抗γ－干扰素的人化抗体的制作方法

专利名称：抗γ－干扰素的人化抗体的制作方法
技术领域：
本发明总地涉及联合重组DNA与单克隆抗体技术来开发新的生物体，更具体地说例如，生产对γ-干扰素(γ-IFN)特异性的非免疫原性(人体内)免疫球蛋白及其在体外和体内的应用。更具体地说，本发明还涉及针对γ-IFN的人化单克隆抗体、编码该抗体的多核苷酸序列、生产抗体的方法、包含这些抗体作为活性组分的药物组合物、以及包含这些抗体作为活性组分的用于抑制不希望的免疫反应的治疗剂。
背景哺乳动物免疫反应由能与外来物质(即抗原)特异性相互作用的数类细胞来介导。这些细胞类型中一类是B细胞，它负责产生抗体。另一类是T细胞，它包括各种细胞亚组，它们能破坏受病毒感染的细胞，或控制B细胞和其它造血细胞(包括T细胞)的体内功能。第三类细胞是巨噬细胞，它加工抗原并将与主要组织相容性复合体(MHC)蛋白质结合的抗原并将抗原呈递给T细胞。这些细胞类型之间的联系是通过淋巴因子(如白介素1-6和γ-IFN)以复杂的方式介导(通常见Paul，W.E.，编，FundamentalImmunology，第3版，Raven Press，New York(1993)，该文相关部分纳入本文作为参考)。
一种重要的淋巴因子是γ-IFN，它由某些T细胞分泌。γ-IFN除了有抗病毒活性外，它还刺激天然杀伤(NK)细胞和T辅助细胞1(Th1)，激活巨噬细胞，并刺激细胞表面MHC分子的表达(Paul，同上，764-766页)。因此，γ-IFN总体上起增强免疫功能许多方面的作用，在需要这些增强的情况下(如在治疗癌症时)，它是合逻辑的候选治疗药物。相反，在免疫系统过度激活的疾病状态下，如在自身免疫疾病和器官移植排斥疾病中，γ-IFN的拮抗剂可通过中和γ-IFN的刺激作用来治疗疾病。
结合并中和γ-IFN的小鼠单克隆抗体已有报道(例如参见Van der Meide等人，JGen Virol，67，1059(1986))。已报道这些抗γ-IFN的抗体能在体外和体内小鼠移植模型中延迟或预防排斥(Landolfo等人，Science 229，176(1985)和Rosenberg等人，J.Immunol.144，4648(1990)，两篇文章均纳入本文作为参考)。已有报道用γ-IFN的单克隆抗体来治疗易产生诸如系统性红斑狼疮(SLE)等综合症的小鼠，以延迟疾病的发生(Jacob等人，J.Exp.Med.166，798(1987))。另外还报道了一种缓解大鼠佐剂性关节炎(Jacob等人，J.Immunol.142，1500(1989))和小鼠结肠炎(Powrie等人，Immunity 1，553-562(1994))的抗γ-IFN抗体。Queen等人在WO92/11018中讨论了抗γ-IFN的小鼠AF2抗体—某些人化免疫球蛋白，以及该蛋白治疗炎性疾病的应用。
用诸如AF2的非人单克隆抗体在治疗人时具有某些缺点，尤其是在下述的重复治疗方案中。例如，小鼠单抗在人体内的循环半减期较短，并且在用于人时缺少其它重要的免疫球蛋白功能特征。
更重要的可能是，小鼠单抗含有许多在注入人患者体内后会有免疫原性的氨基酸序列。许多研究已表明，在注射入外来抗体后，患者引发的针对该注入抗体的免疫应答可能非常强，在初次治疗后基本上消除了抗体的治疗用途。而且，如果用小鼠或其它抗原性(针对人而言)的单抗来治疗各种人类疾病，则随后用不相关的小鼠抗体进行治疗可能无效，甚至其本身是危险的，因为会有交叉反应。
因此，需要有一种改进形式的对γ-IFN抗原特异性的人化免疫球蛋白，该蛋白在人体内基本上没有免疫原性，而且能以适合治疗制剂和其它用途的方式容易而经济地生产。本发明满足了这些和其它需要。
发明目的和概述本发明的目的是，提供针对γ-IFN的人化单克隆抗体；编码该抗体的多核苷酸序列；制备这些抗体的方法；含有这些抗体作为活性组分的药物组合物；包含这些抗体作为活性组分的用于治疗疾病(尤其是自身免疫疾病)和抑制免疫系统的治疗剂；以及这些疾病的治疗方法。
本发明提供了人化的免疫球蛋白，它是小鼠AF2免疫球蛋白人化版本。小鼠AF2免疫球蛋白的特征是具有SEQ ID NO2所示的轻链可变区和SEQ ID NO4所示的重链可变区。本发明的人化免疫球蛋白包含人化的重链和轻链。人化的重链可变区构架中的11位被小鼠AF2重链可变区构架中相同位置的氨基酸所占据。本发明的较佳的人化免疫球蛋白包含SEQ ID NO6所示的人化轻链可变区和SEQ ID NO8所示的人化重链可变区。
