治疗镰刀形红细胞贫血病及地中海贫血病的方法

专利名称：治疗镰刀形红细胞贫血病及地中海贫血病的方法
本申请要求1998年11月23日提交的临时申请60/109474的优先权。
本发明涉及医学，尤其是用蛋白C治疗镰刀形红细胞贫血病及地中海贫血病。
蛋白C是维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶和天然的抗凝剂，通常在凝血级联反应中作为抗凝剂使Va和VIIIa因子失活而在止血调节中发挥作用。人蛋白C作为一个双链酶原在体内循环，但其在内皮细胞及血小板细胞表面，经凝血酶有限的蛋白水解而转化为活化的蛋白C(aPC)，同细胞表面膜蛋白，凝血调节蛋白形成复合体而发挥作用。
aPC连同其他一些蛋白，可能作为血凝结的重要下游调节因子，防止血栓的形成。除了其抗凝作用外，aPC通过抑制细胞因子(如TNF和IL-1)的产生而具有抗炎症的功能，也可表现有利于血块溶解的血纤维蛋白溶酶的性质。因此蛋白C酶系统代表了一种抗凝血、抗炎症、血纤维蛋白溶解的主要生理机理。
镰刀形红细胞贫血病(SCD)和地中海贫血病为遗传性血红蛋白病，其特征在于血红蛋白结构上的缺陷。SCD包括导致血红细胞镰刀形化的疾病，包括镰刀形细胞贫血病(由于两种血红蛋白S基因而致)，镰刀形γ-地中海贫血病(一种血红蛋白S基因及一种γ-地中海贫血病基因而致)，血红蛋白SC疾病(一种血红蛋白S基因及一种血红蛋白C基因而致)，及稀有疾病，血红蛋白C哈莱姆病。地中海贫血病包括β-地中海贫血病和γ-地中海贫血病。这些遗传病具有明显的致病性和致死性，影响了非美后裔，及地中海，中东，东南亚后裔个体。这些病通常导致剧烈疼痛的部分原因是由于损坏的血红细胞经循环州系统阻碍血液自由流动而引起局部缺血。
由于镰刀形细胞的特定特征如异常的粘附性和缺乏膜磷脂不对称性参与了血栓形成的过程，因而SCD被认为是血栓形成前的状态，[Marfaing-Koka，et al.，Nouv Rev Fr Hamatol 35∶425-430，1993.]。SCD的大部分致病性似乎与微血管堵塞导致广泛的局部缺血和不可逆的器官损伤的现象相关。此外，对地中海贫血病病人的尸体解剖表明有44％的人有肺微血栓栓塞。[Chuansumrit et al.，J Med AssocThai，76(2)80-84，1993]。
研究人员运用敏感性分析凝血证明患有SCD的成年人存在有高凝血性状态导致血管堵塞的迹象。血管堵塞是包括了细胞的，血管的，体液的因子，可能还有凝血事件在内的复杂的过程。患SCD儿童并发症最严重的可能是中风的发生。[Peters，et al.，Thrombosis andHaemostasis 71(2)69-172，1994，Tam D.，Journal of ChildNeurology 12(1)19-21，1997]。
蛋白C的缺乏和凝血酶产生的增强在患SCD或地中海贫血病病人中已有报道[Karayalcin，et al.，The American Journal ofPediatric Hematology/Oncology 11(3)320-323 1989；Hazmi，etal.，Acta Haematol 90114-119，1993；Peters，1994]；[Shiraharaet al.Southeast Asian J Trop Med Pub Health 23(2)65-73]。SCD或地中海贫血病中低的蛋白C水平是由于其产量减少或者消耗增加。因此，SCD或地中海贫血病的病人中存在凝血的不平衡，不平衡的凝血反过来导致在这些病人中所观察到的不利的临床结果发生。
