专利名称：恢复p53家族蛋白质的构象稳定性的方法和组合物的制作方法
1.发明领域本发明涉及癌症治疗领域。本发明提供能够与p53家族的肿瘤抑制剂蛋白质相互作用并且稳定其中功能构象的有机非肽类化合物。本发明特别适用于稳定患者体内肿瘤抑制剂蛋白的突变形式，对于所述患者来说，校正该蛋白质的功能能力能有利于癌症治疗。还提供了筛选这样的化合物的方法。
11.发明背景一种蛋白质的一级结构是连接在一起形成蛋白质的多肽链的氨基酸结构单元的特定序列。这些多肽链接着折叠成三维结构。现在认为多种不同的疾病是由细胞蛋白质的三维结构中的构象微扰产生的(参见综述Thomas等，1995，TIBS 20456-459；Carrell等，1997，Lancet 350134-138)。例如，早老性痴呆由β-淀粉样蛋白的错折叠和接下来的聚集引起，导致损害细胞功能。类似地，Creutzfeld-Jakob疾病的病原体物质，朊病毒，据认为通过引发将正常的朊病毒蛋白转化为错折叠朊病毒蛋白的链反应而引起疾病。
采取不正常构象的蛋白质会如此，或者因为它们固有地易错折叠或者因为它们具有突变，该突变相对于野生型蛋白质来说热力学上将突变体蛋白质去稳定化。导致疾病的错义突变体的基本例子是肿瘤抑制蛋白p53。
野生型p53作为协调调控细胞周期，编程性细胞死亡和血管生成中多个途径的转录调控物起作用。监测细胞应力反应，例如DNA损伤，有丝分裂纺锤体错装配，缺氧的细胞途径看起来都集中在p53上。p53活性的损失可以导致受影响的细胞的不受控制的增殖和肿瘤生长。尽管p53活性的损失其本身可以或可以不被触发将细胞转化成癌细胞，可检测到的癌症更通常和可能在具有p53突变的人中生长。事实上，p53的突变体在癌症中最通常是遗传畸变的。
最近，两种另外的蛋白质，p73和p63，经鉴定与p53具有同源性(综述参见Kaelin，1999，J.Natl.Cancer Inst.91594-598；也参见Yang等，1998，分子细胞(Molecular Cell)2(3)305-16；和Yoshikawa等.，1999，致癌基因(Oncogene)18(22)3415-21)。p51也称为p40，p51，KET或p73L。这些蛋白质不只是具有与p53的氨基酸序列同源性，并且它们也激活p53应答启动子并且诱导编程性细胞死亡。此外，编码这些蛋白质的基因看起来遗传学上与p53相关。因此，存在本领域确认的蛋白质家族相关的p53，其具有相似功能和相关的氨基酸序列。
p53是一种具有三个独立功能结构域的复合大分子诱导转录激活结构域的N-末端(大约氨基酸1-43)；一个编码DNA结合域(DBD)的中心部分(大约氨基酸100-300)；和作为寡聚作用结构域起作用的C-末端部分(大约氨基酸319-360)。这些p53 DBD的结晶结构表明具有高β-折叠含量的大概的球状球形结构域。
p53活性高度取决于蛋白质维持其功能构象的稳定性的能力。来自很多不同癌症的肿瘤分析表明DBD常常发生突变。Friedlander等，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2712546825478。尽管有大量不同的在主要癌症中的p53DNA结合结构域中发生的定点突变(Pavletich等，1993，Genes & Development 7，25562564)，但是已知为热点的p53 DBD中的具体残基位置不经常高发生率发生突变。通常在人肿瘤中发现的热点突变多少随机地分布于DBD。当接触脲时，所有常见的p53突变形式的p53 DBD比野生型DBD更不稳定(Bullock等，上文)。另外，p53突变体经常与细胞中的热激蛋白有关，得出它们不能保持天然构象的结论(Finlay等，1988，分子和细胞生物学(Molecular and Cellular Biology)8531-39)。
发现与p53的C-末端结构域的相互作用激活p53的细胞周期停滞性质。具体地说，将C-末端特异性p53抗体注射到周期细胞中可以捕获它们(Mercer等，1982，美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)79，6309-6312)。更详细的研究证明，C-末端结构域调控DBD结构域的DNA结合活性。例如，Hupp发现单克隆抗体Pab 421，其与p53 C-末端结构域的残基373-381相互作用，能增强某些突变形式的p53的DNA结合活性(Hupp等，1993，核酸研究(Nucleic Acids Research)213167-3174)。因此，Hupp及其同事集中研究中和C-末端中独立的负调控结构域的抗体和肽，试图恢复p53功能(Selivanova等，1997，天然药物(Nature Med.)3，632-638)。但是，通过该方法恢复的273位突变与其它常见突变的不同之处在于它们保持高基础DNA结合活性并且表现出类似于野生型蛋白质的热动力学稳定特征(Bullock等，1997，美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad..Sci.USA)94，14338-143421)。
本领域其它研究人员证明开发一种结合突变体p53的N-末端结构域的化合物是恢复野生型p53活性的最有效途径。例如，Friedlander等试验了很多种结合p53上定义的表位的不同的单克隆抗体以获得促进温度敏感p53突变体的DNA结合活性的稳定性。Friedlander等，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271，25468-25478。但是在较低的温度下C-末端特异性抗体PAb 421不恢复对突变体p53的DNA结合功能，而N-末端特异性p53抗体，特别是单克隆抗体Pabl 801，在升高的温度下在促进温度敏感p53突变体的DNA结合活性方面更有效。以这些发现为基础，Friedlander等推测通过与N-末端结合上模拟1801表位识别区的小分子会有利于突变体p53中的野生型DNA结合活性。值得注意的是，Friedlander等证明对p53蛋白质的中心部分(DBD结构域)中的表位特异性的抗体对DNA结合活性没有影响。作为他们的结论的一种解释，Friedlander等假设通过使用一个远的结构域稳定一种蛋白质中的一种结构域的构象。Bullock等证明通常发生的p53DNA结合域突变体中热动力学稳定性中的变化确实很小，并且推测对于p53开发小分子治疗，例如如Friedlander等提议的(即与N-末端结合的分子)可能是容易的。Bullock等，1997，上文。
鉴定抗癌药物的其它更普遍的方法关键在于在以细胞为基础的(例如肿瘤细胞系)或动物分析中分析小分子的直接的抗肿瘤活性。曾经描述过具有可能的抗肿瘤活性的多种小分子。Mazerska等，1990，抗肿瘤药物设计(Anti-Cancer Drug Design)5，169-187；Su等，1995，药物化学杂志(J.Med.Chem.)38，3226-3235；Nagy等，1996，抗癌研究(Anticancer Research)16，1915-1918；Wuonola等，1997，抗癌研究(Anticancer Research)17，3409-23。Mazerska等描述了一系列硝基-9-氨基吖啶，其中硝基与吖啶连接，其抗肿瘤性质归因于它们结合DNA并且产生共价链间交联的能力。Su等描述了开发为拓扑异构酶II的带有各种位置苯胺和被取代的吖啶环的一系列9-苯胺吖啶衍生物。Nagy等描述了一系列通过短的碳连接体与脲或者以苯二亚酰亚氨基为基础的基团连接的吩噻嗪-相关化合物。Nagy等假设这类化合物的抗肿瘤细胞活性来自它们与钙通道和钙调蛋白反应的能力。Wuonola等，上文，描述了与上文Nagy等描述的化合物类似的吩噻嗪化合物。
迄今为止，还没有报道过与p53家族蛋白质相互作用以恢复或稳定野生型活性，例如肿瘤抑制活性，的小的有机非肽分子。此外，这样的化合物的发现由于缺乏高通量筛选或分析阻碍。
III发明概述认识到鉴定可以使与人疾病相关的热动力学不稳定的蛋白质或错折叠蛋白质构象稳定化的化合物的重要性，和认识到其中这样的化合物可能被快速鉴定的高通量分析系统的缺乏，本申请人研究了分离的突变体p53 DNA结合域(DBD)在其中快速鉴定将突变体p53构象稳定化的物质的体外和体内分析中作为模型系统的用途。本发明提供了客观鉴定促进p53家族蛋白质野生型活性的化合物，包括人用药物的快速可靠和准确的方法。
因此，本发明提供了非肽有机化合物可以与p53家族蛋白质相互作用并且促进其野生型活性的第一次证明。在生理温度或接近生理温度时，这些活性化合物不只是在各种突变体p53蛋白质中而且在野生型p53蛋白质中促进p53的野生型活性。这样的化合物具有作为抗癌药物的重要用途。因此，本发明提供用于具有p53家族蛋白质突变体或野生型活性的癌症中的抗肿瘤治疗的新的方法和化合物。
一方面，本发明提供了促进人p53家族蛋白质的突变型中的野生型活性的方法，其中该蛋白质的一个或多个功能活性至少部分被蛋白质的在生理条件下保持功能构象的无能而损害，该方法包括使突变蛋白接触能在生理条件下结合突变蛋白中的一个或多个结构域并且稳定其中的功能构象，并且允许稳定化的蛋白质与参与野生型活性的一个或多个大分子相互作用的有机非肽化合物。所述人p53家族蛋白质可以是，例如，p53，p63或p73。在优选的实施方案中，所述有机非肽化合物与p53相互作用，更优选地，与p53的DNA结合域相互作用。
在另一个实施方案中，本发明还提供了一种对人受治疗者治疗一种与具有一种或几种减小的野生型活性的p53家族突变蛋白质的表达有关的疾病状态的方法，包括对受治疗者施用一种能在生理条件下结合突变蛋白中的一个或多个结构域并且稳定其中的功能构象；允许患者中稳定化的蛋白质与一种或几种参与野生型活性的大分子相互作用的有机非肽化合物的步骤。在另一个实施方案中，本发明提供了对人受治疗者治疗癌症的方法，包括下面的步骤对受治疗者施用一种能在生理条件下结合人p53家族蛋白中的一个或多个结构域并且稳定其中的功能构象，并且允许稳定化的蛋白质与参与野生型活性的一个或多个大分子相互作用的有机非肽化合物。
一方面，在本发明中使用的有机非肽化合物可以是包含通过一个特定长度的连接体连接在一起的一个疏水基团(例如平面多环)和一个阳离子基团(优选胺)的化合物。
在一个优选方面，在本发明中使用的有机非肽化合物选自 其中对于第I组，
