专利名称：系统性病毒/配体基因输送系统和基因治疗的制作方法
背景技术：
技术领域：
本发明涉及对基因转移和基因治疗技术的改良。本发明尤其提供了在体内和体外将核酸经病毒定向输送至人和其它动物的特异器官、组织或肿瘤中的组合物及方法。使用本发明输送治疗性基因例如wtp53，可提高对常规放疗和化疗的敏感性。
2、背景技术用病毒载体输送基因和基因治疗已经进行研究。癌症基因治疗中的长期目的是一个系统性输送系统，其选择性定向于肿瘤细胞，包括转移的癌细胞。核酸可以经病毒载体导入细胞，以对那些细胞产生所需的治疗作用。例如，可以导入基因以置换干扰细胞功能的有缺陷的基因，例如p53。核酸也可导入细胞中以在宿主动物体内产生所需的治疗作用，例如免疫接种，免疫治疗，或反义表达。
通过病毒将其核酸转移到宿主细胞所用的进入细胞的机制，已开发了病毒载体。用此策略已经构建了重组逆转录病毒和腺病毒载体，以在体内和体外转移基因。已用于临床治疗的几乎80％的基因治疗方案都利用病毒载体(Wivel和Wilson，1998)。腺病毒载体对一些基因治疗方式有利，因为它们能进入未分化的细胞并携带相对较大(78kb)的外源DNA(Berkner，1988)。另外，腺病毒颗粒可以滴度高于1011PFU/ml纯化和生产(Wivcl和Wilson，1998)。然而，这些系统的一个缺点是病毒的细胞嗜性受限，且目前用于临床治疗癌症的任何治疗性病毒中，定向病毒颗粒这一主要问题还未解决。因此已研究并持续进行探求改变基因嗜性的方法。
现已阐述了一种通过双功能缀合物改变逆转录病毒嗜性的系统(Roux等，1989)。此双功能缀合物含有一个抗病毒衣壳的抗体，和一个抗靶细胞特异细胞膜标记的抗体。
Groud等(1988)阐述了由两个单克隆抗体(MAbs)组成的双功能缀合物。此MAbs抗Moloney逆转录病毒的gp70衣壳蛋白和人运铁蛋白受体。这些缀合物使逆转录病毒侵入本来不能进入的靶细胞。
WO92/06180(Wu等，1992)阐述了一种改变病毒嗜性的方法，该方法是将具有与靶细胞表面受体结合的分子提供给病毒表面，产生与具有细胞表面受体的细胞有特异性的病毒。在该发明中，逆转录病毒或乙型肝炎病毒是用与脱唾液酸糖蛋白受体结合的碳水化合物分子化学修饰的。Wu等只揭示了将外源基因导入细胞的体外方法。
腺病毒载体对一些基因治疗方式有利，因为它们能进入未分化的细胞，并能携带大约8kb的外源DNA序列，腺病毒颗粒可以高于1011pFUs/ml滴度纯化及生产。
使用重组腺病毒的一个问题是其定向特异细胞类型的受限制性。许多研究已经报道用具有DNA复合物的非重组腺病毒经受体介导的胞吞作用转移基因，腺病毒提供释放内体成分的能力(Cotton等，1992；Wagner等，1992。)。这些方法是用运铁蛋白－聚赖氨酸/DNA复合物来内在化结合或未结合的腺病毒。Wagner等(1992)修饰了一种腺病毒载体，其通过与聚赖氨酸缀合，并将其与运铁蛋白－聚赖氨酸/DNA的缀合物复合，产生三元的运铁蛋白－聚赖氨酸/腺病毒－聚赖氨酸/DNA复合物。一种相似的定向方法是利用在许多类型肿瘤中，运铁蛋白受体(TfR)增加这一事实，将运铁蛋白(Tf)与腺病毒颗粒连接起来(Miyamoto，等，1994；Baselga和Mendelsohn，1994)。Schwarzenberger等(1997)阐述了分子缀合物载体(MCVs)。MCVs是通过将含有相应基因的质粒与聚赖氨酸(PL)凝聚起来而构建的，PL与复制功能不全的腺病毒(内体化因子)连接，而且PL与链霉亲和素连接以用生物素酰化的配体定向。然而，现已报道(Cotton等，1992；Wagner等，1992；Schwarzenberger等，1997)目前共价偶联Tf与腺病毒的方法，或产生Tf－聚赖氨酸－腺病毒缀合物的方法通常导致感染性降低，可能是由于产生Tf-修饰的病毒所需的苛刻条件所致。
另一种方案必需将中性化的抗纤维或抗结(knob)单克隆抗体的Fab片段与配体如叶酸或FGF2交联(Rogers等，1997；Douglas等，1996)。与嵌合的Fab-配体复合的腺病毒载体在肿瘤定位方面已显示出一些优势，并与天然腺病毒相比较呈现在体内对肝的毒性降低。
Curiel等(美国专利No.5521291和No.5547932)阐述了多重腺病毒－聚阳离子缀合物，以将核酸内在化引入真核细胞。这些缀合物中有一些使用运铁蛋白作为内在化因子，运铁蛋白与对核酸有亲和性的物质结合。
Cotton等(美国专利5693509)公开了报道能有效穿透进入正常情况下它们不能穿透的细胞而同时保持其基因表达和/或其内体化性质的腺病毒。运铁蛋白与腺病毒共价结合，从而它们可进行受体介导的内吞作用。该方法将运铁蛋白氧化成在碳水化合物基元含有醛基的形式，并将氧化的运铁蛋白与腺病毒在还原条件下偶联。还揭示了这不可预测修饰后感染性是否保留。
Low等(美国专利No.5108921,No.5416016和No.5635382)揭示了用配体如叶酸，生物素，硫胺素及它们的类似物，增强外源分子跨膜转运的方法。此方法还使用能结合配体受体的抗独特型抗体或其它分子。所揭示的其它配体包括烟酸，泛酸，核黄素，吡哆醛和抗坏血酸。
Xu等(1997)和Xu等(1999)发现在阳离子脂质体中加入Tf能明显提高脂质体在体内和体外输送外源基因包括p53基因的能力。更明显的是它们高选择性地定向于作为异种移植物在裸鼠中生长的多种人体肿瘤细胞。
本文所用的举例说明本发明背景或提供额外关于实践的论述的文献和其它材料均并入参考，并且为方便起见在后附的参考文献表中列出。
发明概述本发明提供了将病毒载体给予靶细胞以用于例如进行病毒介导的基因输送的改良方法。
本发明一方面提供了一种组合物，其包含一种能输送核酸或其它感兴趣治疗性分子的病毒载体，和一种能实现或增强病毒载体与靶细胞结合或嗜性的配体的混合物。所述生产此混合物的方法避免了否则可能通过苛刻的化学加工而产生的病毒颗粒的灭活。该混合物是以简便方式制备的，并适于系统性(例如口服)施用于病人。
本发明另一方面提供了一种系统性在体内将前述混合物施用于人体或其它动物，以完成定向输送病毒颗粒的内容物的方法。
本发明另一方面是使用本发明输送治疗性基因－野生型p53引起对放疗和化疗制剂的敏感作用。
附图简述