该人化免疫球蛋白与γ-IFN抗原特异性结合并中和γ-IFN。该人化免疫球蛋白还能阻断贡献CDR的小鼠单抗与γ-IFN的结合。较佳的人化免疫球蛋白具有两对轻链/重链复合体，其中至少一条链包含一个或多个与人构架区片段功能性相连的小鼠互补决定区(CDR)。例如，可将有或没有额外的天然伴随的小鼠氨基酸残基的小鼠CDR导入人构架区，以产生能以强于约107M-1的亲和力水平结合抗原的人化免疫球蛋白。
本发明的免疫球蛋白(包括其结合片段或其它衍生物)易用各种重组DNA技术并最终在转染的细胞(较佳的是无限增殖的真核细胞，如骨髓瘤或杂交瘤细胞)中表达来制得。包含编码人化免疫球蛋白构架区的第一序列以及编码所需免疫球蛋白CDR的第二序列的多核苷酸可用合成方法制得，或是通过组合合适的cDNA与基因组DNA片段来制得。
人化的免疫球蛋白能以基本上纯的形式使用，并可以根据给药方式而异制成药学上可接受的剂型。
附图简述

图1A和1B。小鼠抗体AF2的轻链(A)可变区的cDNA序列和翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO1和2)，以及重链(B)可变区的cDNA序列和翻译的氨基酸序列(SEQ IDNO3和4)。Kabat CDR序列用下划线表示。
图2A和2B人化抗体HuZAF的轻链和重链的成熟可变区的cDNA序列(SEQ IDNO5和7)和氨基酸序列(SEQ ID NO6和8)。Kabat CDR用下划线表示。
图3小鼠AF2、人化免疫球蛋白HuZAF以及人化免疫球蛋白Haf25和HuXAF的重链可变区氨基酸序列比较。
图4小鼠AF2、人化抗体haf25、HuXAF和HuZAF对γ-IFN的中和活性。
定义在两个核酸或多肽(例如编码人化免疫球蛋白的DNA或人化免疫球蛋白的氨基酸序列)情况下，术语“基本上相同”指，就最大程度相应性进行比较和排列对比时，采用下列序列比较方法和/或目视检查测得两个或多个序列或亚序列具有至少约80％、最佳90-95％或更高的核苷酸或氨基酸残基相同性。这些“基本上相同的”序列通常被认为是同源的。较佳的，“基本上相同”存在于长度至少约为50个残基的序列区域内，更佳的在至少约100个残基的区域内，最佳的是至少约150个残基或在所比较的两个序列的整个长度中基本上相同。如下所述，利用Kabat中的编号方案，任何两个抗体序列只能以一种方式排列对齐。因此，对于抗体而言，相同性百分数具有唯一的清楚定义的含义。
免疫球蛋白成熟重链和轻链可变区的氨基酸分别命名为Hx和Lx，其中x是根据Kabat的《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(NationalInstitutes ofHealth，Bethesda，MD，1987和1991)中的方案表示氨基酸位置的数字。Kabat列出了每一亚组的抗体的许多氨基酸序列，并列出了该亚组中每一残基位置中产生共有序列的最常见的氨基酸。Kabat用一种方法对所列序列中每个氨基酸指定一个残基编号，指定该残基编号的方法已经在本领域中成为标准技术。通过参照保守氨基酸将所涉及抗体与Kabat中的一个共有序列排列对比，可将Kabat的方案延伸到尚未包括在他的一览表内的其它抗体采用Kabat的编号系统能方便地鉴定不同抗体中等价位置的氨基酸。例如，人抗体L50位的氨基酸占据了小鼠抗体L50位氨基酸的等价位置。
已知抗体的基础结构单元包含四聚物。每个四聚物由两对相同的多肽链组成，每一对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括约100-110个或更多氨基酸的可变区，它主要负责抗原识别。每条链的羧基端部分确定了一个恒定区，它主要负责起效应器功能。每对轻链/重链的可变区形成了抗体结合位点。因此，一个完整的抗体有两个结合位点。
轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并分别确定了同种型抗体IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12个或更多氨基酸的“J”区相连，重链中还包括约10个或更多氨基酸的“D”区。(通常见《基础免疫学》，Paul，W.，等人，第3版，Raven Press，NY，1993，SH.9(出于所有目的全部纳入本文作为参考))。
