一般是光敏剂的性质和浓度、光敏剂所吸收的照射的强度、以及与照射强度一起决定所提供的总光能量的照射时间。当然，当提高光敏剂浓度、照射的强度和时间时，能获得更强的效果。降低一个或多个这些参数使得能提高余下的参数。
如上所述，有3个决定治疗致死性的基本参数—即决定是否能维持存活力的参数—药物剂量、能量强度(辐照度或积分通量率)和照射时间。在本申请中，积分通量率是以mW/cm2为计量单位，并且该值乘以时间所得乘积提供了以J/cm2为单位的能量。在设计方案时，一般仅考虑药物剂量和总的光能量，但是积分通量率可能也很重要。如果积分通量率太低，就不能持续激活光敏剂；如果积分通量率太高，就会发生过热损害作用。而且，在某些方案中，照射时间是受约束的，并且必须减至最小。在例如治疗AMD和再狭窄时，是这种情况。因此，在这些方案中，积分通量率将高过在另外情况下是可取的值。
对于特定目标组织，在本发明模型系统中可容易地获得相关参数的合适平衡。本发明模型系统一般如下所述进行运作将细胞铺在基质载体上，然后用适于所选特定细胞系的培养基维持。在用于测试方案前，将细胞与基质粘着适当时间。可在形成任何可见的毛细管状管(CLT)之前或者在CLT完全形成前的任意时间采用该方案。通常情况下，在约1—4小时后可观察到管开始形成，但是24或甚至48小时后小管的形成仍不完全。直接观察可足以对测试方案抑制CLT的能力进行定性评价，但是优选用可采用的计算机化技术定量评价方案的效果。可通过修正不规则的背景照明来提高影像质量，并且用画线工具测定毛细管状结构，然后用定制宏分析影像。宏的实例如附图4所示。
然后可用该模型测定任何方案。容易地进行抑制血管生成的化合物的单纯加入。更复杂的方案，例如PDT方案包括加入光敏剂与施以光。合适的对照包括加入染料木黄酮或任何其它已知的能抑制血管生成的化合物。
通过应用该模型系统，已发现光动力治疗能有效地抑制血管生成的发展和开始，同时不破坏基础组织。
“亚致死”光动力治疗是指治疗方案杀死低于约50％、优选低于40％、更优选低于25％所处理的细胞群。因此，组织或细胞“保持存活”的条件是指低于50％的细胞或包含在组织中的细胞被该治疗杀死。
合适的光敏剂包括卟啉基物质，例如卟菲尔钠、绿卟啉、二氢卟酚E6、血卟啉衍生物、酞菁、etiopurpurin、texaphrin等。特别优选的光敏剂是在例如上述参考文献US5171749中描述的称为BPD-MA的绿卟啉，以及分别在第09/088524和08/918840号US专利(二者引入本发明以作参考)中描述的称为EA6和B3的绿卟啉。优选的绿卟啉具有下述基本结构 其中R4是乙烯基或1-羟基乙基，且R1、R2和R3是H或烷基或取代烷基。
BPD-MA具有附图1所示结构，其中R1和R2是甲基，R4是乙烯基，其中一个R3是H，另一个R3是甲基。EA6是式2的化合物，其中R1和R2是甲基，并且两个R3均是2-羟基乙基(即乙二醇酯)。B3是式2的化合物，其中R1是甲基，R2是H，并且两个R3均是甲基。在EA6和B3中，R4也是乙烯基。
相关的式3和4化合物也是有用的；通常情况下，R4是乙烯基或1-羟基乙基，且R1、R2和R3是H或烷基或取代烷基。
可通过适于进行PDT的任何常规手段进行照射。在本发明模型系统中，一般是通过标准光源例如荧光灯泡简单地提供照射。为了治疗个体，光学纤维或其它更专门的传递工具是优选的。所选波长取决于所选的光敏化合物；从光敏剂的吸收光谱可清晰地看出什么样的光范围是合适的。该选择还取决于适宜光源的可利用性。
所提供的强度和能量水平还取决于所治疗病症的性质。光能量的水平一般为至少1J/cm2。可在可能导致副作用红斑的常用能量水平下进行光动力治疗，或者可以在被认为相当于环境光线的“低剂量”水平下进行光动力治疗。对于“常规”PDT，光积分通量一般在50—200J/cm2以上。然而，在“低剂量”水平下，光积分通量一般低于50—200J/cm2。合适的低剂量水平可通过实验确定出开始引起红斑症状的水平、然后将能量减至1/4—1/6该水平来确定。关于“低剂量”PDT的解释可参见例如第08/856921号US专利，将该文献引入本发明以作参考。简言之，低剂量PDT通常使用低于10J/cm2、优选低于5J/cm2、更优选1J/cm2或更低的能量。然而在本申请中，可能需要高一些的能量，例如在25J/cm2范围内的能量。在某些情况下，可以用非常低的照射水平以合适速率施加能量—100μW/cm2—5mW/cm2级的积分通量率。同样，在本申请中，对于亚致死PDT，可以使用稍低于50mW/cm2的较高强度。如上所述，为了维持存活力，可用合适的模型系统例如本申请描述的模型系统确定药物浓度、照射和时间之间的最佳平衡。然而，积分通量率和积分通量低于常规PDT所采用的。常规PDT采用较高的总能量和较高的积分通量—100—200J/cm2级的能量和200mW/cm2级的辐照度。当存活力不是所考虑的问题，例如在治疗肿瘤时，可使用常规PDT来防止新血管生成。