图1在用携带LacZ基因的Tf定向的腺病毒载体感染后，JSQ－3细胞中β－半乳糖苷酶报道基因的表达。将5×104个JSQ－3细胞/孔铺板于24孔平板中。24小时后，用无血清的EMEM冲洗1次，并在每个孔中加入0.3ml无血清或抗生素的EMEM。在双份孔中加入在200μlEMEM中的含有运铁蛋白和病毒的不同比例的Ad5LacZ或Tf-Ad5LacZ复合物。所用比例是5×102至5×105Tf分子/病毒颗粒。病毒与细胞的比例是500和1000个病毒颗粒/细胞(pt/细胞)。在通过每2分钟将试管转动混合一次，在37℃，5％CO2条件下培养4小时后，将含有20％血清的0.5mlEMEM加入孔中。培养二天后，将细胞用PBS冲洗一次，并在1×报道物裂解缓冲液(Promega)中裂解。细胞裂解物用100μl的在含有1mM MgCl2和450μMβ－巯基乙醇的20mM Tris(pH7.5)中的150μMO-硝基苯基－β－半乳糖吡喃糖苷在37℃处理30分钟。加入150μl/孔的1M Na2CO3中止反应，并在405nm测定吸光度。纯化的β－半乳糖苷酶用于产生标准曲线。结果以每毫克总蛋白的β－半乳糖苷酶当量的毫单位(mU)表示。
图2A－F在小鼠异种移植模型中，Tf定向的腺病毒系统性输送β－半乳糖苷酶报道基因的组织化学分析。携带DU145异种移植肿瘤的无胸腺裸鼠用Tf-AdLacZ静脉注射一次。注射3天后，处死动物，切下肿瘤组织和正常组织，并用X－gal染色。图2A示出用Tf-Adp53以1.5×105Tf分子/病毒颗粒的比例系统性处理的动物的肿瘤。图2B示出相应于图2A的肝脏。图2C示出用Tf-Adp53以2.9×105Tf分子/病毒颗粒的比例系统性处理的动物的肿瘤。图2D示出相应于图2C的肝脏。图2E示出用Tf-Adp53以5.8×105Tf分子/病毒颗粒的比例系统性处理的动物的肿瘤。图2F示出相应于图2E的肝脏。比例尺50μm。
图3在静脉注射Tf-Adp53后，DU145异种移植肿瘤中外源wtp53的表达。携带DU145异种移植肿瘤的无胸腺裸鼠用Tf-Adp53或未定向的Adp53静脉注射。48小时后处死动物，切下肿瘤组织和正常组织，并将分离的蛋白质进行Western印迹分析。将分离自未处理鼠的肿瘤和器官，以及亲代的DU145细胞的蛋白质作对照。每条泳道加样这些样本的每一样本的100μg总蛋白。也包括在体外用Adp53感染的DU145细胞的2.5μg总蛋白。p53蛋白条带用单克隆抗－p53抗体Ab-2和ECL Westem印迹试剂盒检测。条带1＝外源人wtp53；条带2＝内源人DU145p53；条带3＝内源小鼠p53。
图4系统性输送的定向于肿瘤的腺病毒－p53及放射治疗对JSQ－3异种移植肿瘤体内的组合效果。Tf-Adp53以1×105Tf分子/病毒颗粒的比例产生。将1×1010病毒颗粒/小鼠/注射(等于3×108Pfu)的Tf-Adp53或未定向的Adp53，注射入携带100－200mm3JSQ－3异种移植肿瘤的无胸腺裸鼠的尾静脉中。从首次静脉注射之后的那天开始，将30Gy离子化辐射物以每天2Gy分剂量在肿瘤位置施用于动物。在停止治疗8个月后观测到在接受组合治疗的动物中没有肿瘤再生长。由于误差太小以至于观测不到，在Tf-Adp53(+)放射组中未表示误差杆。杆代表治疗持续时间(大约3周)。根据Georgetown大学关于照顾和使用实验动物的研究指南进行所有动物试验。
图5A－H通过系统性输送的定向于肿瘤的腺病毒－p53，B16小鼠肺转移癌对顺铂(CDDP)的化学敏感性。转移癌是在正常有性生殖的C57/B1/6小鼠中通过静脉内注射1×105个细胞诱导的。4天后开始治疗。Tf－Adp53和对照Tf－AdLacZ以1.5×105Tf分子/病毒颗粒产生。1×1010病毒颗粒/鼠/注射(等于3×108pfu)的Adp53，Tf－Adp53或Tf－AdLacZ每周注射3次，总共进行12－13剂。CDDP每2－4天腹膜内注射3－5mg/kg，共进行8－13剂。在治疗一个周期后从动物体切下肺。动物的肺用以下方式处理未处理(图5A和5E)；只用CDDP(图5B)；用未定向的Ad－p53加上CDDP(图5C)；Tf-LacZ加上CDDP(图5F)；只用Tf－Adp53(图5G)；Tf-Adp53加上CDDP(图5D和5H)。
图6系统性输送的定向于肿瘤的腺病毒-p53和化疗对MDA－MB－435异种移植肿瘤体内的组合效果。
图7β－半乳糖苷酶在肿瘤内注射的DU145细胞中的表达，该细胞是用具有LacZ的未定向的腺病毒或者用具有LacZ的运铁蛋白定向的腺病毒注射的。
发明详述缺失wtp53的小鼠的正常发育及表达p53的细胞在照射后G1阻断的观察可推测wtp53在DNA损伤破坏或应激后对于细胞调节有功能，而不是在增殖和发育期间有功能。由于看起来许多常规抗癌治疗(化疗及放疗)诱导DNA损伤，并呈现通过诱导编程性细胞死亡而进行工作，因此p53途径中的改变认为可导致治疗失败。
wtp53功能的缺失也与辐射抗性增加相关。已发现存在mtp53及随之缺失G1阻断与一些人体肿瘤及细胞系中辐射抗性增加相关。这些包括代表头、颈、淋巴、膀胱、乳腺、甲状腺、卵巢和脑癌的人体肿瘤细胞系。
基于这些认识，在肿瘤细胞中恢复wtp53功能的基因疗法应再建立p53依赖性细胞周期关卡和编程性细胞死亡途径，从而引起抗化疗/放疗表型的逆转。与此模型一致，与编程性细胞死亡一起，化学敏感性通过在携带mtp53的非小细胞肺癌鼠异种移植物中表达wtp53而恢复。涉及无效p53肺肿瘤细胞系H1299和T98G成胶质细胞瘤细胞的异种移植物的化学敏感性，以及WiDr结肠癌异种移植物对顺铂的敏感性已经证实。阿霉素或丝裂霉素对细胞的杀伤力提高也见于经腺病毒转导wtp53的SK－Br-3乳腺肿瘤细胞中。然而，一些相互矛盾的报道指出p53表达与化学抗性之间的关系可能有一种组织或细胞特异性成分。经腺病毒载体转染wtp53也已示出致敏卵巢和近直肠结肠肿瘤细胞对放射物的敏感性。还已报道腺病毒介导的wtp53的输送在辐射抗性的头和颈部鳞状细胞癌(SCCHN)肿瘤系中恢复编程性细胞死亡的功能，引起这些细胞在体外的辐射敏感性。更明显地，组合肿瘤内注射经腺病毒输送的wtp53和放射疗法可导致建立的SCCHN异种移植肿瘤完全且长期退化。
本发明不同于通常使用的输送基因疗法的治疗性分子的肿瘤内注射未定向的病毒载体或系统性输送未定向的载体，例如由Roth等所揭示(美国专利No.5747469)。
本文所示数据证实这种复合物在体内和体外对原发和转移肿瘤细胞均有特异定向及使之对放射疗法和/或化学疗法敏感的超级能力(由于wtp53基因的表达)。
本发明满足了系统地输送对靶细胞有高度特异性及高效的治疗分子的需要。当系统地施用时，此输送系统能达到且特异地定向于转移癌和原发癌，当靶细胞是人体癌细胞时。由于通过此系统正常输送野生型肿瘤阻抑物基因p53的结果，本发明人证实肿瘤被敏化而对放疗和/或化疗是敏感的。此系统的高效转染引起这种高度敏化，从而不仅是癌症生长被抑制，而且延续一段时期能完全消除原发肿瘤和转移癌。