从N端到C端，轻链和重链可变区均包含交替的构架和互补决定区(CDR)FRCDR.FR，CDR.FR，CDR和FR。每个区的氨基酸指定编号是根据Kabat(1987)和(1991)(同上)和/或Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等人Nature 342878-883(1989)的定义。
较佳的，所列举的人化免疫球蛋白的类似物与列举的免疫球蛋白的不同之处在于保守性氨基酸置换。为了将氨基酸置换分为保守性置换和非保守性置换，可将氨基酸如下分组组I(疏水性侧链)met，ala，val，leu，ile；组II(中性亲水性侧链)cys，ser，thr；组III(酸性侧链)asp，glu；组IV(碱性侧链)asn，gln，his，lys，arg；组V(影响链取向的残基)gly，pro；和组VI(芳族侧链)trp，tyr，phe。保守性置换涉及相同类中氨基酸之间的置换。非保守性置换是这些类中一类的一个成员被另一类的一个成员置换。
术语“表位”包括能特异性结合免疫球蛋白的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的分子(如氨基酸)表面基团或糖侧链组成，它通常具有特异性的三维结构特征以及特异性的电荷特征。
本文所用的术语“免疫球蛋白”指四聚体抗体以及除抗体外的各种形式；它们例如包括Fv，Fab和F(ab′)2以及双功能杂交抗体(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17，105(1987))和单链(例如Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883(1998)和Bird等人，Science 242，423-426(1988)，纳入本文作为参考)。(综述见Hood等人，Immunology,Benjamin，NY，2ND编辑，(1984)，Harlow和Lane《抗体实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)和Hunkapiller和Hood，Nature，323，15-16(1986)，纳入本文作为参考)。
本文所用的术语“构架区”指免疫球蛋白轻链和重链可变区中在一个物种的不同免疫球蛋白中相对保守的那些部分(即CDR外的部分)(如Kabat等人，同上所定义的)。本文所用的术语“人构架区”是与天然存在的人抗体构架区基本上相同(大约85％或更多)的构架区。
本文所用的术语“人化免疫球蛋白”指包含人构架区、至少一个来自非人抗体的CDR，且其中所有恒定区均与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即，至少有大约85-90％相同，较佳的至少有95％相同的免疫球蛋白。因此，人化免疫球蛋白的所有部分，可能除CDR外，与一种或多种天然的人免疫球蛋白序列的对应部分基本上相同。例如，人化免疫球蛋白将不包括嵌合性小鼠可变区/人恒定区抗体。
术语“患者”包括人和兽医学对象。
术语“基本纯”或“分离的”意味着目标种类是占优势的种类(即以摩尔计算，它比组合物中其它单个种类更丰富)，较佳的是，基本纯话的组分是这样一种组合物，其中目标种类占所有存在的大分子种类的至少约50％(以摩尔计)。通常，基本纯的组合物占组合物中所有大分子种类的大约80、90、95或99％以上。最佳的，目标种类被纯化至基本上均一(组合物中的污染性种类不能用常规检测方法检测到)，其中该组合物基本上由一种大分子物质组成。
详述本发明提供了与γ-IFN特异性结合的人化免疫球蛋白，以及用该蛋白来抑制不良免疫反应的方法。
I.对γ-IFN特异性的人化抗体本发明的人化免疫球蛋白具有基本上来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白，较佳的是人受体抗体EU)的可变构架区，以及基本上来自称为AF2的小鼠免疫球蛋白(称为供体免疫球蛋白)的CDR。恒定区(如果有的话)也基本上来自人免疫球蛋白。人化抗体表现出对γ-IFN的特异性结合亲和力至少为107、108、109或1010M-1。通常，人化抗体对人γ-IFN的结合亲和力上限为AF2的3、4、5或10倍以内。通常，结合亲和力的下限也是AF2的3、4、5或10倍以内。较佳的人化免疫球蛋白与AF2竞争结合γ-IFN，并防止γ-IFN与AF2结合，从而通过γ-IFN受体转导应答反应。人化抗体宜以在1、2、5、10、20、50或100倍摩尔过量下中和80、90、95或99％的γ-干扰素活性。