R5是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，或(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R6是is(a)(C1-C6)烷基或(C2-C8)链烯基，各自任选被一个或多个苯基取代，或者(b)被卤基，(C1-C6)烷氧基取代的苯基；和R7和R8是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；其中对于第II组， R9是(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；其中对于第III组， R10是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被-个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R11和R12是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；其中对于第IV组， R13是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，(C5-C9)杂芳基，(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R14和R15是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；和其中对于第V组， A是碳或氮；R16是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，或者其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R17选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素。
另外，在实施本发明中有用的很多化合物本身是新的，这里对于这样的化合物的描述定义了本发明的又一方面。
本发明另一方面还提供了设计促进p53家族蛋白质的野生型活性的另外的化合物的方法。该方法要求使用本发明的一种活性化合物来提出一种假设，鉴定一种符合该假设的候选化合物，并且测定该候选化合物是否促进p53家族蛋白质的野生型活性。
本发明的另一方面是一种组合物，含有一种p53家族蛋白质和与该蛋白质相互作用并且促进该蛋白质的野生型活性的非肽化合物的一种复合物。
在另一方面，本发明提供了一种筛选促进p53家族蛋白质的野生型活性的方法。在优选的方面，该方法包括检测与p53DNA结合域(DBD)相互作用的化合物，并且测定在该化合物的存在下p53DBD的构象。但是，本发明还涉及p53家族全长和部分蛋白质在这样的筛选方法中的用途。在一个特别实施方案中，同时进行检测和测定步骤。任选地体内对发现促进p53家族蛋白质的突变型中的野生型活性的化合物筛选它们使肿瘤生长停止或抑制的能力。本发明的另一方面是通过对有机非肽化合物筛选与p53DBD的特异性相互作用的药物发现的一种方法。
本发明鉴定促进p53家族的突变体或野生型蛋白质中野生型活性的化合物的成功证明本发明的方法是可被广泛用于对由构象缺陷或不稳定蛋白质诱导的一类疾病的药物发现。这样的蛋白质靶物的例子包括pp60src，遍在蛋白活化酶El，囊性纤维化跨膜传导调节剂，血红蛋白，朊病毒蛋白，丝氨酸蛋白酶抑制剂，和β-淀粉状蛋白。
IV.附图的简要说明
图1. p53DBD上构象依赖性表位的调控。p53DBD固定在微量滴定孔中并且在升高的温度下温育。用ELISA分析测定保留在加热的孔中的mAb 1620表位相对于冰中保持的对照孔的百分比。图1A温育0.5ng野生型p53DBD，并且以未加热的对照物的百分比表示保留的mAb1620表位。标准偏差＜10％。图1B固定1.25ng的FLAG-标记的p 53DBD，在45℃下加热，并且以未加热的对照物的百分比表示保留的抗-FLAG，mAb1620和mAb240表位。图1C在37℃下加热1.0ng的野生型和143位点突变体p53DBD，它表现出大约相等水平的mAb1620表位。并且以未加热的对照物的百分比监测表位的稳定性。误差条是重复4次的标准偏差。
图2.突变体p53DBD上1620表位的稳定化作用。图2A代表性化合物称之为化合物X，化合物Y和化合物Z，它们促进p53的构象稳定性。图2B将1ng的野生型p53DBD固定并且在化合物或等量浓度的DMSO赋形剂的存在下在45℃下加热30分钟。以未加热的对照物的百分比表示保留的mAb1620表位。图2C将具有接近相等水平的mAb1620表位的野生型和突变体p53DBD制剂(10％内)固定并且在化合物或赋形剂存在下在37℃下加热30分钟。以未加热的对照物的百分比表示保留的mAb1620表位。误差条是重复4次的标准差。
图3.在携带p53突变体的细胞中调节p53构象和转录活性。图3A在培养基中用16.5μg/ml化合物X处理表达173位突变体p53的H1299转染子。使用全p53抗体，mAbDO-1，应用蛋白质印迹，在总p53蛋白质中使细胞溶胞产物以最小偏差标准化，在ELISA测试中测定表现出mAb1620表位的p53的量。用未处理细胞中1620-阳性p53级分校正1620-阳性p53级分的增加，图3B在微量滴定孔中将携带荧光素酶报道基因(H1299/报道基因)或者携带该报道基因和173位点突变体p53(H1299/报道基因＋突变体p53)的匹配的H1299转染子处理16小时。用没有化合物存在下的表达的基础水平校正是野生型p53功能的指征的荧光素酶报道基因的诱导的表达。数值代表重复4次的平均值。
图4.携带突变体p53的细胞中WAF1表达的诱导。用16.5μg/ml化合物X将表达转染的突变体p53蛋白质(173位点或249位点)的Saos-2细胞在培养中处理16小时。使用总蛋白质校正细胞溶胞产物并且用蛋白质印迹分析。用mAbDO-1对该印迹的上部分探测总p53，并且用针对WAF1的抗体对相同印迹的下部分探测。
图5.促进肿瘤中的p53构象稳定性和功能。对带有从H1299/报道基因＋突变体p53细胞产生的皮下肿瘤的小鼠一次腹膜内注射100mg/kg化合物X并且以使用mAbDO-1的蛋白质印迹的光密度扫描为基础对双份肿瘤溶胞产物校正总p53内含物。在ELISA测试中测定表现出mAb1620表位的p53的量，并且用未处理肿瘤溶胞产物中1620-阳性p53级分校正1620-阳性p53级分的增加。也对肿瘤溶胞产物分析荧光素酶表达以评价p53转录活性的增强。对荧光素酶表达校正蛋白质浓度并且与来自未处理肿瘤的的溶胞产物相比较。
图6.表达突变的p53的肿瘤异种移植的抑制。用肿瘤细胞接种小鼠并且通过腹膜内注射上述化合物X或赋形剂来处理。以每天一次(q.d.)或12小时间隔(b.i.d.)，施用化合物7天。赋形剂处理过的小鼠以12小时间隔接受注射。通过在两维方向测定肿瘤直径来确定肿瘤体积并且对每组5-7只小鼠取平均值。虚线代表当开始治疗时开始的肿瘤体积。
V.发明的详细描述肿瘤抑制基因产物p53中功能的损失可以导致在很多不同类型癌症中观察到的不受控制的增殖和/或细胞编程性细胞死亡的损失。即使在癌症细胞中p53不发生突变，在这样的一个细胞中促进野生型p53活性可以抑制癌性表型。本发明第一次证明，有机非肽化合物可以与p53家族的蛋白质相互作用来稳定其中的功能构象。因此，这样的化合物作为治疗所有类型的癌症的药物具有重要的用途。
因此，一方面，本发明提供了促进人p53家族蛋白质的突变型的野生型活性的方法，其中该蛋白质的一个或多个功能活性至少部分被蛋白质的保持在生理条件下功能构象的无能而损害，该方法包括使突变蛋白接触能在生理条件下结合突变蛋白中的一个或多个结构域并且稳定其中的功能构象，并且允许稳定化的蛋白质与参与野生型活性的一个或多个大分子相互作用的有机非肽化合物。所述人p53家族突变蛋白质可以是，例如，p53，p63或p73突变蛋白。在优选的实施方案中，所述有机非肽化合物与p53相互作用，更优选地，与p53的DNA结合域相互作用。
在另一个实施方案中，本发明还提供了一种对人受治疗者治疗一种与具有一种或几种减小的野生型活性的p53家族突变蛋白质的表达有关的疾病状态的方法，包括对受治疗者施用一种能在生理条件下结合突变蛋白中的一个或多个结构域并且稳定其中的功能构象，并且允许患者内稳定化的蛋白质与参与野生型活性的一个或多个大分子相互作用的有机非肽化合物的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了对人受治疗者治疗癌症的方法，包括下面的步骤对受治疗者施用一种能在生理条件下结合人p53家族蛋白中的一个或多个结构域并且稳定其中的功能构象，并且允许稳定化的蛋白质与参与蛋白质野生型活性的一个或多个大分子相互作用的有机非肽化合物。在本发明方法中稳定的人p53家族蛋白可以是野生型或突变蛋白，例如p53，p63或p73。
尽管p53家族的蛋白质是各种各样的癌症中的突变体，但是在某些癌症或癌细胞类型中p53家族的蛋白质(对p53本身进行了最充分的研究)的结构或功能被改变，即使涉及的细胞保持了野生型编码等位基因。例如，参见Kaelin，1999，上文，对于与病毒相关的癌症的讨论，其中病毒蛋白质降解p53蛋白，或者p53例如通过致癌基因的表达产物而被灭活或降解。给出细胞调节过程中p53家族的蛋白质的重要性，本发明的化合物也用于在该蛋白质的寿期和/或结构和/或活性正常的细胞中在生理条件下稳定非突变p53家族成员的功能构象就显而易见了。因此，本发明的化合物用来治疗其中p53蛋白质的功能等基本上不受癌症状态存在的影响的癌症，并且也用于治疗表达其异常还没有可检测地扩展到异常p53(或p53家族成员)功能，寿期或结构的前癌细胞的组织。另外，通过进一步稳定(例如，引起延长的寿命)与恶性肿瘤病灶邻近的或者在体内以其它方式与恶性肿瘤细胞接触的健康细胞中的p53家族的蛋白质，可以控制癌症的扩散。从这一点来说，本发明的化合物也是有用的。
根据本发明的实施，p53家族的蛋白质定义为哺乳动物p53，p63，或p73；和/或具有与一种或多种下面的结构域总体具有至少50％，更优选80％的氨基酸序列同源性的结构域的蛋白质(1)转录激活需要的N-末端结构域，(2)DNA-结合结构域，或(3)哺乳动物p53，p63，或p73的寡聚作用结构域，其中通过任何认可的算法BLASTP v.2.0(www.ncbi.nlm.nih.gov)(Altschul等，1990，分子生物学杂志(J.of Molec.Biol.)，215403-410，＂BLAST算法；Altschul等，1997，核酸研究(Nuc.Acids Res.)253389-3402)，和W.U.-BLAST-2.0(从圣路易斯华盛顿大学，MO，USA获得)确定所述同源性，并且其中所述蛋白质证实具有至少一个本领域认可也是p53，p63，或p73的特征的功能(例如，激活响应启动子并诱导编程性细胞死亡的能力；关于本领域认可的性质的讨论参见Kaelin，1999；Yang等，1998；和Yoshikawa等，1999，上述)。对于该方法的一般性讨论和BLAST的优点，Smith-Waterman和FASTA算法参见Nicholas等，1998，研究序列数据和序列评分方法指南(＂A Tutorialon Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods＂)(www.psc.edu)和其中引用的参考。