目前，尚无有效的治疗方法阻止与SCD或地中海贫血病相关的疼痛的产生或纠正其致病基因。目前的治疗方法包括葡萄糖和电解质静脉注射液，麻醉镇痛药，以及抗炎症试剂[Green et al.Americanjournal of Hematology 23317-321，1986]。近来，化学治疗试剂羟基脲被运用于越来越多的镰刀形红细胞贫血病病人中。更严重的病例或随后的局部缺血中风中，使用换血或骨髓移植。[Ferrera etal.Ammerican Journal of Emergency Medicine 15(7)671-679，1997]。预防性输血仅仅对于那些中风的SCD病人而言可以运用。因此，对于患SCD或地中海贫血病的病人而言，需要有一种安全有效的治疗方法。
本发明首次阐述了一种利用蛋白C治疗SCD和地中海贫血病的疗法。蛋白C具有抗凝血，抗炎症和血纤维蛋白溶酶活性，对发生于SCD和地中海贫血病病人中的高凝状态和蛋白C缺乏有治疗作用。
本发明提供了一种治疗镰刀形红细胞贫血病(SCD)或地中海贫血病病人的方法，包括给病人施用药学上有效量的蛋白C。
本发明进一步提供一种治疗镰刀形红细胞贫血病(SCD)或地中海贫血病病人方法，包括给病人施用药学上有效量的活化蛋白C，使活化蛋白C的血浆水平达到2ng/ml到300ng/ml。正如本发明所公开和要求保护的，为了本发明的目的，下面对一些术语进行定义。
蛋白C指维生素K依赖性丝氨酸蛋白水解酶，具有抗凝性，抗炎症，血纤维蛋白溶解活性，包括但不局限于，血浆来源的蛋白C和重组产生的蛋白C。尽管蛋白C也可指其他种或来源的蛋白C，其包括且尤其指具有蛋白C水解活性，酰胺水解活性，酯水解活性，和生物学活性(抗凝，血纤维蛋白溶解活性，抗炎症)的人蛋白C。蛋白C的来源实例在Gerlitz，et al.，美国专利No.5,453,373，和Foster，etal.，美国专利No.5,516,650,中有阐述，其所有的教导都在此引入以供参考。
酶原—一种蛋白水解酶的酶学不活化形式的前体。此处所用的蛋白C酶原，指分泌的蛋白C单链或双链不活化形式。
活化蛋白C或aPC指通过有限的蛋白水解被转化为其活化形式的蛋白C酶原。尽管aPC也包括其他种类或来源，其包括且尤其指具有蛋白C水解活性，酰胺水解活性，酯水解活性，和生物学活性(抗凝，血纤维蛋白溶解活性，抗炎症)的人蛋白C。蛋白C来源的实例在上述蛋白C的阐述中已有记录。
HPC-人蛋白C酶原。
rhPC-重组人蛋白C酶原。
r-aPC-重组人活化蛋白C酶原通过在体外活化r-hPC或直接将源于原核细胞，真核细胞，转基因动物或植物的蛋白C的活化形式分泌而获得，例如从人肾293细胞中以酶原形式分泌并通过本领域技术人员熟知的技术进行纯化及活化，这些技术在Yan，美国专利No.4,981,952，和Cottingham，WO97/20043中有阐述，其所有的教导都在此引入以供参考。
血浆来源的活化蛋白C—活化蛋白C的产生可以通过Eibl，美国专利No.5,478,558中所述活化血浆HPC而得，其所有的教导都在此引入以供参考。
连续注入—在一个特定的时间段内连续基本无间断地将一种溶液引入静脉。
药团注射—将一药物以特定剂量(称为药团)注射一段时间至大约120分钟。
适于给药—一种低压冻干制剂形式或适合于作为治疗试剂给药的溶液。
单位剂量形式—指适用于作为单位的剂量给予人体的物理上隔离的单位，每一单位包括已预先通过计算能产生所需治疗效果的活化物质的量，同合适的药学赋形剂联用。
药学上有效量一代表了可以抑制人脓毒症的本发明化合物的量。依据本发明，给药化合物的特定剂量自然要取决临床医师对特定病例的情况的评价。
本发明提供一种利用蛋白C治疗SCD和地中海贫血病的疗法。蛋白C具有抗凝血，抗炎症和血纤维蛋白溶酶活性，对发生于SCD和地中海贫血病病人中的高凝状态和蛋白C的缺乏有治疗作用。
本发明所用的蛋白C可以使用美国专利No.4,981,952，和美国专利No.5,550,036中阐述的任何方法进行生产和/或分离，在此引入作为参考。例如蛋白C生产方法包括分泌全长的可溶性蛋白C或源于一个细胞的蛋白C的生物学活性多肽变体。包括(a)构建一个包含编码蛋白C的DNA的载体；(b)以载体转染细胞；(c)在全长可溶性蛋白C或生物学活性蛋白C多肽变体被分泌的条件下，在培养基中培养所转化的细胞。此外，细胞为真核细胞，如；哺乳动物细胞诸如叙利亚仓鼠AV12细胞，人胚293细胞，或幼仓鼠肾细胞。