Queen等人在WO92/11018中描述了小鼠AF2抗体，它具有SEQ ID NO2和4所示的重链和轻链可变区。该小鼠抗体具有IgG2b同种型和K轻链。较佳的人受体抗体EU以及其它可能的人受体抗体的重链和轻链可变区在Kabat《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(National Institutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)中有所描述。选择人受体抗体，使其可变区表现出与小鼠AF2抗体的可变区有高度的序列相同性。重链和轻链可变构架区可衍生自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列，或可以是几个人抗体的共有序列。
人化免疫球蛋白的设计可如下进行。当某氨基酸在下列分类目录内时，用提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)构架区的一个氨基酸代替待用的人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)构架区的该氨基酸(a)受体免疫球蛋白人构架区中的该氨基酸对于人免疫球蛋白在该位置而言是不常见的，而供体免疫球蛋白中的对应氨基酸对于人免疫球蛋白在该位置是常见的；(b)此氨基酸位置紧靠一个CDR；或(c)此氨基酸能与CDR相互作用(分别见Queen等人，同上，和Co等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2869(1991)，两篇文章均纳入本文作为参考)。关于人化免疫球蛋白生产的详细描述，参见Queen等人(同上)和Co等人(同上)。
Queen等人在WO92/11018中报道了AF2的某些人化形式，它们包含AF2的CDR区和EU的可变区构架，其中某些位置被置换。本发明的人化免疫球蛋白宜含有Queen等人(同上)所述的相同置换。然而，本发明还存在其它置换。具体地说，H11位被占据小鼠AF2重链中等价位置的氨基酸所置换。
H11位并不满足上述给出的置换标准，但是对掺入该置换的人化免疫球蛋白的中和活性有显著贡献。对该位置置换的可能性是通过用人EU抗体中等价位置的氨基酸置换嵌合性AF2抗体(即具有小鼠可变结构域和人恒定区)中各个位置所确定的。H11位的置换使该嵌合抗体对γ-IFN的中和活性显著降低。
通常，人化抗体中的CDR区与衍生出这些抗体的小鼠抗体中的对应CDR区基本上相同(更通常的是相同)。尽管通常不希望，但是有时可以对CDR残基作一个或多个保守性氨基酸置换而不显著影响所得人化免疫球蛋白的结合亲和力。有时，CDR区的置换能增强结合亲和力。
除了上述特定的氨基酸置换，人化免疫球蛋白的构架区通常与衍生出该构架区的人抗体构架区基本上相同(更通常的是相同)。当然，构架区中的许多氨基酸对抗体的特异性或亲和力没有或只有很少的直接作用。因此，它能忍受许多个别的构架区残基保守置换，而不会显著改变所得人化免疫球蛋白的特异性或亲和力。
HuZAF的类似物显示出与HuZAF有很高的氨基酸序列相同性。类似物的重链和轻链可变区由能在严谨条件下与编码HuZAF重链或轻链可变区的核酸或其简并形式杂交的核酸序列所编码。噬菌体展示技术为选择具有保留的结合亲和力和特异性的这些HuZAF类似物提供有力的技术手段(例如参见，Dower等人，WO91/17271；McCafferty等人，WO92/01047；和Huse，WO92/06204，这些文献出于所有目的均全部纳入本文作为参考)。
上述制得的人化抗体的可变区片段通常与至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)相连。人恒定区DNA序列可用熟知的程序分离自各种人细胞，但较佳的是分离自无限增殖的B细胞(见Kabat等人，同上和WO87/02671)。通常，抗体含有轻链和重链恒定区。重链恒定区通常包括CH1、绞链区、CH2、CH3，有时还有CH4区。
人化抗体包括具有所有类型恒定区的抗体，包括IgM，IgG，IgD，IgA和IgE，以及同种型，包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。当希望人化抗体表现出细胞毒活性时，恒定区通常是补体固定性恒定区，其类型通常是IgG1。当不需要这样的细胞毒性活性时，恒定区可以是IgG2类的恒定区。人化抗体可包含来自一种以上的类别的或同种型的序列。