稳定p53家族蛋白质的野生型构象的化合物是当与p53家族蛋白质接触时促进或恢复该蛋白质的野生型活性例如DNA结合亲和性或者与影响p53家族蛋白质的正常功能的任何大分子相互作用的能力的化合物。p53的其它野生型活性包括但不限于转录激活活性(例如，WAF 1诱导作用)，细胞周期停滞，和编程性细胞死亡触发。
另一方面，本发明包括本发明的化合物抑制肿瘤生长和/或治疗癌症的用途。本发明的特别优点在于使用这里的方法这样鉴定的化合物表现出不只是稳定在筛选中所用的野生型p53DBD和突变体p53DBD的活性构象，而且还有其它突变体p53和p53DBD。因此这样鉴定的化合物在治疗各种癌症中具有广阔的应用。
本发明还提供了筛选促进p53家族蛋白质的野生型构象并且可以对p53家族的突变蛋白质恢复野生型活性的化合物的新的方法。使用本发明方法鉴定的化合物用于治疗例如与p53家族蛋白质活性缺陷相关的癌症这样的疾病。
本发明方法包括筛选与p53家族蛋白质直接作用的化合物。这样的方法可以使用用于筛选目的的p53家族全长蛋白质(突变体或野生型)，或者至少包含DBD和任选地N-末端和/或C-末端结构域的缺失衍生物。但是，在本发明优选方面，筛选使用只包含DBD而没有完整的N或C末端结构域的p53家族蛋白质的多肽片段。因此，对于该应用目的，术语＂DNA结合域＂或＂DBD＂理解为只是包括p53家族蛋白质的DBD，没有完整的N或C末端(除非另有说明)。但是根据测试形式，这样的DBD结构域可以与异源多肽融合(例如，一个FLAG表位或者一种谷胱甘肽-S-转移酶蛋白)。另外，不是只是去除对DNA结合的负调节作用，本发明的方法和化合物促进p53家族野生型和突变蛋白两者增强的构象稳定性。
因此，在通过非限制性操作实施例在下面描述的一方面中，本发明提供了筛选与p53DBD特异性作用的化合物并且测定在试验化合物的存在下p53DBD构象的方法。任选地，p53DBD是突变体p53DBD。但是，野生型p53DBD更容易大量超额生产。尽管筛选测试可以以细胞为基础的形式进行，但是对于对靶向p53DBD的化合物特异性的高通量筛选，体外基础的测试是最直接和期望的。对p53DBD最初筛选中鉴定的化合物可以进一步测试它们对完整p53(包括p53错义突变体)的影响。使用这些方法鉴定的化合物也在本发明范围内。
为了本发明目的，设计对与p53家族蛋白质的DNA结合结构域相互作用的化合物的测定，使得没有覆盖的化合物是特异性靶向DBD而不是该蛋白质的其它结构域。例如，特异性与DBD＂相互作用＂或者“作用于”DBD的化合物不需要必须稳定结合DBD(尽管其可以)；对于该化合物来说，对在该化合物存在下的p53家族蛋白质的构象施与一定影响就已足够。因此，可以首先对化合物筛选对与DBD的相互作用，然后测定它们对构象的影响，或者通过使用在该化合物存在下的构象变化也检测与DBD的相互作用，这两个筛选步骤可以同时进行。
本申请中术语特异性相互作用用来排除非特异性结合形式，包括已知在疏水性化合物和蛋白质之间通过非选择性疏水性相互作用发生的类型。术语特异性相互作用还用来通过改变大量溶剂的化学性质而将本发明的化合物的性质与影响蛋白质热稳定性的化合物区别开来。因此不包括在本发明范围中的这样的分子包括热稳定试剂，例如甘油，三甲胺-氧化物和重水。与p53家族蛋白质特异性相互作用的化合物在比这样的大量溶剂或非特异性疏水性相互作用低得多的浓度下表现出一种作用。例如，甘油在600mM下有效。但是，在体外或者以细胞为基础的测试中，与p53家族蛋白质特异性相互作用的化合物的作用在低于1mM，优选低于100微摩尔，更优选低于10微摩尔化合物浓度下观察到。
与实施本发明相关，一般使用下面的定义。这里使用的术语＂烷基＂，除非另有说明，包括具有直链，支链或环部分的或者它们的组合的一价烃基。类似地，术语＂链烯基＂和＂炔烃基＂定义其中分别存在至少一个双键，或者至少一个三键的具有直链，支链或环部分的烃基。当另外的基团例如烷氧基或烷基胺中存在烷基，链烯基或炔烃基时，这样的定义也适用。这里使用的术语＂烷氧基＂包括其中“烷基”如上定义的0-氧基。这里使用的术语＂卤基＂，除非另有说明，包括氟，氯，溴或碘。
为了描述方便起见，当在这里使用时，术语(C3-C10)环烷基指具有0个或者任选地具有一个或多个双键的环烷基和环烯基，例如环丙基，环丁基，环戊基，环戊烯基，环己基，环己烯基，1，3-环己二烯基，环庚基，环庚烯基，双环[3.2.1]辛烷，降冰片烷基，等。当在这里使用时(C3-C10)杂环烷基指吡咯烷基，四氢呋喃基，二氢呋喃基，四氢吡喃基，吡喃基，噻喃基，吖丙啶基，环氧乙烷基，亚甲二氧基，苯并吡喃基，异噁唑烷基，1，3-噁唑烷-3-基，异噻唑烷基，1，3-噻唑烷-3-基，1，2-吡唑烷-2-基，1，3-吡唑烷-1-基，哌啶基，硫代吗啉基，1，2-四氢噻嗪-2-基，1，3-四氢噻嗪-3-基，四氢噻二嗪基，吗啉基，1，2-四氢二嗪-2-基，1，3-四氢二嗪-1-基，四氢吖庚因基，哌嗪基，苯并二氢吡喃基，等等。本领域技术人员明白所述(C3-C10)杂环烷基环的连接是通过碳或sp3杂化氮杂原子。
当在这里使用时(C5-C9)杂芳基指呋喃基，噻吩基，噻唑基，吡唑基，异噻唑基，噁唑基，异噁唑基，吡咯基，三唑基，四唑基，咪唑基，1，3，5-噁二唑基，1，2，4-噁二唑基，1，2，3-噁二唑基，1，3，5-噻二唑基，1，2，3-噻二唑基，1，2，4-噻二唑基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，哒嗪基，1，2，4-三嗪基，1，2，3-三嗪基，1，3，5-三嗪基，吡唑并[3.4-b]吡啶基，噌啉基，喋啶基，嘌呤基，6，7-二氢-5H-[1]吡啶基，苯并[b]噻吩基，5，6，7，8-四氢喹啉-基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并异噻唑基，苯并异噁唑基，苯并咪唑基，硫杂茚基，异硫杂茚基，苯并呋喃基，异苯并呋喃基，异吲哚基，吲哚基，中氮茚基，吲唑基，异喹啉基，喹啉基，2，3-二氮杂萘基，喹喔啉基，喹唑啉基，苯并噁嗪基，等等。
本领域技术人员明白(C5-C9)杂芳基与结构的其它部分连接通常没有限制，即通过一个碳原子或者一个sp2杂化杂原子。类似地，苯基和萘基是(C6-C10)杂芳基的代表。
当在一幅图中时，描绘了一个键但是没有进行鉴定位于其远端的基团，按常规理解是一个甲基。在没有任何键被描绘的情况下，该位置被氢占据，如果原子价允许，这一点在本领域中是容易理解的。因此在描述中，R-O-指R-O-CH3。
A.促进p53家族的一种蛋白质中野生型活性的本发明化合物本发明的有机非肽化合物可以是任何类型的化合物，当暴露给p53家族的野生型或突变蛋白时，其促进该蛋白质的野生型活性。优选的化合物是相对小的(与50-150kD典型的蛋白质相比)有机化合物。本发明第一次提供了这样的化合物，它们不是肽，而且更特别地不是抗体，但是与p53特异性反应，从而稳定p53DBD或p53蛋白质的野生型构象。不是肽的有机化合物特别用作各种原因的药物。例如，非肽化合物比肽类有小得多的免疫原性，并且更容易通过粘膜或其它细胞层屏障吸收到体内，并且可能较小不稳定性。
一方面，通过本发明方法找到的活性化合物可以定义为包含通过一个特定长度的连接体连接在一起的一个疏水基团(例如平面多环)和一个阳离子基团(优选胺)的化合物。疏水位置中苯并咪唑，苯并喹啉，吩噻嗪，和苯乙基喹唑啉是优选的。
活性阳离子基团是仲胺和叔胺，包括但不限于二甲胺，二乙胺，二乙醇胺，甲胺，甲基哌嗪，和吗啉。当在吩噻嗪疏水系列中试验时一些较大的胺相应地更具活性；因此在此种情况下，优选较大的胺。阳离子位置中带正电荷基团是活性的和优选的(见下面的表1)。
关于本发明的该方面，疏水基团和阳离子基团之间的距离应该至少有一个丙基长；比丙基长度短的连接体基本上在测定的特定条件下无效(见下面的表2)。因此，具有大约3-5个碳原子长度的连接体是优选的(5-9埃，更优选6-8埃)，但是包含一个丙基连接体长度(约6.5埃)的化合物最有活性。比一个丁基连接体的长度长的连接体导致测试的特定条件下比带有丁基连接体长度连接体的相应的化合物更小有效性的化合物(表2)。更优选的是保持正确距离的支链连接体；在该项测试中这样的连接体一般比相应的直链连接体更具活性，只要它们仍然保持5和9埃之间(最佳地约6.5埃)的正确的连接体长度。
因此，一方面，本发明的化合物具有下面的结构式F1-L-F2并且F1选自 其中R1，R2，R3是相同或不同的，并且各自独立地选自氢，卤素，甲氧基和硝基；L是一个具有5-9埃长度的直链或支链烷基；和F2是一个仲胺或叔胺。在其它方面，F2是二甲胺，二乙胺，二甲醇胺，甲基哌嗪或吗啉。例如，F2可以是选自下面的胺 其中R4是-O-CH2-CH3或H。
下面提供了本发明各种化合物的化学结构。发现这些化合物中的每一个在至少一个突变体p53DBD中在接近生理温度下显著增强p53构象敏感表位的稳定性。
1.吖啶类
3.酚噻嗪类(Phenothizoles)
根据这里所述一般设计原理，在实施本发明中，下面各组的化合物是优选的 其中，对于第I组， R5是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，或(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R6是is(a)(C1-C6)烷基或(C2-C8)链烯基，各自任选被一个或多个苯基取代，或者(b)被卤基，(C1-C6)烷氧基取代的苯基；和R7和R8是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；其中对于第II组， R9是(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；其中对于第III组， R10是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R11和R12是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；其中对于第IV组， R13是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和