因为施用PDT能抑制毛细血管的形成，即抑制血管生成，所以其能用于预防和治疗特征为多余的血管生成的所有病症。这些适应征已总结在很多综述性文章中，包括PeppeR，M.S.，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology(1997)17605-619(该文献引入本发明以作参考)，和Folkman，J.等人，J.Biol.Chem(1992)26710931-10934；Folkman，J.，New England Journal ofMedicine(1995)3331757-1763；并且Guyer，D.R.等人在Seminars in Ophthalmology(1997)1210-13中回顾总结了抗血管生成药物在治疗黄斑变性中的应用。如Pepper在综述性文章中所述，防止血管生成可用于涉及专门医疗的多种适应征，包括预防和治疗血管畸形、心肌肥大、血管瘤、化脓性肉芽肿、卡波济氏肉瘤、神经胶质瘤、和增殖性视网膜病以及AMD。该方法还可用于阻止肿瘤中形成新血管，虽然在这些情况下，无需调节光敏化合物和照射的剂量水平来维持存活力。适于这些病症的合适治疗方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。
阻止新血管生成的主要应用是眼睛治疗领域。如US5798349中所提出的那样，传统的光动力治疗可用于闭合与老年黄斑变性(AMD)有关的新血管。本申请中描述的亚致死光动力治疗可用在脉络膜上的广泛区域以防止复发。
下述实施例举例说明但不是限制本发明。
实施例1染料木黄酮对小管形成的影响作为对照，为了证实本申请所用模型系统的有效性，和为了提供可确定不同光敏剂的参数的模型，在该分析中使用染料木黄酮—一种已知的血管生成抑制剂作为测试物。
如下所述制备用于该分析的内皮细胞用补充有下述成分的Medium 199(M199，Sigma)将人脐带静脉内皮细胞系ECV304(ATCC)在75cm2烧瓶(Falcon)中培养2mM1-谷氨酰胺(Gibco BRL)，1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)，100μg/ml链霉素(Gibco BRL)，20mM HEPES(Sigma)，和10％热灭活的胎牛血清(Gibco BRL)。将细胞在潮湿CO2(5％)室中于37℃维持，并且用0.05％胰蛋白酶/0.005％EDTA(GibcoBRL)以1∶4或1∶10的比例进行继代培养直至达到融合。
将Matrigel(Becton-Dickenson)在4℃融化2—3小时，然后以0.125或0.250ml/孔的量置于24-孔塑料板(Falcon)内。在加入细胞前，将凝胶聚合至少1小时。
为了进行分析，将ECV304细胞以3.5×104细胞/孔的浓度置于用Matrigel包被的24-孔板中。将细胞与用Matrigel包被的该平板粘着24小时，然后用最高达200μM的不同浓度的染料木黄酮处理。48小时后记录CLT显现的影像，转化成数字格式并用如附图1所示的Optima 6.1软件分析。用联接到Zeiss Axiovert-35显微镜上的Nikon照相机在亮视野照明下获得影像，并用Hewlett-Packard Scan-Jet 4C/T转化成数字格式。用分析软件Optima6.1定量确定CLT的总长度。48小时后，通过标准MTT分析评价存活力。抗血管生成活性和存活力的结果如表1和2所示，并在附图1中作图解。
结果表明，正如所预计的那样，浓度低至12.5μM的染料木黄酮基本上抑制了血管生成。此外，在高达约25—50μM的染料木黄酮浓度下，细胞的存活力基本上未受影响。
实施例2PDT对毛细管状小管形成的影响如下所述制备用于该分析的内皮细胞用补充有下述成分的Medium 199(M199，Sigma)将人脐带静脉内皮细胞系ECV304(ATCC)在75cm2烧瓶(Falcon)中培养2mM1-谷氨酰胺(Gibco BRL)，1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)，100μg/ml链霉素(Gibco BRL)，20mM HEPES(Sigma)，和10％热灭活的胎牛血清(Gibco BRL)。将细胞在潮湿CO2(5％)室中于37℃维持，并且用0.05％胰蛋白酶/0.005％EDTA(GibcoBRL)以1∶4或1∶10的比例进行继代培养直至达到融合。
将Matrigel(Becton-Dickenson)在4℃融化2—3小时，然后以0.125或0.250ml/孔的量置于24-孔塑料板(Falcon)内。在铺细胞前，将凝胶聚合至少1小时。