本发明的特异实施方案提供了药物可接受组合物，其包含能输送核酸至靶宿主细胞的运铁蛋白配体和病毒载体颗粒的混合物。在适当的载体中简单地混合病毒载体(如逆转录病毒或腺病毒载体)与定向于细胞的配体，如在无菌注射用水中混合，相比于只用病毒载体能提高转染效果。例如，病毒载体和运铁蛋白的简单混合物提高表达运铁蛋白受体的细胞的转染，如人癌细胞。
使用运铁蛋白对将基因转移至，或用基因治疗各种人类癌症尤为有利，各种人癌细胞均含有运铁蛋白受体。本发明的混合物中存在运铁蛋白使病毒载体有效且特异地定向于那些癌细胞。
其它配体如蛋白质，肽，激素，抗体及抗体片段可用于特异地将病毒载体定向于含有这种配体的受体的细胞，或能通过受体介导的胞吞作用将配体内在化的细胞。配体例如可以是增强病毒载体与靶细胞结合的天然或重组蛋白质。配体例如包括胰岛素，毒素，EGF，VEGF，FGF，IGF，heregulin，其它病毒或细菌蛋白，雌激素和孕酮。
尽管本发明涵盖了使用一种定向于细胞的配体，此配体是当其与另一种类型病毒混合时在第一种类型病毒上天然发生的；但本发明不涵盖使用与编码其的病毒天然结合的定向于细胞的配体。当配体以高于在天然发生的病毒中发现的正常量存在时，本发明不包括由病毒编码的定向于细胞的配体与编码所述配体的病毒类型的混合物。
在配体和病毒颗粒之间形成复合物的方法是将大量配体分子包被在病毒颗粒的表面，并提高其穿经血流时的稳定性。另外，表面上的大量配体分子还可通过封闭病毒抗原而降低病毒的免疫原性。
本发明包括使用重组表达病毒。根据本发明可以使用病毒载体如重组腺病毒，AAV载体(美国专利No.5139941)，逆转录病毒载体，单纯疱疹病毒(美国专利No.5288641)，巨细胞病毒(CMV)，痘苗病毒，禽痘病毒(FPV)，牛痘病毒(CPV)(美国专利No.5833975，No.5762938，和No.5378457)，新培斯病毒，嵌合或杂种病毒等。根据本发明也可使用能复制的或肿瘤消解病毒。
本发明还提供了制备病毒载体－运铁蛋白混合物的方法，这种方法避免了以前所用的使用Mabs，接头，聚赖氨酸等将运铁蛋白与病毒载体连接起来的方法中所述的苛刻的化学品及复杂步骤。
根据本发明，配体－病毒混合物可在任何载体(典型地为水溶液载体)中制备，以提供适于体内或体外施用的药物组合物。此组合物典型地缓冲至适当的pH值，并可含有适当的辅助成分如渗透性调节剂，抗生素等。
混合物中使用的并最终用于宿主动物(或体外施用于细胞)的病毒颗粒的数量，本领域技术人员基于熟知的科技文献中所述的基因转移和基因治疗原理可以确定。本发明的混合物通过类似于以前所述的施用病毒载体的方法施用，以在体外或体内进行基因转移或基因治疗。本发明通过提供系统性施用病毒载体的组合物及方法而改良了现有技术。优选非肠道施用此混合物(尤其静脉内或动脉内施用)。在一些情况中期望可以施用实际上较低剂量(例如30倍)的病毒颗粒，这是通过本发明所带来的改良的效果所致。或者，在其它情况中可使用已知引起遗传性转移增加的已知剂量。组合物中病毒颗粒，配体和辅助成分的浓度也将适当选择。
本发明的特异实施方案提供了联合放疗和/或化疗使用本发明的组合物。
本发明非限于任何特殊的病毒载体，或施用配体－病毒载体混合物组合物的任何特殊途径或模式。所需的总剂量可经试验确定，并可以单一或多重施用方式提供给需要基因治疗的患者。
实施例中的数据表明Tf-腺病毒复合物在肿瘤中能产生比用未定向的腺病毒载体所产生的明显增加的基因表达水平。本发明所述的基因输送方法基于产生Tf定向的病毒的相对简便的方法。偶联是非共价的，且并不包含能产生非所需的且也许是毒性的副产物的化学反应，而且避免了以前使用Mabs，接头，聚赖氨酸等连接Tf与病毒载体的方法中所述的苛刻的化学缀合及复杂的加工步骤。这些经化学修饰的病毒不可避免地使病毒感染性较低，且能产生可能太大以至于不能侵入肿瘤毛细管的凝聚体。尽管肿瘤内注射的病毒基因治疗载体包括肿瘤消解病毒用于临床治疗，但是目前还没有非共价修饰的定向的病毒用于临床研究。
尽管显而易见的是单一p53制剂的基因疗法不能明显地完全长期消除肿瘤，但是本发明所述的组合Tf定向的腺病毒与常规的放疗/化疗不仅能抑制肿瘤生长，还能退化肿瘤，证实有协同作用。
本发明所述的体内研究证实组合系统性的Tf-Adp53基因治疗与常规的放疗和/或化疗，比任何一种单一疗法收效更为明显。在临床中，用于肉眼可见肿瘤的65－75Gy的放射物剂量和用于显微镜下所见疾病的45－50Gy的放射物剂量通常用于治疗头颈部癌症。考虑到与高剂量放疗或化疗药物及肿瘤敏感性相关的已知副作用，以用较低的常规治疗有效量进行临床治疗是大有好处的。另外，在放疗的情况中，系统性地恢复wtp53的功能，引起放疗剂量降低，发现可有效地进一步治疗性地防止肿瘤再生。
肿瘤对化疗和放疗的敏感性将提高目前治疗方式的功效。另外，还存在以这二种常规抗癌方式较少的必需剂量特异组合治疗肿瘤的潜力，从而减少通常与这些治疗方式相关的副作用。在实施例中所述的体内研究中，系统性施用Tf-Adp53组合放疗，用少如3×108pfu的病毒可完全及长期退化肿瘤。此剂量几乎等于Kataoka等(1998)所用的未定向的Adhp53和2－Me的剂量，在该研究中观测到部分肿瘤生长抑制(在肺集落计数中有三分之二的降低)。
尽管此系统可以很好地消除肿瘤内注射基因治疗载体的需要，但在易于转移的癌症的情况中，还应使用系统性及肿瘤内注射治疗。此系统还适于辅助输送其它癌症疗法。例如，目前的Onyx的肿瘤消解病毒不支持系统性输送。ONYX－015是一个遗传性修饰的腺病毒，其在缺少wtp53肿瘤阻抑物活性的肿瘤细胞(“p53缺陷细胞”)中有效复制并杀死肿瘤细胞，在正常细胞中则不。此特异修饰的病毒在正常细胞中不能有效复制。对ONYX－015的临床研究目前进行的是头颈部癌症，膀胱癌和卵巢癌的研究(Heise等，1997；Hall等，1998；Linke，1998；Kim等，1998)。我们将病毒定向于肿瘤的能力可明显改善其它基于病毒的癌症疗法如ONYX－015的效果。
最明显的是系统性施用方法意味着治疗性基因可到达原发肿瘤及远隔的转移癌。这与用肿瘤内注射完全不同。本发明所述方法可适于定向任何存在的重组病毒。而且还不依赖于待输送的基因。另外，如上所述此系统还可使用肿瘤消解病毒。使用Tf来定向对于用p53基因疗法治疗人癌症尤其有吸引力，因为许多种类癌症表达增高水平的TfR，且50％以上的癌症中，p53基因已不能复制。因此，这些发现表明本发明的Tf定向的腺病毒输送系统作为新的更有效的基因治疗癌症形式的临床潜力，这将有助于履行在抗癌战役中最初许下的基因疗法的诺言。
