专利名称：脂质体尼氟酸新的皮透抗炎药物的制作方法
在过去的几年间，由于人们对于药物分子在脂质体中包封技术的怀有极大兴趣，使得该技术有了很大的进展。
各种不同的分子已被成功地进行了包封，直接的结果是毒性减低、药物动力学性质有所改善以及使得药物对组织和靶器官的选择性和专一性增加。
在国际文献目录中，有大量关于脂质体药物剂型的参考文献。其中的许多尚处于临床研究阶段，还有些已经注册并开始在市场上销售。
在脂质体剂型的其它药物中，我们必须要提到的是益康唑、两性霉素B、米诺地乐(长压定)和一些处于临床研究阶段的抗癌和抗病毒药物。
关于皮透制剂的用途，药物通过皮肤转移的主要问题是药物成分的渗透性不理想，或者是由于药物转移到血液和淋巴的速度太快，以致于在需要的时间期限内治疗浓度降低。脂质体剂型不仅具有令人满意的渗透性而且具有能控制活性成分释放的作用。这些性质使脂质体剂型理想地用于皮透治疗。
本发明的主要目标是制备脂质体并将抗炎物质尼氟酸及其酯类包封到它们之中。尼氟酸是一种很好的已经证实的活性成分，其已被用于各种皮透制剂。
本发明的目标是发展新的具有领先水平的脂质体剂型并具有先进药物动力学性质的抗炎剂型。该药物可以应用于关节炎及外伤和风湿病中相似的情况。
本发明所要解决的最重要的问题是选择这些脂类进行脂质体的制备，它们要满足以下标准·与人类皮肤的生物相容性
·配成具有所需物理化学性质的脂质体(结构、形态、直径、脂双层的数目、结晶以及与时间、温度和浓度有关的稳定性)。
·脂质体对药物进行包封及保持药物所需理化特性的能力。
需要根据药物动力学的研究结果在那些满足上述标准的脂类中进行选择。
准备进行评价的脂类分子是一些天然分子，例如HSPC(氢化大豆脂类)，EPC(来自鸡蛋的饱和和不饱和脂类的混合物，以及一些合成脂类，例如DSPC，DMPC和DPPC，它们是饱和的磷脂酰胆碱酯类。下文中将提供制备脂质体的技术、脂质体的理化性质、脂质体包封药物系统以及药物动力学研究的方法学。
科学方法学(完整及分析的描述)I.脂类和原料供应，尼氟酸酯的制备准备用来制备脂质体的脂类或是一些天然物质，例如HSPC(氢化大豆脂类)、EPC或是一些合成脂类，例如磷脂类DSPC，DMPC和DPPC。合成脂类的脂肪链为硬脂酸或肉豆蔻酸或棕榈酸，它们在碳原子的数目、链长度、脂肪链的熔点以及决定脂质体理化性质的参数方面有所不同。
脂质体的制备不仅可以通过不同的磷脂结合来进行，还可以通过使磷脂与不同水平的胆固醇结合来进行。胆固醇可以调节脂质体的稳定性，这对于药物的控制释放是必需的。还可以用带有以下成分且与皮肤相似的组合物来制备脂质体神经酰胺、胆固醇、硫酸胆固醇、以及脂肪酸。本发明的目标是制备具有更大可能生物相容性的产品。
II.脂质体的制备及理化性质制备方法学a)通过脂类分子的水合制备脂类膜。在真空旋转蒸发仪器(闪式蒸发器)中去除有机溶剂(氯仿)后进行水合。对于脂质体内环境的pH调节来说，水合剂的选择是很重要的。可以使用TES(N-三[羟甲基]甲基2-氨基乙磺酸)、MES(2-[N-吗啉代]-乙磺酸)、HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-2-乙磺酸)和硫酸铵，需要对它们进行pH、渗透压以及离子强度的测定。脂类的水合导致它们自身形成多层脂质体。
b)单层和寡层脂质体的形成。对于皮透应用来说，寡层脂质体比多层脂质体具有更大的优势(由于体积较小因而渗透性更好)。制备脂质体的方法包括在-70℃下将多层脂质体冷冻，然后立即在高于脂肪链(顺-反)熔点的温度下加热。此过程重复10次，最终形成寡层脂质体，其为下一步的大小均一性提供了方便。
c)采用具有特定直径多碳滤膜的挤压系统，得到均一(就直径而言)大小的脂质体样品。
d)通过凝胶层析分离出未被包封在脂质体中的缓冲液。
为了实施这项研究，需要制备MLV(多层载体)、SUV(小单层)和LUV(大单层)脂质体，并对包封进行评价，一方面是尼氟酸的亲水部分进入单层脂质体的水合部分，另一方面是酯类亲酯产品包封到多层脂质体的脂双层中。
理化特性在此阶段必须进行评价的脂质体的理化参数有直径-直径均一性-双层的数目-形态，热动力学稳定性(与温度和脂类样品浓度有关)，样品中相互作用的存在，相分离的可能性。
将采用的理化技术具有较大分辨能力，指定为定量和定性的光-热技术。
1.准弹性光散射可以研究脂质体直径的全分布。
样品中可能的相互作用的研究。脂质体可能的附聚作用的研究。外观形态学的评价(Bi-reftactiveness)。
2.显微法。与图象加工分析结合的相对照显微法和反结合对照显微法(Nomarski-DIC)，
这项技术对粒径大于0.5μm的脂质体具有代表性。