R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，(C5-C9)杂芳基，(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R14和R15是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；和其中对于第V组， A是碳或氮；R16是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，或者其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R17选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素。
本发明特别优选的化合物包括下面11种化合物 (1-苄基-哌啶-4-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 [2-(4-氯-苯基)-乙基]-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (3-吩噻嗪-10-基-丙基)-二氢苯并噻喃-4-基-胺 -(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (7-乙氧基-1，2，3，4-四氢-萘-2-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 N’-(9-氟-苯并[c]吖啶-7-基)-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二-胺 N’-吖啶-9-基-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二胺 2-{4-[4-(苯并[g]喹啉-4-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-基}-乙醇
N4-{2-[2-(4-溴-苯基)-乙烯基]-7-氯-喹唑啉-4-基}-N1，N1-二乙基-戊烷-1，4-二胺 N-苯并[g]喹啉-5-基-N’-环己基-丙烷-1，3-二胺 2-[(2-羟基-乙基)-(3-{2-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙烯基]-喹唑啉-4-基氨基}-丙基)-氨基]-乙醇发明的有机非肽化合物可以应用常规方法合成。
本发明的化合物和在本发明方法中使用的化合物还包括促进p53家族的蛋白质的野生型活性的化合物的前药。前药是当对受试者哺乳动物(特别是人)施用时以显著和有效量转化为活性分子的化合物。
本发明的化合物可以是游离酸，游离碱或者其药物有效碱的形式。这样的盐可以容易地通过用合适的酸处理一种化合物来制备。这样的酸包括，例如但不限于，无机酸，例如氢卤酸(盐酸，氢溴酸等)，硫酸，硝酸，磷酸等；和有机酸，例如乙酸，丙酸，2-氧代丙酸，丙二酸，丁二酸等。相反，通过用碱处理可以将盐转化为游离碱。
B.治疗终点和剂量通过本发明方法鉴定的化合物用于治疗与构象不稳定或错折叠的蛋白质相关的疾病。与构象不稳定或错折叠的蛋白质相关的疾病是已知的并且包括囊性纤维化(CFTR)，Marfan综合症(原纤蛋白)，肌萎缩性侧索硬化(超氧化物歧化酶)，坏血病(胶原)，槭糖尿病(α-酮酸脱氢酶复合物)，成骨不全(1型原胶原原-α)，Creutzfeldr-Jakob疾病(朊病毒)，早老性痴呆(β-淀粉状蛋白)，家族淀粉样变(溶菌酶)，白内障(晶体蛋白)，家族高胆固醇血症(LDL受体)，α1-抗胰蛋白酶不足，Tay-Sachs疾病(β-hexosaminidase)，色素性视网膜炎(视紫红质)，和矮妖精貌综合征(胰岛素受体)。当然，这里描述的方法和化合物特别用于治疗癌症，尤其是用于治疗与突变体p53基因相关的癌症。
本领域技术人员将明白，从医疗人员或患者角度，不期望的与疾病状态特别是癌症状态相关的症状(例如疼痛，敏感性，体重减轻，等等)的基本上所有的减轻或预防是所期望的。另外，关于癌症状态，任何肿瘤体的缩小或生长速度的减缓都是所期望的，并且期望肿瘤的组织病理学照片的改善。因此，为了该中请的目的，这里使用的术语＂治疗＂，＂治疗用途＂或＂药物用途＂应该指要求保护的无论用什么方法治疗一种疾病状态或症状，或者防止，阻止，阻碍或者反转疾病或其它不期望的症状的组合物的任何和所有的用途。
可以通过常规方法确定有效的剂量和治疗方案，对试验动物用低剂量开始，然后将剂量渐增同时监测效果，并且系统改变剂量给药方案。动物研究，优选哺乳动物研究，通常用来确定每千克体重最大耐受剂量或生物活性物质的MTD。本领域技术人员有规律地推断有效同时避免对其它物种包括人的毒性的剂量。
在进行对人的药效研究之前，对正常受试者的I期临床研究有助于确立安全剂量。当决定对于给定患者的最佳剂量时医生要考虑多种因素。其中首先是选择的异源基因产物的毒性和半寿期。其它因素包括患者体重，患者年龄，患者的一般状况，要治疗的具体的癌症，疾病的严重程度，患者体内存在的其它药物，基因产物的体内活性等等。在考虑了动物研究和临床文献之后选择试验剂量。
正如下面通过实际工作实施方案证明的，200mg/kg/天的剂量对于抑制和/或退化人癌症的动物模型中肿瘤生长是高度有效的。以该结果为基础用于治疗癌症的化合物X的典型的人用剂量是0.1至10g/天，静脉内注射或者直接注入肿瘤体或者口服给药，取决于患者状况。对于具有不同水平药效和/或毒性的化合物，这些值当然相应地改变。另外，每天可以增加两次或几次剂量。
在本发明中使用的化合物也可以配制成用于延长和持续给药的缓释埋入装置。这样的缓释制剂的例子包括生物相容聚合物例如聚(乳酸)，聚(乙酸-共聚-乙醇酸)，甲基纤维素，透明质酸，胶原等的复合物。在一些公开文献中综述了药物送递赋形剂中可降解聚合物的结构，选择和应用，包括A.Domb等，用于先进技术的聚合物(Polymersfor vanced Technologies)3279-292(1992)。在药物制剂中选择和应用聚合物的另外的指南可以参见文献M.Chasin和R.anger(编著)，作为药物送递系统的生物可降解聚合物(＂BiodegradablePolymers as Drug Delivery Systems＂)，药物和制药科学(＂Drugs ande Pharmaceutical Sciences＂)，Vol.45，M.Dekker，纽约，1990，和美国专利5573528，Aebischer等(1996年11月12日公开)。
特别是在涉及体内使用情况下，本发明的各种生物化学成分优选高度纯化并且基本上没有潜在的有害污染物(例如至少国家食品(NF)级)，一般至少分析级，优选至少药物级)。在使用前必须合成给定化合物的程度，这样的合成或接下来的纯化应该优选生产基本上没有潜在的在合成或纯化过程中使用的有毒物质的产物。
对于对受治疗者治疗癌症状态中的用途，本发明在其一方面还提供了灭菌装填的小瓶或安瓿形式的试剂盒或包装，含有证明在本发明方法中有效的一种化合物。在一个实施方案中，所述试剂盒含有本发明的一种化合物，例如化合物Y，化合物X或化合物Z，作为即用型直径，或者是单位剂量或者是多剂量，其中包装中加入了说明治疗癌症的成分的使用标签。或者，根据本发明的另一个实施方案，所述包装提供了含有这样一种化合物的灭菌装填的小瓶或安瓿。
C.药物发现方法筛选与p53家族蛋白质特别是p53DBD相互作用，和/或影响其野生型活性的化合物的每一个或所有步骤经得起对于候选化合物的高通量测定分析。高通量筛选是本领域已知的并且可以用各种各样的形式进行。例如，ELISAS，闪烁亲近测定法技术，竞争结合测定和置换结合测定是有用的形式。实验自动化，包括机器人技术，可以大大缩短筛选大量化合物需要的时间，并且可以从例如，Tecan，Scitec，Rosys，Mitsubishi，CRS Robotics，Fanuk，和Beckman-Coulter Sagian等几个公司购得。鉴定了候选化合物之后(或者在它们鉴定的同时)，可以进行第二次筛选来测定该化合物对p53家族蛋白质的活性的细胞和/或体内作用1.本发明的方法和组合物靶向的p53家族蛋白质p53在真核生物中普遍存在。因此，在本发明的方法和组合物中使用的p53蛋白和p53DBD可以来自，或者产生于任何真核细胞，包括真菌(例如，酿酒酵母)(Saccharomyces cerevisiae)，昆虫(例如，果蝇(Drosophila)和哺乳动物(例如，小鼠和/或人)，但是人p53蛋白是优选的。已经鉴定了具有相关结构和功能的另外的哺乳动物p53类似物，特别是p63和p73；也可以在本发明的方法和组合物中使用这样的p53家族蛋白质和例如它们各自的DBD。另外，还没有发现的p53家族蛋白质(根据这里定义的)也可以在本发明的方法和组合物中使用。
如上所述，p53蛋白包含至少三个不同的结合域位于氨基末端的转录激活结构域；中心DBD；位于羧基末端的寡聚作用结构域。另外，一个负调节结构域出现在该蛋白质的羧基末端。大多数与人癌症相关的p53错义突变发生在DBD。本发明的方法和组合物涉及稳定任何这样的错义突变体的构象。特别优选的靶物是包含一个或多个在175，245，248，249，273和282位点残基处突变的称之为＂热点＂的突变体p53(就人p53序列给出了所有的残基位置；通过与人序列的同源性对比可以容易地测定来自其它生物体的p53蛋白中类似残基位置)。p53中其它常见突变发生于132，135，138，141，143，146，151，152，154，157，158，159，163，173，176，179，186，194，196，213，220，237，238，241，242，258，266，272，278，280，281，285和286；这些也是本发明的靶物。此外，下面以工作实施例详细说明本发明，证明下面突变体p53蛋白的构象稳定化作用143A，173A，175S，241D，249S和273H。
与p53蛋白特别是p53蛋白的DBD中错义突变相关的癌症包括但不限于结肠直肠癌，膀胱癌，肝细胞癌，卵巢癌，肺癌，乳腺癌，头颈鳞状细胞癌，食道癌，甲状腺癌，和神经原性肿瘤，例如星形细胞瘤，神经节细胞瘤和成神经细胞瘤。用本发明方法和化合物可以治疗上述癌症和其它癌症。
p53DBD大约位于氨基酸残基100-300。证明对于DNA结合，残基102-292的抗蛋白酶解核是足够的，并且p53DBD结晶结构已经查明残基94-312(Cho等，1994，Science 265，346；Friend，1994，Science 265，334)。因此，对于在本发明方法中的应用，p53DBD结构域的N-末端可以自残基50-110开始，并且优选从残基94-102之间的某一个位点起始。p53DBD的C-末端可以在残基286-340终止，并且优选在残基292-312之间终止。