特别地，本发明的实施方案如以下实施例提供。
实施例1运铁蛋白增强腺病毒转导效率A.制备运铁蛋白－腺病毒混合物。
将全运铁蛋白(Tf.铁饱合的，Sigma)以5mg/ml溶解于无菌水中。将称为Ad5LacZ血清型5复制缺陷腺病毒(Ad5CMVntbeta-gal，Gene Transfer Vector Core，University ofIowa)，以在含有3％蔗糖的PBS中1.1×1012个颗粒(pt)/ml(其含有5.5×109噬斑形成单位，pfu/ml)的浓度进行研究，该Ad5LaZ含有在CMV启动子控制下的大肠杆菌LacZ基因。Tf首先用10mM HEPES缓冲液稀释为0.5mg/ml，pH7.4，然后将Tf加入10倍连续稀释的50μl HEPES缓冲液中。然后将Ad5LacZ加入试管中使Tf与病毒的比例在1×102至1×106个Tf分子/病毒颗粒范围内。将试管在室温摇动培养10－15分钟(每2分钟摇动一次)，然后在每个试管中加入150μl无血清的EMEM。
B.用腺病毒/Tf混合物的体外转导我们使用的是称为AdLacZ的血清型5复制缺陷腺病毒(含有在CMV启动子控制下的大肠杆菌LacZ基因)和此病毒的Tf修饰形式(Tf-AdLacZ)。为使TfAdLacZ输送基因的能力最佳化，用以Tf与病毒及病毒颗粒与细胞的不同比例产生的AdLacZ或Tf-AdLacZ感染(Bischoff等，1996)衍生自人头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)的培养的细胞系JSQ－3(Weichselbaum等，1988)。
将5×104JSQ－3细胞/孔铺板于24孔平板中。24小时后用无血清的EMEM将细胞冲洗一次，向每个孔中加入0.3ml无血清或抗生素的EMEM。将在200μl EMEM中不同运铁蛋白与病毒比例的Ad5LacZ或Tf-Ad5LacZ复合物加入双份孔中。病毒与细胞的比例在20～2000病毒颗粒/细胞(pt/细胞)。在37℃，5％CO2摇动培养4小时后，向孔中加入含有20％血清的0.5ml EMEM。培养2天后，将细胞用PBS冲洗一次，并在1X报道裂解缓冲液(Promega)中裂解。细胞裂解物用100μl的在含有1mM MgCl2和450μM β－巯基乙醇的20mM Tris(pH7.5)中的150μM O－硝基苯－β－半乳糖吡喃糖苷在37℃处理30分钟。加入150μl/孔的1M Na2CO3终止反应。在405nm测吸光度。纯化的β－半乳糖苷酶(Boehringer)用于产生标准曲线。结果以每mg总蛋白β－半乳糖苷酶当量的毫单位表示。
C.组织化学染色为进行Tf-Ad5LacZ转导的组织化学研究，用如上所述转染溶液将24孔平板中60％铺满的细胞转染5小时。在另外培养2天后，固定细胞并用X－gal染色(Xu等，1997)。转染效果以蓝染的细胞的百分比计算。
D.结果与讨论在Tf与病毒或病毒与细胞的一定比例下，用Tf-AdLacZ的表达比用未定向的AdLacZ的表达高3～4倍(见图1)。在病毒剂量为500pt/细胞或2.5MOI(感染复数，或pfu/细胞)，10mU/mg蛋白的报道基因产物β－半乳糖苷酶只由Ad5LacZ表达。用运铁蛋白－病毒混合物Tf-Ad5LacZ(500Tf分子/pt)转导产生25mU/mg蛋白质的报道基因表达，用Tf-Ad5LacZ(5000Tf分子/pt)转导产生38.8mU/mg表达，其分别比只用Ad5LacZ转导产生的表达高2.5，3和3.8倍。以1000pt/细胞或5MOI Tf-Ad5LacZ(500Tf分子/pt)剂量产生高2.4倍的报道基因表达，且用Tf-Ad5LacZ(5000Tf分子/)产生的表达比只用Ad5LacZ高3.3倍。Tf-Ad5LacZ(50,000Tf分子/pt)产生高2.6倍的表达，似乎达到饱和。因此，Tf-Ad5LacZ复合物的最佳比例大约为500－50,000Tf分子/pt，优选大约5000Tf分子/pt。据认为用于包被病毒颗粒表面的大量运铁蛋白分子提高其穿经血流的稳定性。病毒颗粒表面的大量运铁蛋白分子也能通过阻止病毒抗原暴露而降低病毒的免疫原性。
组织化学染色示出只用Ad5LacZ产生20－30％转导效率，而运铁蛋白复合的腺病毒Tf-Ad5LacZ(5000Tf分子/pt)产生70－90％的转导效率。
以上结果表明腺病毒－运铁蛋白混合物能实质上增强腺病毒基因转导。
实施例2在裸鼠JSQ－3异种移植模型中运铁蛋白定向的系统性腺病毒基因输送A.制备运铁蛋白－腺病毒复合物通过类似于实施例1所述方法制备运铁蛋白－Ad5LacZ复合物。将1×109～1×1010pt Ad5LacZ(在含有3％蔗糖的PBS中1×1012pt/ml)与不同量的Tf(4-5mg/ml于水中)混合为比例在1μg～1mgTf/1×1010pt或7.5×102～7.5×105Tf分子/病毒颗粒范围内。将此混合物在室温摇动培养5－10分钟(每2分钟摇动试管1次)，以形成Tf-Ad5LacZ复合物。在每个试管中加入PBS(pH7.4)以稀释为1×109～1×1010pt/0.2-0.3ml/鼠注射液。
在裸鼠体内通过皮下注射上述培养试验中所用的SCCHN细胞系(JSQ－3)，或人前列腺癌细胞系DU145(Isqacs等，1991；Asgari等，1997)，建立两种类型人体肿瘤异种移植。裸鼠肿瘤模型通过将JSQ－3细胞或DU145细胞皮下注射到4－6周龄雌裸鼠的胁腹部而建立(XU等，1997)。使肿瘤生长至1－2cm3大小。将200－300μl1×109－1×1010pt Ad5LacZ复合的不同量的Tf，用1cc注射器和30G针头经尾静脉注射入每只鼠中。在对照组中，注射Ad5LacZ。注射3天后，切下肿瘤和鼠器官，切成1mm薄片，用PBS冲洗1次，并在室温用2％甲醛/0.2％戊二醛固定4小时。将固定的肿瘤切片冲洗4次，每次1小时，并用含0.1％NP－40(pH8.5)的X-Gal溶液在37℃染色过夜。将染色的肿瘤切片包埋并用正常组织学程序切片，并用核快速染红负染。对肿瘤的四个切片进行测试，评判β－半乳糖苷酶基因表达，用蓝染的细胞示出。
其它的肿瘤切片用于β－半乳糖苷酶的定量分析。将组织匀浆并在1×报道裂解缓冲液(Promega)中裂解。将裂解物加入96孔平板中并如实施例1所述进行β－半乳糖苷酶定量分析。在一些试验中，β－半乳糖苷酶定量分析还用一种发光β－半乳糖苷酶检测试剂盒II(Clontech)进行。