用于治疗SCD或地中海贫血病的蛋白C可以通过制备药学有效组分物的方法而制备。例如一种所需的制剂应为高纯度的包括填充剂如蔗糖，盐如氯化钠，缓冲液如柠檬酸钠，和蛋白C或aPC的稳定低压冷冻干燥产物。
蛋白C将通过非肠道方式注射适宜剂量如连续注入大约1小时到240小时，以确保其以有效的形式进入血液来给药。
本领域的技术人员可以轻易根据病人的用药情况和临床情况优化药学有效量，并控制包含蛋白C治疗组分物的给药方案。通常，蛋白C的给药量大约在5.0μg/kg/hr到250μg/kg/hr。优选地，用于治疗SCD的蛋白C为活化蛋白C(aPC)。aPC的给药量在1.0μg/kg/hr到96μg/kg/hr。更优选地，aPC的给药量在1.0μg/kg/hr到50μg/kg/hr。更优选地，aPC的给药量在大约1.0μg/kg/hr到35μg/kg/hr。更优选地，aPC的给药量为5.0μg/kg/hr到30μg/kg/hr。再优选地，aPC的给药量在15μg/kg/hr到30μg/kg/hr。再更优选地，aPC的量为20μg/kg/hr到30μg/kg/hr。合适的aPC的给药量为24μg/kg/hr。最适的aPC的给药量是48μg/kg/hr。合适aPC的给药量将导致与SCD相关的血栓并发症的减少。
由所给予的aPC量而得的血浆范围是大约2ng/ml到300ng/ml。优选的血浆范围为2ng/ml到200ng/ml，更优选的血浆范围在30ng/ml到150ng/ml且最适为100ng/ml。
aPC通过下述方法给药每小时注射1/3的合适剂量以药团注射，余下2/3的每小时剂量连续注入一小时，接着连续注入23小时合适的剂量，从而令24小时内以合适剂量给药。此外，药团注射通过静脉内袋状泵滴注或注射泵以正常速度的两倍进行15分钟，接下来1.5倍正常速度的速度进行45分钟。正常速度如已被证实每一时间段给予合适剂量水平的治疗试剂的速度，连续大约240小时。
本发明中所公布的蛋白C治疗SCD或地中海贫血病的用途提供一种潜在重症和虚弱失调的必要治疗方法。蛋白C的用途有效而且避免了诸如出血、毒性、和其他目前抗凝剂所广泛引起的并发症。
下列所提供的实施例仅为进一步说明本发明。本发明的范围不能仅仅被解释为由下述实施例组成。
制剂1人蛋白C制剂重组人蛋白C(r-HPC)从人肾293细胞中产生，所用技术为本领域技术人员所熟知，如在Yan，美国专利No.4,981,952中阐明的技术，其所有的教导都在此引入以供参考。编码人蛋白C的基因在Bang，etal.，美国专利No.4,775,624，中公开并要求保护，其所有的教导都在此引入以供参考。用于在人肾293细胞中表达的质粒为Bang，et al.，美国专利No.4,992,373，中公开的PLPC质粒。其所有的教导都在此引入以供参考。质粒PLPC的构建在欧洲专利公告PublicationNo.0,445,939.中及Ggrinnell，et al.，1987，Bio/Technology51189-1192中有所阐述。其所有的教导都在此引入以供参考。简言之，质粒转染293细胞，鉴定稳定的转化子，以无血清培养基继续培养，发酵之后，经微过滤得到无细胞培养基。
采用Yan，美国专利No.4,981,952中的技术将蛋白C从培养液中分离。澄清的培养基中加入4mM的EDTA，上阴离子交换树脂(Fast-FlowQ，Pharmacia)。以四倍柱体积的20mM Tris，200mM NaCl，pH7.4和两倍柱体积的20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4洗柱后，结合的人重组蛋白C以20mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH7.4洗脱，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，洗脱的蛋白纯度高于95％。