＂p53的热力学不稳定突变体＂是这样的突变体，它不保留p53的功能性质的一种或多种，例如在生理温度(即37℃左右)下DNA结合，但是在低温下或者在其它条件下恢复这样的功能。例如，通常遇到的所有突变体在低温下恢复体外结合DNA能力(Friedlander等，1996，上文)。
2.测试形式a.结合测试形式用来鉴定简单结合p53家族的蛋白质的DBD的化合物的测定原理涉及在足以使两种成分相互反应并结合的条件和时间下制备DBD蛋白质和试验化合物的反应混合物，这样生成一种复合物，其可以在反应混合物中去除和/或检测。使用的DBD物种可以根据筛选测试的目的而不同。例如，探索与特定结合结构域作用的化合物，可以使用包含结合结构域的p53家族的全长蛋白质，DBD本身，或者包含在测定系统中提供有益效果的融合一种蛋白质或多肽的DBD的融合蛋白(例如，标记得到的复合物的分离等)。在本技术中使用的来自DBD的肽应该包括DBD的至少6个连续的氨基酸，优选10个连续的氨基酸，更优选20个连续的氨基酸，更优选30个甚至50个连续的氨基酸，或者更多。
所述筛选测试可以通过各种各样的方法进行。例如，进行这样一种测试的一种方法涉及将DBD蛋白质，多肽，肽或融合蛋白或试验物质固定到固相上，并且在反应终止时检测固定在该固相上的DBD/试验化合物复合物。在这样一种方法的一个实施方案中，DBD反应物可以固定在固体表面，没有固定的试验化合物可以被直接或间接地标记。可以使用各种各样的合适的标记系统，包括但不限于放射性同位素例如125I和32P，当暴露给底物时产生可检测热信号或光的酶标记系统，和荧光标记。在该方法的另一个实施方案中，固定在固相上的一种DBD蛋白与标记的抗体复合。然后，对一种试验化合物测试其干扰DBD/抗体复合物缔合的能力。
实际上，微量滴定板可以方便地被用作固相。固定的成分可以通过非共价或共价连接固定。非共价连接可以通过简单地用蛋白质的溶液包被固体表面并且干燥来实现。或者，对要固定的蛋白质特异性的一种固定化抗体，优选一种多克隆抗体，可以用来将蛋白质固定到固体表面。可以先制备表面并且贮存。
为了进行该测试，向含有固定化成分的包被的表面加入非固定化成分。反应完全后，在形成的任何复合物保持固定在固体表面上的条件下去除未反应的成分(例如通过洗涤)。可以用多种方法实现对固定在固体表面上的复合物的检测。在事先先标记非固定化成分情况下，在表面上检测到固定化标记表明形成了复合物。在事先没有先标记非固定化成分情况下，可以用间接标记来检测固定在表面上的复合物；例如，使用对事先没有固定化的成分特异性的标记抗体(该抗体，接着，可以用标记的抗-Ig抗体直接标记或间接标记)。
在另一个实施方案中，可以不使用直接或间接标记来检测结合作用。例如，可以测试当发生结合时改变的生物物理性质。对于这样的筛选特别有利的一种固体载体系统是BlAcore 2000TM系统，可以从BlAcore，Inc.(Piscataway，NJ)购得。The BIAcoreTM仪器(http//www.biacore.com)利用了表面细胞质基因组共振(SPR)对监测生物特异性相互作用的实时光学现象。SPR效应基本上是受金属-液体界面折射指数的局部变化影响的短暂的电场。传感器芯片由玻璃和羧甲基葡聚糖基质之间的金箔这三层组成，要测试的配体或蛋白质与羧甲基葡聚糖基质化学键连。该传感器芯片安装在流体筒上形成流动细胞，通过该元件可以注入分析化合物。根据从芯片表面反射的偏振光束角的变化测定该传感器芯片上配体-分析物相互作用。任何物质与该芯片的结合影响金/葡聚糖层中的SPR。金层中电场的该变化与反射光束相互作用并且改变与结合的物质质量成正比的反射角。在二极阵列上检测反射光并且翻译成表示为响应单位的结合信号(RU)。因为该响应直接与结合的质量成正比，可以测定蛋白质-蛋白质相互作用的动力学和平衡常数。
或者，反应可以在液相中进行，将反应产物与未反应成分分离，并且检测复合物。
b.测定p53家族蛋白质的构象的方法可以用多种不同的方法测定p53蛋白的构象。例如，可以使用抗体来探测p53 DBD的构象。本发明优选的方法使用单克隆抗体，它们对p53和/或p53DBD的活性(例如，DNA结合)或失活(热动力学不稳定的，或错折叠的或未折叠的)构象是特异性的。例如，mAb1620识别p53DBD上的表位，该表位与p53蛋白肿瘤抑制剂活性相关。Ball等，1984，EMBO J.31485-1491；Gamble等，1988，病毒学(Virology)162452-458。这样当其采纳失活构象时，mAb1620将不结合p53DBD。相反，当p53被突变灭活或者野生型p53变性时，mAb240识别的表位暴露出来(Bartek等，1990，致癌基因(Oncogene)5,893-899；Stephen等，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)225，577-83)。在本发明方法中也可以使用已知的或者还没有发现的构象特异性的其它单克隆抗体。这样的抗体是有用的，因为它们容易采用高通量筛选。制备抗体包括单克隆抗体的方法是本领域公知的。
测定p53家族蛋白质例如p53或p53DBD的构象的其它方法包括但不限于染料的吸收，光谱(例如，圆二色性，NMR)，大小排阻层析，超离心，特异性DNA结合(例如，在与低温相对的生理温度下)，和特异性蛋白质结合(例如，只与野生型激活构象结合而不与失活构象结合的SV40大T抗原)。
如上所述，很多常常遇到的p53突变体在生理温度下不能结合DNA，但是在低温下将结合DNA。因此一方面，在试验化合物存在下测定p53家族蛋白质的构象是温度依赖性的。优选地，在生理温度(大约38℃)下测定构象；合适的范围在20℃和50℃之间，更优选在35℃和42℃之间。也可以随时间测定靶物蛋白质的构象，从几分钟至几小时或更多。当在筛选中使用野生型p53蛋白质或p53DBD时，一般比使用突变体p53DBD时加热的时间更长并且在更高的温度下。本领域技术人员利用这里提供的信息容易确定合适的温度。
另外，人们可以同时测定化合物的结合和p53家族蛋白质的构象中的任何变化两者。在这样一项测定中，可以将在一种试验化合物存在下p53家族蛋白质的构象的一次变化评分为一次命中。下面以非限制性实施例详细说明高产率筛选，对与p53DBD相互作用的化合物的测定引起一次构象变化。这些高产率筛选能鉴定一类在本发明方法中使用的化合物。在接近生理温度下，这些化合物增强了野生型和各种突变体p53蛋白质上对mAb1620构象敏感表位的稳定性。低微摩尔浓度的化合物暂时增强活细胞中表位的稳定性并且使突变体p53激活转录。如下面更详细的描述，当用突变体p53对带肿瘤的小鼠给药时，有机非肽化合物调节p53构象和功能，并且用天然突变的p53明显抑制人肿瘤异种皮移植的生长。
C.以细胞为基础的和以动物为基础的测试一旦应用上述第一次筛选鉴定了候选化合物，一般就进行以细胞为基础的和以动物为基础的测试来测定候选化合物在这些系统中的作用。初始的测试涉及得自携带编码p53家族蛋白质的突变基因的肿瘤的细胞系，或者被操作来表达p53家族突变蛋白质的细胞系。评价候选化合物对p53家族蛋白质的任何一项(或所有的)野生型活性的影响。例如，在候选化合物的存在下诱导WAF1表明化合物通过促进特异性DNA结合性质而不是普遍的结合性质而在突变体p53中保持了功能。可以检查p53或p53家族蛋白质的其它成员正调节或负调节的任何基因。p53家族蛋白质的其它活性包括生长抑制和编程性细胞死亡。在组织培养细胞中通过显微镜或者通过菌落生成测试容易评价生长抑制。通过TUNEL染色或者碘化丙锭染色和流式细胞仪可以目测编程性细胞死亡。
另外，可以使用以动物为基础的模型对候选化合物筛选毒性和药效。例如，可以在动物模型中诱导携带突变体p53的肿瘤，并且对该动物施用候选化合物。评价毒性和肿瘤生长或抑制。下面提供了这样的筛选的一个工作实施例。
3.用于筛选的化合物的来源可以根据本发明筛选的化合物包括但不限于能获得进入细胞并且影响p53家族蛋白质的活性的小有机分子。可以从公司购买多种化合物库，所述公司例如Pharmacopeia，Arqule，Enzymed，Sigma，Aldrich，Maybridge，Trega and PanLabs，这只是其中的几个来源，人们也可以筛选已知化合物的库，对于与p53 DBD相互作用的化合物来说，包括天然产物和合成的化合物，和生物活性材料，包括蛋白质。但是，优选的化合物不是蛋白质或肽(即，通过肽键连接的3个或多个氨基酸的链)。抗体是免疫球蛋白或者免疫球蛋白的抗原结合片段的肽；优选的化合物也不是抗体。下面描述学本发明方法中使用的化合物的具体类型和实施例。
一旦鉴定了促进p53家族蛋白质野生型活性的化合物，可以利用分子模型技术来设计更有效的化合物的变体。分子模型系统的实施例是CHARM(Polygen Corporation，Waltham，MA)和(QUANTA programsMolecular Simulations Inc.，San Diego，CA)。CHARM执行能量减小和分子动力学功能。QUANTA执行分子结构的构建，结构模拟和分析。QUANTA使得分子相互之间相互作用构建，修饰，成形和分析。
例如，一旦鉴定了促进p53家族蛋白质野生型活性的化合物，可以利用该化合物来提出假设。正如下面将详细描述的，一个优选的假设是平面多环疏水性基团，其与极性胺间隔大约5-9埃，更优选6-8埃。利用程序Catalyst(Molecular Simulations Inc.，San Diego，CA)可以从任何一种本发明的化合物提出这样一种假设。此外，Catalyst可以利用该假设来检索专利数据库，剑桥小分子数据库(Cambridge，英国)，以及上文提到的其它数据库，来鉴定本发明化合物的另外的例子。
本发明的化合物可以进一步被用来利用模拟软件包设计更有效的变体，例如Ludi，Insight II，C2-Minimizer and Affinity(Molecular Simulations Inc.，San Diego，CA)。一种特别优选的模拟软件包是MacroModel(Columbia University，NY，NY)。
本发明的化合物可以进一步被用作开发合理组合库的基础。这样一种库可以筛选更有效的化合物。组合库的本质取决于一些因素，例如从本发明的优选化合物选择特殊化合物来构成该库的基础，和期望使用一种树脂来合成该库，要认识到本发明的化合物提供了适合组合设计程序例如C2-QSAR(Molecular Simulations Inc.，San Diego，CA)的必要数据。
以详细说明而非限制性提供下面的实施例描述本发明。
VI.实施例1p53DBD热稳定性测试开发使用野生型p53DBD的高通量测试。应用该测试筛选药物化合物，并且对稳定DBD的活性构象的那些化合物记分为命中。