B.结果与讨论为测试系统性定向的病毒基因输送，将病毒载体经静脉注射至已建立的固体肿瘤模型中。两个固体肿瘤异种移植模型用于测试定向的病毒基因输送系统。将1×1010pt Ad5LacZ或与不同量的Tf复合的1×1010pt Ad5LacZ经静脉注射至携带1－2cm3大小人JSQ－3和DU145肿瘤异种移植物的裸鼠体内。三天后，用Tf-Ad5LacZ注射的肿瘤示出与只用Ad5LacZ注射相比，X－Gal染色的兰细胞增加(＜1％)。效率由于Tf/pt比例从5％提高到735％(0.01mg-0.6mg/1010pt)而提高。Tf/pt比例＞0.6-1mg/1010pt(大约4.5～6×105Tf分子/病毒颗粒)，效率开始降低。如图2A，2C和2E所示，其中β－半乳糖苷酶表达细胞(如X－Gal染色所示)的百分率随着Tf分子/病毒颗粒的比例从2.9×105Tf/病毒颗粒增加至5.8×105Tf/病毒颗粒而实际下降(图2C和图2E)。另外，在1.5×105Tf/病毒颗粒的比例，在肝脏和其它器官如脾和肺中无β－半乳糖苷酶表达(图2B)，但在2.0×105Tf分子/病毒颗粒比例下，在肝脏中有最小但可清晰检测到的β－半乳糖苷酶的表达(图2D)。相反，注射用较高比例Tf/病毒颗粒产生的Tf-Ad5LacZ导致显著的肝脏染色(图2F)。因此，基于这些发现，确定了1.5×105Tf分子/病毒颗粒的比例进行最佳化研究。该比例表明明显的肿瘤转染效率，同时保持最高度肿瘤特异性。呈现的最佳条件对JQS－3而言是大约0.02-0.2mg/1010pt(7.5×103～1.5×105Tf分子/病毒颗粒)，对DU145而言是大约0.03-0.5mg/1010pt。因此，Tf/pt比例在不同肿瘤模型中可以体内最佳化。应注意的是体外最佳Tf/pt比例比体内小，这样在体内需要更多的运铁蛋白以稳定病毒以改善定向。0.2mg Tf/1010pt(1.5×105Tf分子/病毒颗粒)的比例用于随后的体内基因治疗JSQ－3肿瘤试验。
定量β－半乳糖苷酶分析还证实用运铁蛋白定向的腺病毒静脉注射鼠肿瘤中，比只用腺病毒注射鼠肿瘤中的基因表达实质上增加。
经病毒的定向器官输送还在用Tf-Ad5 LacZ复合物静脉注射的鼠肝脏中观测到，但肝脏输送有不同的优选Tf/pt比例，如大约0.5mg-1.3mg Tf/1010pt(3.75×105～9.75×105Tf分子/病毒颗粒)。在只用Ad5LacZ静脉注射的鼠中，只有有限的肝细胞染兰(＜1-5％)，而用Tf-Ad5LacZ静脉注射的鼠中染兰的肝细胞增加(10－40％)。定向肿瘤与定向肝脏之间优选的Tf/pt比例的不同证明本发明的系统性病毒输送系统可以最佳化，以适应不同的目标。
实施例3DU145异种移植裸鼠模型中运铁蛋白定向的腺病毒介导的基因输送及p53的体内蛋白质表达对运铁蛋白定向的腺病毒载体将p53基因选择性输送至肿瘤的能力进行测试。携带正常人p53基因的复制缺陷腺病毒的血清型5用于这些研究。称为Adp53的此病毒用于产生Tf-Adp53。Tf－Adp53通过将全运铁蛋白与Adp53在10mM HEPES，pH7.4中，以1.5×105Tf分子/病毒颗粒的比例混合。在4℃培养10分钟后，加入磷酸盐缓冲的盐水(PBS)pH7.4至终体积为300μl/鼠，并使终浓度为5％葡萄糖。将这些病毒静脉注射至携带皮下DU145肿瘤的裸鼠中三天后，处死该鼠，切下肿瘤及器官，并进行p53蛋白表达的Western印迹分析(见图3)。这些研究中所用的抗体与正常和突变形式的人p53均反应。并与鼠p53交叉反应。代表病毒转导的野生型p53的p53条带在凝胶中迁移至在DU145细胞中发现的突变形式p53之上。这可在图3的左侧2个条带看出，其中对比了DU145细胞与用Adp53在培养中感染的DU145细胞。代表病毒编码的wtp53的上方条带在用Adp53体外感染的DU145细胞中明显可见。应注意的是第一个泳道(DU145＋Adp53)只含有2.5μg的蛋白质，而图3的所有其它泳道均含有100μg的总蛋白。
对接受定向的Adp3(即Tf-Adp53)的小鼠肿瘤进行的Western印迹分析显示一条上方条带(外源p53)和一条下方条带(内源DU145p53)，其合并为呈现一条单一的大条带。清楚的是在接受Tf-Adp53的鼠肿瘤中比用未定向的Adp53处理的鼠肿瘤中有更明显的外源p53。用定向的Tf-Adp53处理的鼠的肝脏和其它维持生命所必需的器官显示少量的或没有外源wtp53。相反，用未定向的Adp53处理，在肝脏中产生较高水平的外源p53。正如所期望的，未处理的鼠肿瘤只含有内源DU145p53，而且这些动物的器官只含有内源鼠p53。这些结果进一步证实Tf-Adp53而非未定向的Adp53能在体内选择性定向肿瘤，且p53在经静脉施用后在肿瘤组织中有效表达。
实施例4在SCCHN异种移植裸鼠模型中，运铁蛋白定向的系统性腺病毒介导的体内基因输送与放疗的联合对定向的腺病毒输送系统在基因疗法中的作用进行的最终研究结果是，当系统性施用其时在治疗肿瘤中是有效的。现已证实缺失p53功能能产生辐射抗性表型(Bristow等，1996)。我们先前证实组合wtp53和常规放疗能长期消除建立的异种移植肿瘤(Xu等，1999；Pirollo等，1997)。此实施例的结果示出Tf-Adp53使人肿瘤细胞的异种移植物对放疗敏感的能力。
异种移植物是在4－6周龄雌性无胸腺裸鼠(NCr nu-nu)中，通过在每个动物的尾部之上的下背部，经皮下注射4×106JSQ－3细胞(MatrigelTM，胶原基质)而诱导的。JSQ－3细胞衍生自回归SCCHN，且已知是高辐射抗性的。使肿瘤生长至100－200mm3大小。称为定向的Ad-p53的定向的腺病毒是如实施例1所述通过混合运铁蛋白与携带编码wtp53的DNA而制备的。计算此实验的每个噬斑形成单位(pfu)的腺病毒颗粒(pt)。将动物分成4组(i)未处理的(－)辐射；(ii)未定向的Adp53(＋)辐射；(iii)定向的Adp3(－)辐射；(iv)定向的Ad-053(＋)辐射。将鼠(ii，iii和iv组)经尾静脉，每3－4天用1×1010pt/鼠/注射(等于大约3×108pfu)定向的(Tf配体和病毒的混合物)或未定向(无配体)Adp53注射。共注射6次。在开始静脉注射之后，将动物(ii和iv组)夹住，使只是肿瘤区域被照射，首次剂量是用J.L.Shepard和Associates Mark I辐照器施用2.0Gy的137Cs电离辐射。之后，持续5天将动物用2.0Gy/天处理，随后2天不进行放射处理。重复此循环直至共施用30Gy。以盲试方式每周测定肿瘤大小。