3.原子力显微法(AFM)可以代表粒径在10nm-2μm之间的脂质体。也可以代表脂双层。
4.微分扫描量热学(DSC)脂质体稳定性的热动力学研究。脂双层中相和相转变的评价及特征。脂质体的间接纯度实验。
III.药物分子包封，药物脂质体系统的理化特性研究将采用不同种类的脂质体进行药物分子的包封。
a)尼氟酸包封由于脂质体内部和外部具有不同的pH值，可以按照活性成分转移的方法将尼氟酸包封到脂质体的内部。由于处在脂质体酸性内部环境中药物分子含有离子基团这样一个事实，该分子将接受质子并被包封。包封将发生在脂质体脂肪链的过渡温度下。包封百分比约为60-80％。尼氟酸与脂类的比例为1∶53(理论值为1∶50)。通过凝胶层析可以成功地分离出未包封的尼氟酸，得到含有尼氟酸的脂质体。用HPLC和UV-Vis可以对包封尼氟酸进行分析。
用UV/Vis对尼氟酸/脂类进行评价。对于尼氟酸的包封来说，可采用MLV(多层载体)、SUV(小单层载体)和LUV(大单层载体)脂质体，最大可能的内部值。
用MLV脂质体包封的比例大于90％，而尼氟酸与脂类的比例为1∶55(理论值为1∶50)。
b)尼氟酸亲脂酯类的包封将尼氟酸亲脂酯类包封到脂质体脂双层中。采用多层脂质体以便在包封时可使(双层的)可用体积增加。在从用于制备脂类膜(参见2a)的脂类中蒸发有机溶剂的过程中加入亲脂性分子。通过凝胶层析分离出未包封的药物，并进行药物/脂类比例的分析。用HPLC进行药物的分析。
c)药物-脂质体系统的理化性质在第4页的1，2，3，4中给出了理化参数。另外采用等温滴定进行了药物物质包封的热动力学研究。
在这一点上，人们对于由于药物包封所导致的发生在脂质体中的理化性质的改变具有很大的兴趣。
所采用的技术与阶段2中的相似。
另外，还采用等温微量热学滴定进行了药物分子包封的热动力学研究。所推荐的显微镜升级将为处于研究下的脂质体表面的化学组成提供更为详尽的表达。尤其是在包封到脂双层的情况下，可将活性成分制成图表。
IV.药物动力学研究药物动力学研究包括在缓冲溶液(体外)以及在50％大鼠血浆(体内)中的药物释放实验。
为了研究药物的稳定性，进行了与时间有关的动力学研究(冰箱温度为2℃，室温25℃)，并在37℃下进行了药物释放的研究。
为了测试药物的逐步释放并避免可能的毒性现象，在45℃和55℃下进行了高温研究。在所有的情况下，相对于被包封的药物制剂来说，那些游离的药物制剂将通过凝胶层析处于控制之下，并用UV-Vis进行了分析。还测定了药物与脂类的比例。
分析方法如下a)在缓冲液中的释放研究TES(N-三[羟甲基]甲基2-氨基乙磺酸)、MES(2-[N-吗啉代]-乙磺酸)、HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-2-乙磺酸。
这是药物从脂质体中释放的指征。在将物质包封到脂质体的指定间隙中后，用HPLC(流动相为乙醇-水)和UV-VIS对物质进行分析。
b)药物在皮肤上的体外释放从无毛小鼠身上获取背部皮肤，用刀片去除脂肪组织，加热60秒，从革域(chorium)分离出表皮。采用脂质体溶液并在标准的时间间隔内收集血清样品，用HPLC进行分析。
c)皮肤上吸收药物的体内实验采集血清或血浆样品，离心后，提取活性成分并HPLC和UV-Vis进行测定。
采用这种方法，可以确定药物在皮肤、血液、体内的局部浓度以及总吸收浓度。
V.最终药物剂型的开发-质量控制呈现出最佳吸收的脂质体药物可配制成霜剂、凝胶剂或洗液。为此目的，需要选择产品的配方，以使脂质体产品能够分散和/或溶解在其中。
从所制备的产品中，选择了两个配方，它们以最佳方式满足了一些标准，例如应用途径、外观以及粘稠度。
为了说明产品的寿命，对这两个产品进行了稳定性实验，所研究的参数如下外观、pH、粘稠度、固体残渣、活性成分及防腐测定等。研究在不同的温度(例如4，25，37，45℃)并冷冻-解冷冻的循环方式下进行。
还对选择的产品在微生物中的浓度进行了微生物学实验。还进行了激发(challenge)实验来证明防腐系统的有效性。
VI.脂质体药物的效力a)药物动力学研究按照第4段所描述的方法进行，即在体外用于表示结果，在体内采用无毛的小鼠。接下来的方法与第4段所描述的相同，所不同的是用最终产品替代脂质体产品直接应用到皮肤上。将研究结果与非脂质体剂型的产品进行了比较。
从前一阶段的最终产品中选出一个具有最佳药物动力学的产品，但还可以进行与药物释放有关的组成的进一步改进的研究。
b)药理学研究在体内对最终入选产品的药理学性质进行了实验。用紫外光在无毛小鼠的皮肤上引发炎症，通过测定前列腺素及游离基的形成来测试炎症，因为这可以通过天然抗氧剂皮肤保护作用的降低来评价，它们所表现出来的是维生素E、维生素C、辅酶Q和泛醌醇等抗氧剂在皮肤上的抗氧能力下降。