在从概念上选出入化免疫球蛋白的CDR和构架区组分后，可用各种方法来产生这些免疫球蛋白。由于遗传密码具有简并性，因此不同的核酸序列可编码一种免疫球蛋白氨基酸序列。可用从头固相DNA合成或对较早制得的所需多核苷酸的变体进行PCR诱变来产生所需核酸序列。本申请中描述的编码抗体的所有核酸均明确地包括在本发明中。
一旦表达后，就可用本领域中标准程序对本发明的整个抗体、其二聚体、单个轻链和重链或其它免疫球蛋白形式进行纯化，这些纯化程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等(综述见Scopes，R.，《蛋白质纯化》，Springer-Verlag，N.Y(1982)，纳入本文作为参考)。对于药物学应用，均一性至少约为90-95％的基本纯的免疫球蛋白是较佳的，均一性为98-99％或更高的蛋白是最佳的。一旦部分纯化或纯化至所需均一性后，多肽就可用于治疗，或用于开发和进行试验程序、免疫荧光染色等(综述见《免疫学方法》，I和II卷，Lefkovits和Pemis编辑，Academic Press，New York，NY(1979和1981))。
II.治疗方法包含本发明免疫球蛋白的药物组合物可用于肠胃外给药，即、皮下、肌内、尤其是静脉内给药。用于肠胃外给药的组合物通常包含抗体或其混合物溶解在可接受载体(较佳的是水性载体)中的溶液。可用各种水性载体，例如水、缓冲液、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物。组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助性物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，如乙酸纳、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸纳、组氨酸和精氨酸。这些制剂中的免疫球蛋白浓度可以有很大的差别，即从低于约0.01％(通常至少约0.1％)至多达5％(重量)，这主要根据液体体积以及根据所选具体给药方式的溶解度来选择。
因此，典型的注射用药物组合物可含有1毫升无菌缓冲液以及1-100毫克免疫球蛋白。典型的静脉输液用组合物可含有250毫升无菌Ringer′s溶液和10毫克免疫球蛋白。制备可肠胃外给药的组合物的实际方法是本领域技术人员已知或明了的，这些方法在例如Remington′s Pharmaceutical Science(15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)中有更详细的描述，这些描述被纳入本文作为参考。
本发明的免疫球蛋白可以冷冻或冻干保藏，并在使用前重建在合适载体中。已经表明，该技术对于常规的免疫球蛋白是有效的，可采用本领域中已知的冻干和重建技术。冻干和重建会导致免疫球蛋白活性有不同程度的损失(例如，对于常规免疫球蛋白，IgM抗体活性丧失比IgG抗体多)，因此可能要调节使用水平来进行补偿。
可给予该组合物来进行预防和/或治疗处理。在治疗应用中，将足量组合物给予已经患有不良免疫反应的患者，以治愈或至少部分停滞病情及其并发症。足以实现该目的的剂量定义为“治疗有效剂量”。对该用途的有效量取决于病情的严重程度以及患者自身免疫系统的总体状况，但是它通常在每剂大约0.01-100毫克抗体范围内，更常用的是每位患者0.1-50毫克以及1-10毫克的剂量。可由治疗医师选择给药水平和方式，每日、每周或每月给予一次或多次。应记住，本发明的物质通常可用于严重的疾病状况，即危及生命或可能危及生命的情况。在这些情况下，考虑到本发明的人化免疫球蛋白中含有最少的外源物质，且“外源物质”排斥的可能性较低，治疗医师可能会希望给予大大过量的这些免疫球蛋白。
在预防应用中，将足量组合物给予有发展成不适当的免疫反应危险的患者，以抑制该反应。该用量定义为“预防有效量”。在该用途中，同样，精确的用量也取决于患者的健康状况及其整体免疫力水平，但是该用量通常为每位患者每剂0.1-100毫克，尤其是1-10毫克。
本发明方法对于HLAII类抗原和/或Th1细胞介导的不良免疫应答有关的各种疾病状况有效。这些疾病状况包括移植物抗宿主疾病和经受器官移植(如心脏、肺、肾和肝)患者体内的移植物排斥，以及自身免疫疾病，如I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、桥本氏甲状腺炎、牛皮癣、原发性胆汁化肝硬变、和炎性肠病如Crohn′s疾病。