未处理的动物和那些接受定向的Ap53而不放射的动物由于肿瘤难以负担而在第52天将其处死(见图4)。用未定向的Adp53加上放射治疗在治疗期间延迟肿瘤生长。然而，一且治疗停止，这些动物中的肿瘤的大小开始增加，这样到第121天由于肿瘤难以负担也将其处死。相反，接受Tf-定向的Adp53组合放射治疗的动物体内的肿瘤，治疗期间甚至停止治疗后完全退化，这样在治疗8个月后，这些动物中没有肿瘤再生。
这些结果与图3一起证实系统性施用Tf定向的腺病毒可将wtp53选择性地输送至肿瘤，引起肿瘤对常规放疗的敏感性。更重要的是，组合Tf-Adp53和放射治疗可长期根除肿瘤。最近Kataoka等(1998)报道在用A549细胞建立的鼠模型中，组合2－甲氧基雌二醇(2-Me)和系统性输送未定向的Adp53，可部分抑制转移的肺癌生长。此组合处理引起计数的肺集落有2/3降低。尽管是有前途的，但是此处理后残留的肿瘤细胞还要生长并最终使动物死亡。相反，我们用Tf定向的Adp53处理显示能全部且长期(目前是8个月以上)退化皮下注射的SCCHN肿瘤。
实施例5在SCCHN异种移植的裸鼠模型中，运铁蛋白定向的系统性腺病毒介导的体内基因输送与放射治疗的联合如实施例4所述在NCr-nu-nu鼠中诱导JSQ－3异种移植物。使肿瘤生长至50－60mm3大小。具有(定向的Ad-p53)和不具有(定向的Ad)编码人wtp53的DNA的定向的腺病毒，如实施例1所述，通过混合运铁蛋白与腺病毒而制备。计算每个噬斑形成单位(pfu)的腺病毒颗粒(pt)。将动物分成5组(i)未处理的(－)辐射；(ii)定向的Ad-p53(＋)辐射；(iii)定向的Ad(＋)辐射；(iv)定向的Ad-p53(－)辐射；(v)定向的Ad-p53(＋)辐射。将鼠经尾静脉每3－4天用3×109pt/鼠/注射而注射。共注射5次。在开始注射3天后，夹住动物，使只是肿瘤区域被照射，首次剂量是用J.L.Shepard and Associates Mark I辐照器施用2.0Gy的137Cs电离辐射。之后，将动物连续5天用2.0Gy/天处理，随后2天不放射处理。重复此循环直至共施用26Gy。以盲试方式每周测定肿瘤大小。如实施例4所示，未处理的动物及那些接受定向的Ad-p53而不放射治疗的动物的肿瘤持续生长，这样在第50天由于肿瘤难以负担而将动物处死。用放射治疗及无wtp53的定向的Ad处理组的肿瘤表明在治疗期间有一些对生长的微小的放射抑制作用，但一旦治疗结束，肿瘤的体积仍增大。在接受定向的Ad-p53而不放射治疗的动物中，在治疗后有类似的但更显著的再生长。明显相反的是在接受定向的Ad-p53组合放射治疗的那些鼠中出现的结果。如实施例4所示，在所有的治疗结束之后8个月之后，这些动物中肿瘤持续退化，鼠的8个月寿命等于人的30年寿命。
实施例6运铁蛋白定向的逆转录病毒基因转导逆转录病毒载体是广泛用于临床治疗的基因疗法所用的载体之一。与腺病毒载体一样，逆转录病毒特异性较低且免疫原性明显。
含有3×107转化单位(TU)/nl的1×1010颗粒(pt)/ml的含有大肠杆菌LacZ基因的复制缺陷逆转录病毒，RvLacZ(ALacZ，基因转移载体中心，Iowa大学)用于此项研究。运铁蛋白和Tf-RvLavZ复合物的制备类似于实施例1所述。简而言之，首先将Tf在10mMHEPES pH7.4中稀释为0.5mg/ml，然后将不同量的Tf加入系列稀释的50μl HEPES缓冲液中。然后将RvLacZ加入试管中，使Tf与病毒的比例在1×102～1×106Tf分子/病毒颗粒范围内。在室温将此试管摇动培养10～15分钟，每2分钟摇动1次，然后在每个试管中加入150μl无血清EMEM。如实施例1所述进行体外逆转录病毒转导。病毒与细胞比例在100～200病毒pt/细胞范围。
在病毒剂量为500pt/细胞或1.5MOI(或TU/细胞)，只通过逆转录病毒RvLacZ表达3.4mU/mg蛋白的β－半乳糖苷酶。用运铁蛋白复合的病毒转导，施用Tf-RvLacZ(500Tf分子/pt)产生6.8mU/mg蛋白的半乳糖苷酶表达，而施用Tf-RvLacZ〔5000Tf分子/pt〕产生9mU/mg表达，这比只施用RvLacZ产生的基因转导高2和3倍。在5000Tf分子/pt比例，基因转导增加。在剂量为1000pt/细胞或3MOI，Tf-RvLacZ(5000Tf分子/pt)比只用RvLacZ产生多2.1倍的报道基因表达，Tf-RvLacZ(50000Tf分子/pt)比只用RvLacZ产生多3倍的表达。组织化学染色示出只用RvLacZ有20－30％的转导效率，而运铁蛋白复合的逆转录病毒Tf-RvLacZ(5000Tf分子/pt)有60－80％的转导效率。结果表明施用运铁蛋白和逆转录病毒的复合物能实质上增强逆转录病毒基因转导。
实施例7在同基因鼠模型中，运铁蛋白定向的体内系统性腺病毒介导的基因输送联合化学治疗本例检查了配体定向的病毒p53输送系统在免疫活性的动物模型中，使肿瘤细胞对化疗敏感的能力。这些研究选用的模型是B16鼠黑素瘤肺转移模型。在多重试验中，经尾静脉将B16细胞注射至免疫活性的C57/BL/6鼠中。在此模型中，肺中的肿瘤集落由于肿瘤细胞对黑色素的表达而在2－3周内易于观测到。在注射B16细胞4天后，开始用组合Adp53，Tf-Adp53和/或顺铂(CDDP)进行治疗。将1.5×105Tf分子/病毒颗粒比例的1×1010病毒颗粒/鼠/注射(等于3×108pfu)，经尾静脉注射系统性施用，每周注射3次，总计注射12－13次。每2－4天腹膜内施用CDDP(3－5mg/kg)，共施用8－13次。在全部治疗之后的第1天(在开始静脉注射B16细胞后5周)，从动物体切下肺并用10％甲醛灌注。
如图5A－H所示，得自接受组合治疗及在两个另外试验中的其它组的肺有明显不同。虽然只用CDDP和只用Tf-Adp53的试验表明与未处理动物的肺相比时有一定效力，但仍存在明显的肿瘤集落。相似地，用对照病毒Tf-AdLacZ加上CDDP处理的动物肺只有药效。更明显地，接受未定向的Adp53与CDDP处理的动物还存在大量肿瘤集落。表明当系统性输送未定向的Adp53时有很小的效力。然而相反的是，接受运铁蛋白定向的腺病毒p53(Tf-Adp53)组合CDDP治疗结果几乎观测不到肿瘤转移。这些发现表明系统性输送Tf定向的Adp53能使肿瘤细胞对除常规放疗之外还对常规化疗敏感。另外，Tf-Adp53除在以前所用的裸鼠模型有效发挥作用之外，在同基因鼠模型中也有效。