A.材料和方法热稳定性测试。根据(Pavietich等，1993，基因和发育(Genesand Dev.)7，2556-2564；Bullock等，1997，上文)所述从野生型和突变型p53蛋白和FLAG-标记p53DBD制备重组DBD(残基94-312)。使用的突变蛋白是143A，173A，175S.249S，和273H。测试了多种小分子有机化合物。以10mg/ml将化合物原料溶解于DMSO并且在使用前稀释。在含有25mM HEPES，pH6.8，150mM KCl，10mM二硫苏糖醇的缓冲液中稀释该蛋白质(0.25-1.0ng/孔)，并且50μl在冰上接触ReactiBind微量滴定板(Pieree)35分钟。用25mMHEPES，pH6.8，150mM KCl冲洗孔，加入化合物或稀释的DMSO赋形剂，板在指定温度下温育。通过将孔置于冰上终止温育；进行ELISA测试，同时将板保留在冰上以避免表位的进一步改变。在加入第一抗体之前用冷的HEPES/KCl缓冲液中的5％脱脂奶(Difco)将孔封闭1小时。以1∶100-1∶250在HEPES/KCl中稀释单克隆抗体mAb1620，mAb240(Calbiochem)和抗-FLAG M2抗体(Eastman KodakCompany)，并且以100μl/孔加入30分钟。这些板用冷的HEPES/KCl缓冲液冲洗两次并且与辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的抗-小鼠IgG(Boehringer Mannheim)温育另外30分钟。使用TMB显色剂(Pierce)显示HRP信号并且在BioRad微板读数器上在450 nm处读取信号。
B.结果p53DBD的构象是不耐热的。mAb1620识别的表位是构象依赖性的，它在p53上存在与蛋白质肿瘤抑制剂活性密切相关(Ball等，1984，上文； Gamble和Milner，1988，上文)。相反，mAb240识别的表位是线性表位，当p53被突变灭活或者当野生型p53变性时，其是暴露的(Bartek等，1990，致癌基因(Oncogene)5，893-899；Stephen和Lane，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)225，577-583)。重组人p53DBD(残基94-312)体外经历了从活性至失活构象的转变，逐渐失去1620表位同时蓄积240表位。在微量滴定板上固定的纯化的p53DBD被加热至接近生理温度并且在ELISA测试中用mAb1620探测。1620表位以温度和时间依赖方式失去(图1A)。1620表位的失去与构象的失去特异性相关，因为与DBD连接的FLAG表位完全保持稳定(图1B)。此外，1620表位的失去与240表位增强的出现协调一致发生，使人相信1620表位的失去反映出p53DBD中的构象变化而不是固定化蛋白质的失去。
野生型p53DBD上1620表位的半寿期在23℃下大约是35分钟并且在更高的温度下逐渐缩短至在45℃下小于5分钟(图1A)。平行地，在凝胶迁移试验中p53DBD的DNA结合能力在溶液中加热时降低(没有给出数据)。37℃下野生型p53DBD上1620表位的半寿期大约是143位点突变体DBD的两倍(图1C)。该项发现与先前对于几种其它突变体p53蛋白的降低的热力学稳定性的报道相一致，并且确信1620表位可以用来监测p53DBD的构象(Bullock等，1997，上文)。
化合物稳定p53构象。利用ELISA测试来鉴定稳定活性p53构象并且使突变蛋白更好地保持野生型功能的化合物。几种化合物在生理温度下抑制对于mAb1620的表位的损耗(例如参见图2A)。通过测定稳定50％对于mAb1620的表位需要的浓度的滴定实验中确定化合物的相对效力。活性化合物以剂量依赖方式稳定表位(图2B)。DMSO溶剂和活性化合物的几种类似物不能稳定(图2B，见表1和2)。如同来自几种突变体p53蛋白的DBD一样，化合物也稳定全长野生型p53(没有给出数据，图2C)。在化合物的存在下，突变蛋白和不存在化合物的野生型蛋白质一样稳定。
这些化合物保留对于mAb1620的表位的同时，它们不恢复已经损耗的表位的p53。例如，当在加入化合物Y之前加热p53 DBD时mAb1620反应性没有提高。尽管化合物的存在降低了表位损耗的速度，但是延长的加热导致1620-正构象最终损耗。此外，该化合物不表现出可逆性结合p53，因为在37℃下温育之前加入和洗出化合物Y不阻止表位的损耗(没有给出数据)。这些发现与p53DBD和化合物的相互作用使得该蛋白质更稳定地保持mAb1620识别的功能构象的模型相一致。
活性化合物的结构。鉴定的所有活性化合物通过一个特定长度的连接物将一个疏水基团(平面多环)和一个阳离子基团(经常是一个胺)连接在一起。在疏水位置(R1)的苯并咪唑，苯并喹啉，吩噻嗪，和苯乙烯基喹唑啉是活性的，而这些基团和简单的双环或单环基团的微妙变化在实验的特殊条件下是没有活性的(表1)。如果稳定50％对于mAb1620的表位需要的化合物的量的两个匹配对(见表1)之间的差异大于10倍时，在该项测试中化合物称为“活性的”。因此，应该注意到，在该项测试中称为没有活性的化合物不绝对是没有活性的，只是相对没有活性。因此，活性阳离子基团(R2)包括二甲基胺，二乙基胺，二乙醇胺，甲胺，甲基哌嗪，和吗啉(表1)。当在吩噻嗪系列中测试时，一些更大的胺相应地更具活性。在R2位置带负电荷或者不带电荷的基团例如羧基或苯基根据在该项测试中确定的没有活性(表1)。R1和R2基团之间的间距对于在该项测试中化合物的活性也是重要的，因为比丙基长度短的连接物降低相对化合物活性(表2)。丁基连接物比丙基连接物能力稍微小一些，而在该项测试中其中存在更长连接物的化合物表现出更小活性(表2，没有给出数据)。保持正确距离的支化连接体一般比相应的线性连接物更具活性。
这些一般性发现不限制本发明的范围，而是可以在实施本发明中使用来设计其它分子。
表1活性对化合物的结构特征的依赖性 *活性和没有活性指匹配的化合物对的效力差别＞10倍。在滴定实验中通过稳定50％对于mAb1620的表位需要的化合物的量确定相对效力。
表2活性对R1和R2基团之间的间距的依赖性 *在45℃加热30分钟的0.5ng的p53DBD上保存50％的对于mAb1620的表位需要的化合物的浓度。
C.讨论这些结果证实恢复突变体p53功能和开发抗癌治疗的新的策略的原理的证据。该实施例报道了能对分离的DBD起作用来促进其构象稳定性的第一类化合物的发现。
VII.实施例2测定细胞和肿瘤中p53构象在该实施例和下面的实施例中，证明原型化合物在低微摩尔浓度下起作用，在活细胞和肿瘤中调节突变体p53，并且抑制自然携带突变的p53的肿瘤的生长。
A.材料和方法细胞培养.从ATCC获得所有的细胞系，并且在含有10％胎牛血清的推荐的培养基(Gibco BRL)中培养。
p53构象的测定。将大约1×107H1299/报道子+突变体p53细胞处理过夜，用冷的Tris缓冲盐水淋洗三次，并且在1.5ml of低渗溶胞缓冲液(20mM HEPES，pH7.4，10mM NaCl，20％甘油，0.2mM EDTA，0.1％Triton-X 100，10mM含有蛋白水解酶抑制剂的二硫苏糖醇)中裂解。4℃下以2000rpm离心5分钟使细胞在微离心管中成丸状，通过将该丸状物再次悬浮于含有0.5M NaCl的相同的缓冲液中制备细胞核提取物。在Dounce匀浆器中用三体积的上述含有0.5MNaCl的缓冲液将肿瘤样品匀浆。通过在4℃下以10000rpm离心10分钟使细胞裂解液澄清。根据从使用mAbDO-1抗体和p53的蛋白质印迹定量的使细胞核提取物的p53含量标准化并且捕获到MaxiSorpF96平板(Nunc)的孔中，所述MaxiSorp F96平板已经在4℃下用mAbDO-1以0.05M碳酸缓冲液，pH9.6中1μg/ml的浓度包被过夜。这些孔用冷的PBS洗涤，在4℃下用4％脱脂奶的PBS溶液封闭3小时，并且使用脱脂奶中HRP-偶联的mAb1620抗体探测。在冰上将抗体温育1小时，然后用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤三次，并且使用TMB底物显示信号。利用裂解物随温度变化的表达大量1620-阳性p53的(32℃)H1299/报道子+突变体p53细胞作出标准曲线。样品的量在标准曲线的线性范围内，并且在每一个样品校正总的p53和在未处理的裂解物中校正1620-阳性p53级份。
B.结果细胞中构象的稳定化作用。使用专门地表达突变体p53的活细胞测定化合物稳定细胞p53的1620-正构象的能力。H1299细胞，其不存在p53，用来自肿瘤的突变体p53(173位点)转染，并且在蛋白质印迹中使用非构象敏感性p53抗体(mAbDO-1)来筛选表达大量该突变蛋白的克隆。在从转染子获得的提取物中检测到具有对于mAb1620的表位的低稳定状态水平的p53，证明小部分的突变体p53可以保持活性构象(Chen等，1993，致癌基因(Oneogene)8，2159-2166)。低微摩尔浓度的化合物X将细胞中1620阳性p53的稳定状态部分增加大约5-倍(图3A)。在处理后4-6小时表位富集达到最大水平。根据通过与mAbDO-1反应性测定的总量的p53没有改变，所述mAbDO-1针对位于该蛋白质的氨基末端的非构象敏感性表位。
C.讨论这些结果证明通过本发明方法鉴定的稳定构象的化合物可以在活细胞中稳定p53的活性构象。在肿瘤中恢复突变体p53的化合物可以靶向总的非功能p53集合或者靶向具有对于mAb1620的表位的p53子集。这里描述的化合物的关键靶物看起来是新合成的仍然保持活性构象的突变体p53。事实上，化合物增强1620表位的持久性，但是不能恢复在体外加热之前就损耗的1620表位。增强在新合成的p53上的活性构象的稳定性的化合物将使以时间依赖性方式累集功能p53的稳定状态水平。观察到的细胞中实现最大1620表位增强的4小时延迟与该假设相一致(图3A)。
VIII.实施例3p53功能的恢复A.材料和方法。用编码突变体p53蛋白(173A，249S)和新霉素可选择标记物的表达质粒和使用DOTAP阳离子脂质转染-试剂(Boehringer Mannheim)或磷酸钙转染细胞。也用编码潮霉素抗性标记和p53报道基因的质粒转染细胞，所述报道基因由置于驱动荧光素酶基因的SV40基础启动子上游的相应于单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的启动子区中的p53结合序列的p53结合序列的4个拷贝组成(GenBank登记号S57428胸苷激酶碱基编号26-58，其以序列GCCTTGCCT开始并且以序列TGCCTTTTC终止)。通过携带突变体p53表达的另外的构建体的报道构建体转染细胞的克隆来制备匹配的细胞对。选择转染的克隆用于在根据需要在含有潮霉素或G418的培养基中培养。用化合物处理96-孔组织培养平板(Costar)中的细胞单层，并且利用底物转化测试(Promega)和利用Dynatech微量板发光计定量测定荧光素酶活性。