蛋白的进一步纯化，通过以下方法完成，包括以20mM Tris，3MNaCl，10mM CaCl2，pH7.4平衡疏水反应树脂(Toyopearl Phenyl650M，TosoHaas)，将蛋白与3M NaCl上柱，以两倍柱体积无CaCl2平衡液洗柱后，重组人蛋白C用20mM Tris，pH7.4洗脱。
去除残余的钙，制备用于活化的洗脱蛋白。重组人蛋白C经过一金属亲和层析柱(Chelex-100，Bio-Rad)去除钙，再结合于阴离子交换柱(Fast Flow Q，Pharmacia)。所有的柱子安排成一系列使用，并预先以20mM Tris，150mM NaCl，5mM EDTA，pH7.4平衡。蛋白上样后，Chelex-100柱也以一倍体积同样的缓冲液洗脱，然后再将其与一系列的柱子断开。阴离子交换柱以三倍体积的平衡缓冲液洗脱，然后以0.4M NaCl，20mM Tris-乙酸，pH6.5洗脱蛋白。重组人蛋白C和重组活化蛋白C溶液的蛋白浓度分别以280nm处的消光E0.1％＝1.8l或1.85进行计算。
制剂2重组人蛋白C的活化牛凝血酶在50mM HEPES，pH7.5，4℃的条件下，偶联于活化的CH-Sepharose 4B(Pharmacia)柱，偶联反应以每毫升树脂5000单位凝血酶的比例在已经装柱的树脂上进行。凝血酶溶液循环过柱3小时，然后加2-氨基-乙醇(MEA)于循环液至0.6ml/l循环液的浓度。含MEA的溶液继续循环10-12小时，以确保树脂上未反应的胺完全被封闭。封闭后，偶联凝血酶的树脂以10倍柱体积的1M NaCl，20mMTris，pH6.5洗脱，除去所有非特异性结合的蛋白，然后经活化缓冲液平衡后，用于活化反应。
纯化的r-hPC溶于5mM EDTA(螯合残留钙)，以20mM Tris，pH7.4或20mM Tris-乙酸，pH6.5稀释到2mg/ml，于37℃下通过已经由含有50mM NaCl及20mM Tris pH7.4或20mM Tris-乙酸pH6.5的溶液平衡的凝血酶柱，调节流出速度，使r-hPC与凝血酶树脂之间的接触时间大约为20分钟。收集流出物，立即进行酰胺水解活性分析。若所得材料与标准的蛋白C相比无特异的活性(酰胺水解)，将其再循环经过凝血酶柱，活化r-hPC，直到其具有活性。此步的进行需要将材料与上述20mM Tris，pH7.4或者6.5的缓冲液1∶1稀释，从而令蛋白C保持低浓度，等待下一步进行。
沥出的凝血酶从蛋白C材料中的去除是通过将蛋白C结合于已用含150mM NaCl的活化缓冲液(20mM Tris，pH7.4或20mM Tris-乙酸，pH6.5)平衡过的阴离子交换柱(Fast Flow Q，Pharmacia)完成的。此条件下，凝血酶不与阴离子交换树脂反应，而流经柱子进入样品应用流出物中。一旦蛋白C上柱，用2-6倍柱体积的20mM平衡缓冲液洗柱，然后以5mM Tris-乙酸，pH6.5或20mM Tris，pH7.4的溶液，0.4MNaCl梯度洗脱结合的蛋白C。更高柱体积的洗脱利于十二肽的完全去除。此柱的洗脱材料以冷冻溶液形式于-20℃保存，或以低压冷冻干粉形式保存。
活化蛋白C的抗凝活性通过测量在(APTT)凝块分析中凝结时间的延长而确定。以稀释缓冲液(1mg/ml放射免疫分析级牛血清白蛋白，[BSA]，20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.02％NaN3)稀释蛋白C至浓度125-1000ng/ml，制备标准曲线，样品也经几次稀释落于此浓度范围。每一样品的试管中，加入50μl马血浆，50μl(ATPP试剂，Sigma)，37℃温育5分钟。然后加入50μl的样品或标准。稀释缓冲液用于取代样品或标准决定基本的凝结时间。每一试管中加入50ul，37℃，30mM的CaCl2后，立即开启fibrometer(CoA ScreenerHemostasis Analyzer，American Labor)计时器计时。样品中活化蛋白C浓度通过标准曲线的线性回归方程而计算。此处报道的结块时间，包括标准曲线，是三次重复实验的平均值。