用于所有试验的Tf分子是人Tf。已知给定物种的TfR可与其它物种的Tf结合(Aisen，1998)。然而，我们开始考虑的是人体肿瘤在裸鼠中的选择性可能有助于我们使用的人TfR被肿瘤TfR识别先于被宿主正常组织中小鼠TfR识别。涉及在C57/BL/6鼠中生长的B16鼠黑素瘤细胞的同基因模型系统在这点上是保证的。在此模型中，肿瘤上的TfR和正常组织上的TfR都是鼠TfR。然而，我们能证实与人Tf复合的腺病毒定向于具有鼠TfR水平提高的肿瘤。此发现提示是TfR表达水平而非物种相关的现象导致定向于上述裸鼠模型中人异种移植肿瘤，并提高我们达到治疗人体内生长的肿瘤这一最终目标的可能性。
实施例8运铁蛋白定向的单纯疱疹病毒转导单纯疱疹病毒(HSV)是有复制活性的病毒载体，广泛地用于基因治疗，尤其用于中枢神经系统(Walker，1999)。与腺病毒或逆转录病毒载体一样，HSV特异性较差而免疫原性明显。
为考查用运铁蛋白定向策略定向有复制活性的病毒载体G207的可行性，将具有报道基因LacZ的HSV(Walker，1999)与人运铁蛋白复合。将G207(1.1×109pfu/ml，NeuroVir，Inc.，在PBS中)与人全运铁蛋白(Sigma，5mg/ml在水中)混合，比例如实施例1所述针对Tf-AdLacZ的不同比例。在一试验中，HSV在与Tf混合前在37℃热处理培养10分钟。所述热处理可灭活HSV。
为进行转导试验，将8×104JSQ－3细胞/孔铺板于24孔平板中。24小时后，用无血清的EMEM冲洗细胞一次，然后向每个孔中加入0.3ml的无血清或抗生素的EMEM。MOI＝1时，将200μl EMEM中含有的不同运铁蛋白与病毒比例的HSV或Tf-HSV加入孔中。37℃，5％CO2摇动混合培养4小时后，其中每2分钟摇动试管1次，向孔中加入含有20％血清的0.5ml EMEM。培养2天后，用PBS冲洗细胞1次，并在1X报道裂解缓冲液(Promega)中裂解。细胞裂解物用100μl在含有1mM MgCl2和450nM β－巯基乙醇的20mM Tris(pH7.5)中的150μMO－硝基苯基－β－半乳糖吡喃糖苷处理，37℃30分钟。加入150μl/孔1M Na2CO3终止反应。405nm测吸光度。纯化的β－半乳糖苷酶(Boehringer)用于产生标准曲线。结果以每mg总蛋白的β－半乳糖苷酶当量的毫单位(mU)表示。结果示于表1。
表1运铁蛋白增强HSV转导效率
*β-半乳糖苷酶活性，mU/mg蛋白运铁蛋白增强HSV的转导效率，HSV是一种有复制活性的病毒载体。当HSV经热处理灭活时，与TT复合仍显示增强的转导效率。在Tf/病毒颗粒比例为50000及MOI＝1时，Tf-HSV比无Tf定向的HSV产生的报道基因表达高2倍。此结果表明运铁蛋白定向策略可用于有复制活性的病毒载体如HSV。
实施例9在MDA－MB－435异种移植裸鼠模型中运铁蛋白定向的体内系统性腺病毒介导的基因输送联合化疗剂Docetaxel(Taxoere)治疗为进一步证实此定向的腺病毒输送系统的作用，应用另一种肿瘤模型－人乳腺癌衍生的细胞系MDA－MB－435。另外，由于化疗是治疗乳腺癌经常选用的，此试验测试本发明的输送系统使建立的人乳腺癌异种移植肿瘤对常用的化疗剂docetaxel(Taxotere)的敏感性。异种移植物是在4－6周龄的雌性无胸腺裸鼠〔NCr-nu-nu〕中，通过在每只动物的乳房脂肪层皮下注射2.5×106MDA－MB－435细胞而诱导的。使肿瘤生长至40－50mm3大小。称为Tf-Adp53的定向的腺病毒是如实施例1所述通过混合运铁蛋白与携带编码wtp53的DNA的腺病毒而制备的。将动物分成5组(i)未处理的(－)Taxotere；(ii)定向的Adp53(－)Taxotere；(iii)未定向的Adp53(＋)Taxotere；；(iv)定向的Adp53(－)Taxotere；(v)定向的Adp53(＋)Taxotere。将鼠每3－4天用5×1010pt/鼠/注射的定向的(Tf配体和病毒的混合物)或未定向的(无配体)Adp53，经尾静脉注射。共注射12次。在开始病毒注射之后的那天，开始药物治疗。将动物每3－4天静注7.5mg/kg的Taxotere，共注射11次。以盲试方式每周对每组的全部6－8个肿瘤大小进行测定。每组肿瘤的体积(mm3)±标准误差及时间(天数)绘图(图6)。只用TF-Adp53处理无效，只用Taxotere或用未定向的Adp53加上Taxotere处理产生一些代表药效的生长抑制。然而，在接受Tf-定向的Ap53组合Taxotere处理的动物肿瘤中观测到更明显的生长抑制。这些发现示出组合治疗的显著效力，并表明本发明的运铁蛋白定向的Adp53复合物不仅对多种人体肿瘤模型有效，而且也能用于使肿瘤对化疗剂敏感。
实施例10.在DU145异种移植裸鼠模型中，体内运铁蛋白定向的腺病毒介导的基因表达前列腺癌衍生的细胞系DU145表明在肿瘤内注射中表达提高。此实施例使用携带LacZ基因的复制缺陷腺病毒血清型5。用MatrigelTM皮下注射无胸腺裸鼠(nu/nu)以产生肿瘤。如实施例1所述制备Tf-Ad-LacZ。如实施例2所述Tf/pt比例为0.1-0.2mg/1010pt。此鼠有2个肿瘤但只有一个是注射的。
在肿瘤内注射3×1010病毒颗粒/肿瘤24小时后，切下肿瘤制成切片，在液氮中冷冻，并在Bessman组织粉碎仪中粉碎。用Tropix公司的Glacto-StarTM化学发光β－半乳糖苷酶分析系统，根据生产商的指导测定β－半乳糖苷酶活性。结果示于图7。Tf-Ad-LacZ产生的β－半乳糖苷酶表达比Ad-LacZ产生的高3.4倍。此结果表明运铁蛋白定向策略可用于提高肿瘤内注射中的表达。
本发明在本专利申请中参考优选的实施方案加以揭示，应知本文所述的只是举例说明而非限制之意，本领域技术人员在本发明原理和权利要求范围内对本发明可以加以修改。