WAF1和p53表达。将培养的细胞处理21小时，用冷的Tris缓冲盐水冲洗三次，敲碎，并且以10,000rpm离心30秒沉积，然后将它们再悬浮于50mM HEPES，pH7.5，0.1％NP40，250mM NaCl，5mM EDTA，50mM NaF，1mM DTT，50μg/ml抑肽酶，1mg/ml Pefabloc(Boehringer Mannheim)。使用Bradford试剂(BioRad)测定蛋白质浓度，并且将5或10μg的细胞裂解物加载到8-16％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶(Novex)上。将蛋白质转移到含有20％甲醇的Towbin’s缓冲液(Towbin等，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)76，4350)中的Immobilon P膜(Millipore)上。将膜分成32.5和47.5kDa之间分子量标记物两部分，并且在室温下在SuperBlock(Pierce)加3％脱脂奶中封闭1小时。使用单克隆抗体EA 10(Calbiochem WAF I Ab-1)WAF 1表达，并且用mAbDO-1(Calbiochem p53 Ab-6)对印迹的上一半探测总的p53表达。用含有0.1％Tween 20的Tris缓冲盐水将印迹淋洗1小时，三次更换洗涤液，然后加入第二抗体，HRP-偶联的抗-小鼠IgG。使用RenaissanceECL(DuPont)观察泳带并且暴露给Hyperfilm ECL(Amersharn LifeScience)。
B.结果在细胞中恢复p53功能。为了测定p53构象的稳定性是否导致更好地保留野生型功能，我们检查了p53的序列特异性转录活性。用p53可诱导的荧光素酶报道基因转染H1299细胞，并且用突变体p53第二次转染稳定的克隆(HI299/报道基因)，获得表达报道基因和173位点突变p53两者的匹配克隆(H1299/报道基因+突变p53)。通过报道基因诱导测定化合物增强的突变体p53的转录活性(图3B)。在H1299/报道基团细胞中观察到低水平的转录激活，这是可能由于存在p53同系物，p73(没有给出数据)。尽管我们还没有确定这些化合物是否能增强p73活性，广泛的p53依赖性增强报道基因诱导提示p53是这些细胞中主要的靶物。由于细胞分离限制了作为较高剂量下化合物的效力，在相对小的浓度范围内发生报道基因p53-依赖性激活。处理后12-16小时转录活性的增强达到最大(没有给出数据)。该观察与处理后4-6小时发生的功能p53构象稳定化作用之后作为次级事件发生的报道基因表达相一致。
在报道基因诱导测试中化合物Y优于化合物X。这可能归因于涉及DNA损伤并且导致p53蛋白质水平提高的化合物Y的第二作用(图3B)。化合物Y，而不是化合物X，在细胞活性需要的浓度下提高总的p53蛋白质水平。为了确认DNA损伤不只是负责化合物Y对p53报道基因的诱导，我们测定了DNA损伤剂阿霉素的作用。尽管阿霉素有在细胞中诱导突变体p53蓄积的能力(没有给出数据)，但是在宽浓度范围内(0.4-40μg/ml)阿霉素不诱导报道基因。这些结果证明构象稳定化作用，而不是突变体p53的蓄积，可以促进特异性转录活性。特别地，化合物X，其不提高总的p53蛋白质的稳定状态水平，表现出通过构象稳定化作用独特地恢复p53转录功能。
在突变体p53的存在下化合物X正调节WAF1，一种p53-响应性细胞基因产物。用突变体p53表达载体转染不表达p53的Saos-2骨肉瘤细胞，并且分离表达两个突变体之一的克隆(173位点或249位点)。与亲本Saos-2细胞相比，这些克隆表达更低基础水平的WAF1，可能反映出我们对较快生长克隆的选择。用化合物X将这些细胞处理16小时并且在蛋白质印迹上对代表等量蛋白质的裂解物分析p53和WAF1。不是亲本Saos-2细胞的表达两种突变体p53蛋白质之一的细胞经处理提高了WAF1的表达水平(图4)。这些裂解物中p53蛋白质的总量基本上没有变化。阿霉素在携带突变体p53的Saos-2细胞中不诱导WAF-1表达，但是它在表达野生型p53的U20S细胞中确实提高了WAF-1表达(没有给出数据)。
C.讨论这里描述的稳定构象试剂的作用模式明显与对于传统的细胞毒性抗肿瘤药物所发现的不同。在癌症化疗中使用的细胞毒性药物在携带突变体p53的细胞中一般是无效的(Lowe等，1993，Nature 362，847-849；O’Connor等，1997，癌症研究(Cancer Res.)57,4285300)。事实上，DNA损伤物质，阿霉素，在我们的试验中不恢复突变体p53的转录活性。通过在正常细胞和肿瘤细胞中总p53蛋白质的显著诱导也证明细胞毒性化合物。化合物X在细胞或肿瘤中不诱导总p53蛋白质水平。因为p53诱导是细胞DNA损伤的敏感量度，在有效浓度下化合物X可以损伤DNA是不可能的。总而言之，我们的发现表明通过一种DNA损伤-非依赖性机理可以发生1620正构象的稳定化作用和突变体p53活性的功能恢复。
几条证据排除了对蛋白质稳定化作用的非特异性作用。甘油，一种蛋白质变性的非特异性抑制剂，其通过置换水并且产生围绕蛋白质分子的疏水性微观环境，可以在600mM的浓度下恢复突变小鼠p53细胞中核定位(Brown等，1997，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)99,1432-1444)。在该项测试中化合物X在0.03mM时是有活性的，提示该化合物和p53之间发生涉及特异性接触的精确得多的相互作用(没有给出数据)。此外，在培养物和体内在大量其它蛋白质存在下化合物X可以影响p53构象的观察(见下文)与p53的选择性识别相一致。此外，化合物与p53相互作用的本质可能不涉及与天然蛋白质的紧密结合。与处于过渡状态的小子集蛋白质分子的强的相互作用可能起作用来阻止活性构象的进一步偏向或者有利于反转为天然构象。
IX.实施例4肿瘤生长测定A.材料和方法肿瘤生长测定.用PBS洗涤培养的细胞，并且在20克雌性NU/NU-nuBR小鼠(Charles River Laboratories)的右侧腹单侧地接种在90％Matrigel(Becton Dickinson)中的1X 106A375.S2或5X106DLD1细胞。腹膜内施用含有0.1％Pluronic P-105(BASF)的盐水溶液中的化合物X。利用双脚规测定二维的肿瘤直径，并且转化为肿瘤体积(Buhus等，1986，J.Surg.Oncol.31，229-234)。
B.结果体内调节p53.化合物X在携带突变的p53的肿瘤中增强具有对于mAb1620的表位的p53级分的稳定状态水平。以100mg/Kg对携带由注射的H1299/报道基因+突变体p53细胞产生的皮下肿瘤的小鼠腹膜内施用化合物。单一剂量的化合物后杀死动物并且对肿瘤裂解物分析全和1620-阳性p53表达。根据用mAbDO-1的蛋白质印迹分析测定，总的p53水平没有变化。裂解物对总p53含量的细微变化进行标准化并在表达mAb1620的表位的ELISA检测中测定。处理后3-5小时内表位增加(图5)。体内反应的时间过程类似于培养的细胞(图3A)。
为了体内评价突变体p53的功能恢复，我们评价了来自处理和未处理动物的肿瘤中荧光素酶报道基因的表达。在给药后8小时时观察到报道基因的最大4.5-倍诱导(图5)。构象和功能响应之间的滞后可以反映荧光素酶转录体的翻译和该蛋白质的蓄积需要的时间。小鼠体内最大血浆浓度是大约10μg/ml，低于细胞中报道基因的最大诱导需要的水平(没有给出数据)。因此，与培养的细胞相比的肿瘤中的低水平的报道基因诱导可能由于次最优暴露。
C.讨论结果证明稳定构象的化合物功能上可以恢复很多随机选择的突变体。因此，本发明的方法和化合物广泛适用于不同的p53突变体。例如，DLD-1细胞中241位点突变，其影响次要的DNA接触位点，可以通过化合物X的稳定活性得以功能性补充。因此，很多种p53突变体，包括DNA接触位点处的一些，可以在活性构象的稳定化作用时得以恢复。
虽然体外稳定野生型和突变体p53两者的构象，化合物X证明体内治疗选择性。实际上，以200mg/kg/天(100mg/kg b.i.d.)连续对小鼠给药14天时观察到表现出安全而且不致死的该化合物(没有给出数据)。该选择性可能归因于与肿瘤细胞中高得多的水平相比在正常细胞中非常低稳定状态水平的p53(Lassos等，1996，EMBO J.15，4566-4573)。而且，肿瘤特异性应激反应例如DNA损害和氧或营养物缺乏可能优先启动肿瘤细胞的对p53的编程性细胞死亡作用(Chen等，1996，基因和发育(Genes and Dev.)10，2438-2451)。如果是这样，通过将稳定p53的化合物和放射疗法或基因毒性治疗相结合，可能实现协同的抗肿瘤效果。
上述说明书足以使本领域技术人员实施本发明。实际上，对于分子生物学，药学领域或相关领域的技术人员显而易见的进行本发明的上述方法的各种变化在下面的权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种促进人p53家族蛋白质突变体形式中野生型活性的方法，其中该蛋白质的一种或多种功能活性至少部分被所述蛋白质的在生理条件下保持功能构象的无能而损害，所述方法包括下面的步骤(a)使所述突变蛋白接触能在生理条件下结合所述突变蛋白中的一个或多个结构域并且稳定其中的功能构象的一种有机非肽化合物，和(b)允许所述稳定化的蛋白质与参与所述野生型活性的一个或多个大分子相互作用。
2.权利要求1的方法，其中所述蛋白质选自p53，p63，和p73。
3.权利要求2的方法，其中所述蛋白质是p53。