在处理前，将ECV304细胞(3.5×104细胞/孔)铺在孔中，以粘着、分化和建立毛细管状管(CLT)网。
将制成脂质体并以2.0mg/ml的浓度在无菌蒸馏水中重新配制的光敏化合物BPD-MA以不同浓度加入，并培养30分钟。用补充有血清的M199小心地洗涤该平板，然后暴露于由GE15TA-R荧光管提供的1.0J/cm荧红光(690nm)下。将该光稳定30分钟，然后用校准的IL-1400光计测定。用BPD-MA处理24小时后，如上所述用联接到ZeissAxiovert-35显微镜上的Nikon照相机在亮视野照明下获得CLT形成的照片。一旦用Hewlett-Packard Scan-Jet 4C/T将影像转化成数字格式，即用分析软件Optimus 6.1(Optimus Corp.)定量确定CLT的总长度。该软件如附图1所示。
还测定存活力。为了测定细胞存活力，按照制造商的说明，在37℃用0.1ml M199将包被有一薄层Matrigel的96-孔板重新处理至少1小时。将ECV304细胞(8×103细胞/孔)铺在各孔中，并培养24小时，然后如上所述进行光动力处理。处理大约24小时后，通过标准MTT分析评价存活力。抗血管生成活性和存活力的结果如表3和4所示，并在附图3中作图解。
如上所示，BPD-MA在200ng/ml的浓度基本上抑制了血管生成。然而，BPD-MA在25—100ng/ml的低浓度也抑制了血管生成，虽然在这些浓度下细胞存活力基本上未受影响。计算的LD50(提供50％细胞死亡的剂量)为140ng/ml，而阻止50％CLT形成所需的剂量约为50ng/ml(ID50＝50ng/ml)。
这些结果以图解形式显示在附图3中。是将存活力和血管生成指数对BPD-MA的浓度(ng/ml)绘图。实心的正方形代表存活力，实心菱形代表血管生成指数。从中可看出，在25—100ng/ml，对血管生成的影响远大于对存活力的影响。
权利要求
1.预防个体目标区域中新血管形成的方法，所述方法包括给需要所述预防的个体施用光敏剂；和用能被该光敏剂吸收的光以足够强度将所述个体中欲防止新血管形成的目标区域照射足够长时间，以抑制所述目标区域中的新血管形成，其中光敏剂的浓度以及照射的时间和强度使得其中新血管形成被阻止的组织保持生存能力。
2.权利要求1的方法，其中所述光敏剂是卟啉衍生物。
3.权利要求2的方法，其中所述卟啉衍生物是卟菲尔钠或绿卟啉。
4.权利要求3的方法，其中所述绿卟啉是BPD-MA、EA6或B3。
5.权利要求1的方法，其中所述照射的总能量低于50J/cm2。
6.权利要求1的方法，其中所述个体有患与眼睛新血管生成有关的病症的危险。
7.权利要求6的方法，其中所述个体有患AMD的危险。
8.预防个体目标区域中新血管形成的方法，所述方法包括用能被光敏剂吸收的光以足够能量将需要这种预防的个体中的所述目标区域照射足够长时间，以抑制所述目标区域中的新血管形成，其中已经将所述光敏剂施用给所述个体，并且光敏剂的浓度以及照射的时间和强度使得其中新血管形成被阻止的组织保持生存能力。
9.权利要求8的方法，其中所述光敏剂是卟啉衍生物。
10.权利要求9的方法，其中所述卟啉衍生物是卟菲尔钠或绿卟啉。
11.权利要求10的方法，其中所述绿卟啉是BPD-MA、EA6或B3。
12.权利要求8的方法，其中所述照射的能量低于50J/cm2。
13.权利要求8的方法，其中所述个体有患与眼睛新血管生成有关的病症的危险。
14.权利要求13的方法，其中所述个体有患AMD的危险。
15.确定能抑制目标组织中的血管生成同时维持目标组织存活力的方案的方法，所述方法包括在其中所述细胞形成小管的条件下提供基本上二维的代表所述组织的细胞培养物；培养一部分基质，并按照测试方案处理；在不采用测试方案的情况下培养另一部分基质；评价关于第一和第二部分基质的小管形成量，并比较所述各部分中的小管形成水平；和评价所述第一和第二部分的存活力，由此与在不采用测试方案的情况下培养的第二部分相比，按照测试方案处理的第一部分中的小管形成水平下降了，并且在第一部分中的存活细胞百分数是第二部分中存活细胞百分数的至少一半，确定出抑制血管生成、同时维持组织存活力的测试方案。
16.权利要求15的方法，其中所述支持基质是Matrigel。
全文摘要
本发明涉及抑制新血管形成、同时维持基础目标组织存活力的方法,包括给欲抑制血管生成的个体实施亚致死光动力治疗。本发明还涉及评价用于在特定目标组织抑制血管生成的亚致死PDT方案的模型。
文档编号A61N5/06GK1326362SQ99813315
公开日2001年12月12日 申请日期1999年10月8日 优先权日1998年10月9日
发明者P·M·C·马尔加朗, S·莱昂, A·M·里希特, J·G·利维 申请人:Qlt公司