上述说明使本领域中具有适宜技术的人员能够制备蛋白C，用于镰刀形贫血病的治疗。
制剂3活化蛋白C制剂活化蛋白C稳定的低压冷冻干燥形式的制备过程包括低压冷冻干燥包含2.5mg/ml活化蛋白C，约15mg/ml的蔗糖，约20mg/ml的NaCl，和pH值大于5.5小于6.5的柠檬酸钠缓冲液的溶液。此外，活化蛋白C的稳定低压冷冻干燥形式还包括低压冷冻干燥包含5mg/ml活化蛋白C，30mg/ml蔗糖，约38mg/ml NaCl，和pH值大于5.5小于6.5的柠檬酸钠的溶液。
蛋白C∶盐∶填充剂(w∶w∶w)的比例在冷冻干燥过程中是一个重要的因素。此比例随蛋白C的浓度，所选择的盐及其浓度，所选择的填充剂及其浓度而定。尤其是优选选择1份活化蛋白C，7.6份盐，6份填充剂的比例。
适用于连续注入给药的活化蛋白C的单位剂量制剂通过混合活化蛋白C，NaCl，蔗糖和柠檬酸钠缓冲液而制备。混合后，4ml溶液转移到一个单位剂量的容器并低压冷冻干燥。单位剂量的容器容纳5mg到20mg的活化蛋白C，适于给需要其的病人以0.01mg/kg/hr到0.05mg/kg/hr的剂量给药，封口贮藏直到使用。
实施例1患镰刀形贫血病(SCD)的病人重组人蛋白C(r-aPC)的空白对照的双盲试验研究镰刀形贫血病(SCD)病人的剧烈疼痛表明其存在有血小板生存异常和聚集及凝血因子的变化。微循环血管堵塞是纯合SCD致病的主要特征。血管堵塞的过程是多因素的，而凝血失调是最可能的原因。
目前治疗SCD病人的方法包括静脉内注射液葡萄糖和电解质，麻醉镇痛药和/或抗炎症试剂，更严重的病例或局部缺血中风采用换血和骨髓移植。
本试验旨在表明r-aPC的注入导致患纯合SCD病人中疼痛减轻及局部缺血中风事件减少的联合终点的显著下降。
入送标准包括所研究儿童和年青成人中的纯合镰刀形红细胞贫血病病人，这些病人在医院收治48小时内进入本试验且具有明显的疼痛症状。
符合入送标准的病人被给与静脉内葡萄糖及电解质和麻醉镇痛药，此外，病人也接受对照或者r-aPC96小时，r-aPC以24μg/kg/hr的剂量给药。
r-aPC的安全性及有效性与对照相比，研究的第一终点为疼痛的减轻/消失，第二个终点为患SCD病人的局补缺血中风的减轻/消失。
权利要求
1.一种治疗镰刀形红细胞贫血病(SCD)或地中海贫血病病人的方法，包括给所说病人施用药学上有效量的蛋白C。
2.权利要求1的方法，其中的蛋白C指人蛋白C酶原。
3.权利要求1的方法，其中的蛋白C指人活化蛋白C。
4.权利要求3的方法，其中的人活化蛋白C的量为大约1μg/kg/hr到96μg/kg/hr。
5.权利要求4的方法，其中的人活化蛋白C经连续注入大约1到240小时而给药。
6.一种治疗镰刀形红细胞贫血病或地中海贫血病的方法，包括给于病人以药学上有效量的活化蛋白C，使活化蛋白C的血浆水平达到大约2ng/ml到300ng/ml。
7.权利要求6的方法，其中的活化蛋白C以药团注射方式给药。
8.权利要求6的方法，其中的活化蛋白C以连续输注大约1到240小时的方式给药。
9.权利要求6的方法，其中的活化蛋白C先通过药团注射给药，然后再连续输注给药。
10.权利要求9的方法，其中为使血浆中蛋白C的水平达到大约2ng/ml到300ng/ml，1/3的活化蛋白C以药团注射方式给药，而后通过连续输注施用剩余2/3的活化蛋白C。
全文摘要
本发明提供一种用蛋白C治疗镰刀形红细胞贫血病及地中海贫血病的方法。申请专利的发明为潜在的重症和虚弱失调提供一种能够避免诸如出血、毒性、及现有的抗凝血剂所广泛产生的并发症的必要疗法。
文档编号A61P7/06GK1326357SQ99813350
公开日2001年12月12日 申请日期1999年11月16日 优先权日1998年11月23日
发明者S·L·乌姆, S·C·B·颜, B·G·乌特尔巴克 申请人:伊莱利利公司