人化免疫球蛋白可以基本纯的形式单独使用，或与诸如非甾体抗炎药、皮质醇或免疫抑制剂等化疗剂一起使用。制剂可包括非甾体抗炎剂(如阿斯匹林、布洛芬)、固醇类(如强的松)以及免疫抑制剂(如环孢菌素A、氨甲喋呤环磷酰胺)。
本发明的人化免疫球蛋白还可以与其它抗体(尤其是与其它淋巴因子或淋巴因子受体反应的人化抗体)一起使用。例如，与人化免疫球蛋白混合物反应的合适抗原包括白介素1-18，以及IL-2受体的p55和p75链(见Waldmann，Annu.Rev.Biochem.58，875(1989)和Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029(1989)，两篇文献均纳入本文作为参考)。其它抗原包括在细胞负责引起疾病的那些抗原，例如所谓的“分化簇”(Leucocyte Typing III，A.J.McMichael编辑，Oxford University Press 1987)，该文纳入本文作为参考。
诊断方法人化的抗γ-IFN抗体还可用于诊断方法中。人化的抗γ-IFN抗体可用来测定γ-IFN的表达和随后的免疫应答的发展。诊断方法可在体外用患者的细胞样品(如血样、淋巴结活检物或组织)来进行，或可通过体内成像来进行。人化的抗γ-IFN抗体还可用来纯化人γ-IFN。
在具体的实施方案中，包含本发明人化免疫球蛋白的组合物可用来例如通过放射免疫试验或ELISA来检测γ-IFN。因此，可对本发明的人化免疫球蛋白(例如用AF2抗体鉴定的与抗原决定簇结合的人化免疫球蛋白)进行标记，并用来鉴定含有显著浓度的γ-IFN的解剖部位。例如但不限定的是，可将一个或多个标记分子与人化免疫球蛋白相结合。典型的标记分子包括，但不局限于，不透X线的染料、放射反衬(radiocontrast)制剂、荧光分子、自旋标记分子、酶或其它具有诊断价值(尤其是在放射或磁共振显影技术中)的标记分子。
提供下列实施例是为了描述，而不是起限制作用。应理解，尽管实施例涉及人化AF2抗体，生产对γ-IFN抗原有高结合亲和力的人化抗体，但是也考虑采用与γ-IFN某表位结合的其它单克隆抗体的CDR。
本文提到的所有出版物出于描述和公开的目的纳入本文作为参考，例如，在出版物中描述的构建物和方法可以和本发明结合使用。提供上文以及整篇文章中的出版物是因为它们在本申请提交日之前已经公开。其中的内容不应被认为是承认发明者未被授权利用以前的发明在这些公开之前。
实施例1.人化免疫球蛋白的产生小鼠AF2可变区cDNA的克隆和测序编码小鼠AF2抗体轻链和重链可变区的cDNA序列的克隆在Queen等人，WO92/11018中有所描述。这些cDNA的序列显示在图1中。
制备两个质粒载体用于构建和表达包含小鼠AF2抗体可变区以及与其相连的人恒定区的嵌合抗体。质粒pVg1-dhfr(Queen，等人，同上)含有人巨细胞病毒IE1启动子和增强子(M.Boshart等人，Cell 41，521(1985))、人基因组Cg1片段(包括部分前面的内含子)和用于选择的二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(Simonsen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，2495(1984)，纳入本文作为参考)。质粒pVk(Queen等人，同上)与pVg1-dhfr相似，但是含有人基因组Ck片段和gpt基因。用聚合酶链反应从cDNA制得Af2重链和轻链可变区衍生物。5’引物与从ATG密码子开始的V区杂交并含有XbaI位点；3′引物与J区的最后15个核苷酸杂交，并含有剪接供体信号和XbaI位点(见Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029(1989)，纳入本文作为参考)。将经修饰的V区克隆到CMV启动子和恒定区部分内含子之间的各质粒载体的XbaI位点中。
为使嵌合抗体表达，用电穿孔法将重链和K链质粒转染到Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞中，并选择表达gpt的细胞。用ELISA检测分泌最大量完整抗体的克隆。ELISA显示出嵌合的AF2抗体与人γ-IFN结合。