参考文献Aisen P(1998).Met lons Biol Syst.35585-631Asgari K，et al.(1997).国际癌症杂志71377-382.Baselga J和Mendelsohn J(1994).Pharmucol.Ther.64127-154.Berkner KL(1988).生物技术6616-629.Bischoff JR，et al.(1996).科学274373-376.Bristow RG，et al.(1996).Rudiother.Oncol 40197-223.CottenM，et al.(1992).美国科学院学报896094-6098.Douglas JT，et al.(1996).Nat.Biotechnol.141574-1578.Goud B，et al.(1988).病毒学163251-254.Hall AR，et al.(1998).Nat.Med.41068-1072.Heise C，et al.(1997).Nat.Med.3639-645.Isaacs WB，et al.(1991).癌症研究514716-4720.Kataoka M，et al.(1998).癌症研究584761-4765.Kirn D，et al.(1998).Nat.Med.41341-1342.Linke SP(1998).自然39513，15.Miyamoto T，et al.(1994).Int.，Oral.Maxillofac.Surg.23430-433.Pirollo KF，et al.(1997).癌基因141735-1746.Rogers BE，et al.(1997).基因治疗41387-1392.Roux P，et al.(1989).美国科学院学报869079-9083.Schwarzenberger P，et al.(1997).病毒学杂志718563-8571.Wagner E，et al.(1992).美国科学院学报896099-6103.Walker JR，et al.(1999).人类基因治疗102237-2243.Weichselbaum RR，et al.(1988).Int.J.Radiat Oncol.Biol Phys.15575-579.Wivel NA and Wilson JM(1998).Hematol Oncol.Clin.North Am.12483-501.Xu L，et al.(1997).人类基因治疗8467-475.Xu L，et al.(1999).肿瘤定向492-104.美国专利号5,108,921美国专利号5,139,941美国专利号5,288,641美国专利号5,378,457美国专利号5,416,016美国专利号5,521,291美国专利号5,547,932美国专利号5,635,382美国专利号5,693,509美国专利号5,762,938美国专利号5,833,975WO92/06180
权利要求
1.用于将病毒输送至宿主动物靶细胞中的载体，其包括与所述病毒非共价结合的定向于细胞的配体。
2.权利要求1的载体，其中所述病毒和所述配体彼此不是天然相关的。
3.权利要求1的载体，其中所述毒包含治疗性核酸。
4.权利要求1的载体，其中所述病毒包含编码治疗性肽或蛋白质的核酸。
5.权利要求1的载体，其中所述病毒包含编码野生型p53的核酸。
6.权利要求1的载体，其中所述病毒是逆转录病毒或腺病毒。
7.权利要求1的载体，其中所述病毒选自腺相关病毒，单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，痘苗病毒，禽痘病毒，金丝雀痘病毒和新培斯病毒。
8.权利要求1的载体，其中所述病毒是嵌合病毒，杂种病毒或重组病毒。
9.权利要求1的载体，其中所述定向于细胞的配体选自蛋白质，肽，激素，抗体和抗体片段。
10.权利要求1的载体，其中所述定向于细胞的配体是天然蛋白质或重组蛋白质。
11.权利要求1的载体，其中所述定向于细胞的配体选自胰岛素，毒素，EGF，VEGF，FGF，IGF，heregulin，病毒蛋白，细菌蛋白，雌激素和孕酮。
12.权利要求1的载体，其中所述定向于细胞的配体是运铁蛋白。
13.权利要求1的载体，其中所述定向于细胞的配体和所述病毒以100－1000000个配体分子/病毒颗粒的比例存在。
14.权利要求1的载体，其中所述定向于细胞的配体和所述病毒以6700～400000个配体分子/病毒颗粒的比例存在。
15.权利要求1的载体，其中所述定向于细胞的配体和所述病毒以1μg～10mg所述配体/1010个病毒颗粒的比例存在。
16.权利要求1的载体，其中所述定向于细胞的配体和所述病毒以10μg～600μg所述配体/1010个病毒颗粒的比例存在。
17.制备用于将病毒系统性输送至靶细胞的载体的方法，所述载体包含与所述病毒非共价结合的定向于细胞的配体，此方法包括在水性介质中混合所述定向于细胞的配体与所述病毒，从而所述配体与所述病毒非共价结合。
18.权利要求17的方法，其中所述水溶液包括一或多种缓冲剂，渗透性调节剂或抗生素。
19.将治疗剂提供给需要其的动物的方法，包括为所述动物施用治疗有效量的载体，以将病毒输送至所述动物体内的靶细胞，所述载体包含与所述病毒非共价结合的定向于细胞的配体。
20.权利要求19的方法，其中所述动物是人。
21.权利要求19的方法，其中所述治疗剂是系统性施用的。
22.权利要求19的方法，其中所述治疗剂是非肠道施用的。
23.权利要求19的方法，其中所述治疗剂是静脉内或动脉内施用的。
24.权利要求19的方法，其中所述治疗剂是肿瘤内施用。
25.权利要求19的方法，其中所述载体编码野生型p53。
26.权利要求19的方法，其中所述定向于细胞的配体是运铁蛋白。
27.权利要求19的方法，其中所述治疗剂施用于接受除所述治疗剂外的化疗的动物。
28.权利要求19的方法，其中所述治疗剂施用于接受除所述治疗剂外的放疗的动物。
29.权利要求19的方法，其中所述动物有头颈部、膀胱、乳腺，甲状腺、卵巢、脑，前列腺癌，黑素瘤或淋巴瘤。
30.权利要求19的方法，其中所述病毒包含编码野生型p53的核酸，另外其中所述定向于细胞的配体是运铁蛋白，且所述治疗剂是系统性施用的。
31.权利要求30的方法，其中所述治疗剂施用于接受除所述治疗剂外的化疗的动物。
32.权利要求30的方法，其中所述治疗剂施用于接受除所述治疗剂外的放疗的动物。
全文摘要
本发明涉及基因转移和基因治疗技术,更具体地,本发明提供了用于定向病毒输送的组合物和方法。所述方法使用混合病毒与定向于细胞的配体例如运铁蛋白的方法,所述病毒可以是一表达感兴趣蛋白质或感兴趣核酸的重组病毒。所述病毒和配体在不存在交联剂或可能共价结合病毒和配体的制剂时混合。这一简单混合导致与将配体与病毒化学连接相比较少失活,因此能得到比用交联剂方法获得的更具活性的治疗组合物。
文档编号A61K48/00GK1326511SQ99813505
公开日2001年12月12日 申请日期1999年11月19日 优先权日1998年11月19日
发明者埃斯特·H·章, 凯瑟琳·皮罗洛, 徐梁, 威廉·亚力山大 申请人:乔治敦大学, 西耐尔基因治疗学公司