权利要求
1.将抗炎药物尼氟酸及其作为合成酯类的所有衍生物包封到脂质体中，这些脂质体是由以下脂类制备的EPC(鸡蛋磷脂酰胆碱)，DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)，DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)，DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)，HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)，它们的混合物，上述提及的脂类混合物以及它们与胆固醇和神经酰胺组成的组合物。
2.权利要求1中所述的在内部脂层中及在脂质体表面的包封。
3.权利要求1中所述的包封，其特征在于新的脂质体产品可以作为抗炎剂、抗风湿和止痛药物局部应用于皮肤、眼睛、耳朵和口腔，也可以应用于关节病及与外伤有关的相似的失调。
4.将放射标记的尼氟酸及其作为合成酯类的所有衍生物包封到脂质体中，这些脂质体是由以下脂类制备的EPC(鸡蛋磷脂酰胆碱)，DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)，DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)，DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)，HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)，它们的混合物，上述提及的脂类混合物以及它们与胆固醇和神经酰胺组成的组合物。
5.权利要求1，2和4中所述的尼氟酸及其所有合成酯类的包封，其特征在于包封的方法，通过该方法可以将药物活性转移至脂质体内部(pH梯度)。
6.权利要求1，2，3，4中所述的脂质体产品和它们的药物剂型，其特征在于在对皮肤、眼睛、耳朵和口腔进行局部治疗后，可以减轻皮肤的炎症。
7.权利要求1，2和3中所述的尼氟酸及其所有合成酯类在脂质体中的包封，其特征在于药物的溶解实验是在pH＝1－10的条件下进行的。
8.权利要求1，2，3和7中所述的尼氟酸及其所有合成酯类在脂质体中的包封，其特征在于药物的溶解实验是在pH＝4.5的条件下进行的。
9.权利要求12，3，7和8中所述的尼氟酸及其所有合成酯类在脂质体中的包封，其特征在于药物的溶解实验是在pH＝7.1的条件下进行的。
10.权利要求1，2，3，4，5中所述的脂质体包封后的尼氟酸及其所有合成酯类，其特征在于采用具有高分辨能力、定性、定量及测热等技术得到药物脂质体系统的理化参数。
11.权利要求1中所述的脂质体产品，其特征在于在2-55℃下于小鼠、大鼠身上利用这些产品进行体外/体内药物动力学研究。
12.药物剂型，其特征在于其含有权利要求1，2，3和4中所述的包封的尼氟酸及其所有的合成酯类。
13.权利要求12中所述的用于皮肤和皮透的药物制剂，其含有包封的尼氟酸，并可以配制成霜剂、凝胶剂、软膏剂、皮肤乳剂、皮肤悬浮液、皮透帖片以及浸渍敷料。
14.权利要求12中所述的用于口服的药物制剂，其含有包封的尼氟酸，并可以配制成漱口液、牙龈溶液、口腔粘膜悬浮液、口腔粘膜滴剂、口腔粘膜凝胶、牙龈凝胶、口腔粘膜溶液、口腔洗液。
15.权利要求12中所述的用于眼部的药物制剂，其含有包封的尼氟酸，并可以配制成眼霜、眼软膏剂、眼凝胶、滴眼溶液、滴眼悬浮液、缓释的滴眼剂。
16.权利要求12中所述的用于耳部的药物制剂，其含有包封的尼氟酸，并可以配制成耳霜、耳凝胶、耳软膏剂、滴耳溶液、滴耳悬浮液、滴耳乳剂以及耳棉塞。
17.权利要求1中所述的脂质体产品以及权利要求12，13，14，15，16中所述的药物制剂，其含有包封的尼氟酸。
全文摘要
本发明涉及药物尼氟酸在脂质体中的包封,其目的是开发新的皮透非甾体抗炎药物配方。尼氟酸及其酯类衍生物被用不同的脂类配方包封到脂质体中,以期能使活性化合物的作用增加。带有或不带包封药物脂质体的悬浮液被配方成霜剂,并且进行了最终配方的稳定性研究。
文档编号A61K47/24GK1331592SQ99814948
公开日2002年1月16日 申请日期1999年12月22日 优先权日1998年12月24日
发明者K·迪麦特佐斯, H·凯曼诺, M·拉里斯, G·帕莱欧安诺, A·乔治欧保罗斯, G·萨摩里斯, S·哈特奇安托尼奥, G·詹尼希斯, G·诺尼西斯, C·萨瓦－迪莫保罗 申请人:P·N·吉罗莱马托斯股份有限公司