4.权利要求1的方法，其中所述有机非肽化合物选自 其中，对于第I组， R5是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，或(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R6是(a)(C1-C6)烷基或(C2-C8)链烯基，各自任选被一个或多个苯基取代，或者(b)被卤基，(C1-C6)烷氧基取代的苯基；和R7和R8是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；其中，对于第II组， R9是(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；其中，对于第III组， R10是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R11和R12是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；其中，对于第IV组， R13是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，(C5-C9)杂芳基，(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R14和R15是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；和其中，对于第V组， A是碳或氮；R16是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，或者其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R17选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素。
5.权利要求1的方法，其中所述有机非肽化合物结合人p53蛋白的DNA结合域，残基94-312。
6.权利要求5的方法，其中所述p53蛋白质的DNA结合域包括选自下面的氨基酸位点的错义突变残基143，173，175，241和249。
7.权利要求1的方法，其中同时进行步骤(a)和(b)。
8.权利要求1的方法，其中顺序进行步骤(a)和(b)。
9.一种对人受治疗者治疗一种与具有一种或几种减小的野生型活性的p53家族突变蛋白质的拥有有关的疾病状态的方法，包括下面的步骤(a)对受所述受治疗者施用一种能在生理条件下结合所述突变蛋白中的一个或多个结构域并且稳定其中的功能构象的有机非肽化合物，并且(b)允许所述患者内稳定化的蛋白质与参与所述野生型活性的一个或多个大分子相互作用。
10.权利要求9的方法，其中所述蛋白质选自p53，p63，和p73。
11.权利要求10的方法，其中所述蛋白质是p53。
12.权利要求10的方法，其中所述有机非肽化合物结合人p53蛋白的DNA结合域，残基94-312。
13.权利要求12的方法，其中所述p53蛋白质的DNA结合域包括选自下面的氨基酸位点的错义突变残基143，173，175，241和249。
14.权利要求9的方法，其中同时进行步骤(a)和(b)。
15.权利要求9的方法，其中顺序进行步骤(a)和(b)。
16.权利要求10的方法，其中所述疾病是癌症。
17.一种对人受治疗者治疗癌症的方法，包括下面的步骤(a)对受所述受治疗者施用一种能在生理条件下结合人p53家族蛋白中的一个或多个结构域并且稳定其中的功能构象的有机非肽化合物，并且(b)允许所述稳定化的蛋白质与参与所述蛋白质野生型活性的一个或多个大分子相互作用。
18.权利要求17的方法，其中所述蛋白质选自p53，p63，和p73。
19.权利要求17的方法，其中所述蛋白质是p53。
20.权利要求17的方法，其中所述有机非肽化合物选自 其中，对于第I组， R5是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，或(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R6是(a)(C1-C6)烷基或(C2-C8)链烯基，各自任选被一个或多个苯基取代，或者(b)被卤基，(C1-C6)烷氧基取代的苯基；和R7和R8是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；其中，对于第II组， R9是(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R2是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；其中，对于第III组， R10是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C1)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R11和R12是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；其中，对于第IV组， R13是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，(C5-C9)杂芳基，(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R14和R15是相同或不同的，并且选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素；和其中，对于第V组， A是碳或氮；R16是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)环烷基，或苯基，其中所述烷基，环烷基或苯基任选被羟基，(C3-C8)环杂烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羟基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自独立地选自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C10)杂环烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)杂芳基，(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基，或者其中所述基团任选被一个或多个羟基，卤基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)杂芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氢，吗啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；和R17选自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或选自氟，氯和溴的卤素。
21.权利要求17的方法，其中所述有机非肽化合物结合人p53蛋白的DNA结合域，残基94-312。
22.权利要求17的方法，其中所述有机非肽化合物靶向的p53家族蛋白质是野生型的。
23.权利要求17的方法，其中所述有机非肽化合物靶向的p53家族蛋白质是等位基因变异体编码的突变体。
24.权利要求1的方法，其中所述有机非肽化合物选自 (1-苄基-哌啶-4-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 [2-(4-氯-苯基)-乙基]-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (3-吩噻嗪-10-基-丙基)-二氢苯并噻喃-4-基-胺 [1-甲基-3-(2，6，6-三甲基-环己-2-烯基)-烯丙基]-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (7-乙氧基-1，2，3，4-四氢-萘-2-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 N’-(9-氟-苯并[c]吖啶-7-基)-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二胺 N’-吖啶-9-基-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二胺 2-{4-[4-(苯并[g]喹啉-4-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-基}-乙醇 N4-{2-[2-(4-溴-苯基)-乙烯基]-7-氯-喹唑啉-4-基}-N1，N1-二乙基-戊烷-1，4-二胺 N-苯并[g]喹啉-5-基-N’-环己基-丙烷-1，3-二胺 2-[(2-羟基-乙基)-(3-{2-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙烯基]-喹唑啉-4-基氨基}-丙基)-氨基]-乙醇。
25.权利要求17的方法，其中所述有机非肽化合物选自 (1-苄基-哌啶-4-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 [2-(4-氯-苯基)-乙基]-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (3-吩噻嗪-10-基-丙基)-二氢苯并噻喃-4-基-胺 [1-甲基-3-(2，6，6-三甲基-环己-2-烯基)-烯丙基]-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (7-乙氧基-1，2，3，4-四氢-萘-2-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 N’-(9-氟-苯并[c]吖啶-7-基)-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二胺 N’-吖啶-9-基-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二胺 2-{4-[4-(苯并[g]喹啉-4-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-基}-乙醇 N4-2-[2-(4-溴-苯基)-乙烯基]-7-氯-喹唑啉-4-基}-N1，N1-二乙基-戊烷-1，4-二胺 N-苯并[g]喹啉-5-基-N’-环己基-丙烷-1，3-二胺 2-[(2-羟基-乙基)-(3-{2-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙烯基]-喹唑啉-4-基氨基}-丙基)-氨基]-乙醇。
全文摘要
本发明提供了能与P
文档编号A61P25/00GK1329493SQ99814010
公开日2002年1月2日 申请日期1999年12月1日 优先权日1998年12月2日
发明者H·A·考菲, R·D·康耐克, B·A·福斯特, F·拉斯廷扎德 申请人:辉瑞产品公司