人AF2可变区的设计为了在人化抗体中保留小鼠抗体的结合亲和力，采用了Queen等人的通用程序(Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029(1989)和美国专利No.5,585,089和5,693,762)。构架区残基的选择对保留高结合亲和力很关键。理论上，来自任何人抗体的构架区序列均可作为CDR移植的模板；然而，已经证实将CDR直接替换到这样的构架区中会导致对抗原的结合亲和力有明显损失(Tempest等人，Biotechnology9266(1992)；Shalaby等人，J.Exp.Med.17217(1992))。人抗体与最初的小鼠抗体越同源，人构架区将可能会减少亲和力的扭曲导入小鼠CDR的可能性越少。根据对抗体序列数据库的序列同源性搜索结果，选择人抗体Eu，因为它提供了与小鼠AF2抗体同源的优秀的构架。其它高度同源的人抗体链可能也适合提供人化抗体构架，尤其是人亚组I的K轻链和人亚组I的重链(如Kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，1991中定义的)。
用计算机程序ABMOD和ENCAD(Levitt等人，J.Mol.Biol.168595(1983))来构建AF2可变区的分子模型，用它来确定AF2构架中与CDR靠近得足以与CDR相互作用的氨基酸的位置。为了设计人化HuZAF重链和轻链可变区，将小鼠AF2抗体的CDR移植到人Eu抗体的构架区中。在计算机模型暗示与CDR有明显接触的构架位置上，用小鼠抗体的氨基酸代替最初的人构架氨基酸。对于命名为HuZAF的人化形式的AP2，在重链的27、28(在Chothia CHR H1内)、30、38、48、67、68、70、72、74、98和107位残基以及轻链的48、63和70位残基处进行置换。另外，对于在人抗体数据库中在那些位置上很少存在的构架残基，用在那些位置上的人共有氨基酸或对应的小鼠抗体氨基酸代替。对于HuZAF，在重链的93、95、98、107、108、109和111位残基处以及轻链的48、63和70位残基处进行置换。
另外，在HuZAF中，用占据小鼠抗体AF2重链等价位置的氨基酸置换H11位。H11是通过用人EU抗体中等价位置的氨基酸置换嵌合AF2抗体(即，除置换位置外，具有小鼠可变区)中各个位置并测试每个变体中和活性是否减少，而鉴定为置换的候选位置。掺入所有上述置换的HuZAF轻链和重链可变区的最终序列显示在图2A和图2B中。
设计其它人化免疫球蛋白，它们也含有小鼠AF2 CDR区和人EU可变区，但还含有上述置换的各个亚组(见图3)。Haf25与HuZAF相同，只是此抗体缺少H11和H38位的置换。HuXAF与huZAF相同，只是前一抗体缺少H38位的置换。
然而，还有许多潜在的接触CDR的残基也能进行置换而且仍然能使抗体基本保留对抗原的亲和力。例如，人化AF2轻链中前4个N-端氨基酸残基可另用小鼠抗体中的序列置换，因为它与CDR接触。
同样，人化抗γ-IFN重链和轻链中不接触CDR的许多构架残基能容纳人EU抗体、其它人抗体、小鼠AF2抗体或其它小鼠抗体的对应位置的氨基酸置换，而且人化抗体的亲和力或非免疫原性没有显著丧失。
可以选择各种备选的氨基酸来产生具有亲和力、特异性、非免疫原性、生产难易程度和其它所需性能的不同组合的人化抗γ-IFN版本。因此，提供实施例只是为了说明，而没有限制作用。
为了构建人化抗体的基因，选出编码人化重链和轻链的蛋白质序列的核苷酸序列，加上典型的免疫球蛋白信号序列(通常是利用小鼠序列中发现的密码子)。改变数个简并密码子，以产生限制性位点或除去不需要的位点。该核苷酸序列也包括与嵌合基因中所用的相同的剪接供体信号和每个末端的一个XbaI位点。某些基因可从四个重叠的合成的寡核苷酸构建得到。对于每个可变区基因，合成了在交替链上的两对重叠的寡核苷酸，它包括整个编码序列以及信号肽和剪接供体信号。该寡核苷酸在Applied Biosystems 380B DNA合成仪上合成。每个寡核苷酸约长110-140碱基，并有约15个碱基的重叠区。用Klenow聚合酶从每一对寡核苷酸合成双链DNA片段，用限制性酶消化，与pUC18载体相连并测序。然后将分别具有正确的一半序列的两个片段以合适的取向连接到pVg1-dhfr或pVK表达载体的XbaI位点中，以产生完整的重链和轻链基因。对以前的基因进行PCR诱变，产生了某些人化AF2变体的基因。
用电穿孔法将重链和轻链质粒转染到Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞中，选择有gpt表达的细胞。用ELISA测定培养上清液中的人抗体产生来筛选克隆，并从最佳产生抗体的克隆中纯化抗体。使组织培养物上清液通过葡萄球菌蛋白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱，纯化抗体。用0.2M甘氨酸-HCl、pH3.0洗脱结合的抗体，用1M TrispH8.0中和。使其通过PD10柱(Pharmacia)或用透析，将缓冲液交换成PBS。
2.对γ-IFN的中和活性的试验γ-IFN提高了应答反应性细胞系上MHC分子的表达水平。Hs294T是在与γ-IFN培育48-72小时后使表面上表达的MHC II类分子的量上调的人黑色素瘤细胞系(Zarniecki等人，J.Immunology，140，4217-4223(1988))。这种增强可用对上调的分子有特异性的单抗以及间接免疫荧光以及随后的流式细胞计数来检测。抗体中和γ-IFN的活性可以这样来测定测定抗体是否抑制该细胞系上MHC II类分子的上调。用于该试验的γ-IFN购自R&D Systems，614 McKinley Place，N.E.，Minneapolis，MN 55413。
将浓度递增的抗体加入固定量的已表明能上调HS294T细胞上MHCII类分子水平的γ-IFN中。使细胞与抗体和γ-IFN的混合物培育48-72小时，用对人MHCII类分子有特异性的小鼠单抗，通过间接免疫荧光法来测定MHCII类分子的水平。用流式细胞计数分析测定细胞群的荧光强度中值，然后对抗体浓度作图，以表示此抗体的中和能力。
从图4中可以看出，HuZAF的中和活性明显优于haf25，即，H11和H38位的置换提高了中和活性。HuXAF的中和活性也优于haf25，这表明单单H11位的置换就为中和活性提供了重大贡献。
权利要求
1.一种人化免疫球蛋白，它是具有SEQ ID NO2所示轻链可变区以及SEQ IDNO4所示重链可变区的小鼠AF2免疫球蛋白的人化版本，该人化免疫球蛋白包含人化的重链和轻链，其特征在于人化重链可变区构架的11位被小鼠AF2重链可变区构架中等价位置上的氨基酸占据。
2.根据权利要求1所述的人化免疫球蛋白，它包含小鼠AF2免疫球蛋白的CDR以及人EU免疫球蛋白的重链和轻链可变区构架。
3.根据权利要求2所述的人化免疫球蛋白，其特征还在于H38位被小鼠AF2重链可变区构架中等价位置上的氨基酸占据。
4.根据权利要求2所述的人化免疫球蛋白，其特征还在于H11、H27、H28、H30、H38、H48、H67、H68、H70、H72、H74、H93、H95、H98、H107、H108、H109、H111位被小鼠AF2重链中等价位置上的氨基酸占据，L48和L70位被小鼠AF2轻链中等价位置上的氨基酸占据，L63位被人免疫球蛋白轻链共有序列中等价位置上的氨基酸占据。
5.根据权利要求1所述的人化免疫球蛋白，它与人γ-IFN特异性结合的亲和常数在小鼠AF2抗体亲和力的四倍以内。
6.根据权利要求1所述的人化免疫球蛋白，它与γ-IFN特异性结合，它包含与SEQ ID NO6的成熟轻链有至少90％序列相同性的人化的成熟轻链，以及与SEQ IDNO8的成熟重链有至少90％序列相同性的人化的成熟重链。
7.根据权利要求1所述的人化免疫球蛋白，它包含两个轻链/重链二聚体。
8.根据权利要求1所述的人化免疫球蛋白，它是IgG1同种型。
9.根据权利要求1所述的人化免疫球蛋白，它被纯化至至少为95％的均一性。
10.一种人化免疫球蛋白，它包含SEQ ID NO6所示的成熟的重链可变区和SEQID NO8所示的成熟的轻链可变区。
11.一种药物组合物，它包含权利要求1或10所述的人化免疫球蛋白以及药学上可接受的载体。
12.一种治疗患有有害免疫反应的患者的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1或10所述的药物组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中患者患有自身免疫疾病。
全文摘要
本发明提供了能结合并中和γ－干扰素的人化免疫球蛋白。该抗体可用来治疗免疫系统疾病,尤其是自身免疫疾病。
文档编号A61P17/06GK1334821SQ99815919
公开日2002年2月6日 申请日期1999年11月29日 优先权日1998年12月1日
发明者M·瓦斯克斯, N·F·朗多费, 鹤下直哉, C·L·奎因 申请人:蛋白质设计实验室股份有限公司