一种无创制作肺纤维化动物模型的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物实验模型构建技术领域，具体地说，涉及一种无创制作肺纤维化动物模型的方法。
【背景技术】
[0002]现有的构建肺纤维化动物模型的方法有很多，主要包括:气管切开术、气管插管、额镜引导灌注、腹腔注射或静脉滴注化学药物法、辐射法、口咽部给药法。
[0003]造模方法有很多，但是各自都美中不足，存在或多或少的缺点。气管切开对标本鼠的外源性创伤大操作繁杂，对相关实验室数据的影响较大，且实施操作耗费时间；气管插管或额镜引导方法存在操作盲目性大、准确性差、成功率低、用时长等缺陷。
[0004]腹腔注射或静脉滴注化学药物等方法主要是腹腔或者静脉给予博来霉素法，腹腔注射博来霉素法，可以减轻因手术操作熟练程度的不同造成的纤维化程度不同，但由于造模需要的博来霉素总剂量较大，费用高，且药物注射次数较多，因此国内应用受到一定限制。静脉给药的最大优点是它更接近人类给药的基本途径，但是模型形成晚。
[0005]辐射法:选用对辐射敏感的动物为构建肺纤维化模型带来了便利，且特定近交品系动物具有辐射敏感性这一特点有利于肺纤维化与该动物遗传特性之间的相关性的研宄，该动物模型的缺点是形成肺纤维化的时间较长，且用于动物实验的费用增高。
[0006]口咽部给药主要通过气雾给药，一般情况下，除满足药物雾化后粒径要求外，选择合适的雾化发生装置和动物雾化吸入装置同样重要，药液用量小常用压缩式雾化器，若用量大则用超声雾化器；而吸入装置应根据不同动物选择不同型号的面罩或喷雾吸嘴。目前常用的是动式吸入装置，应选择对供试品吸附较少，气溶胶发生能力强、密封性好、易于清洗的装置，并确保能快速达到试验所需浓度并在试验过程中保持药物浓度稳定性。药物仍须保持分散均匀，不形成结块。所以从雾化粒径之外，装置要求较多，并难以计算以及掌握吸入量的多少，容易造成给药量不均。
[0007]针对上述现有的操作技术，目前，需要一种操作方便，成功率高，损伤小且成本低廉的大鼠用气管内给药方法。
【发明内容】
[0008]为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提出了一种无创制作肺纤维化动物模型的方法。其技术方案如下:
[0009]一种无创制作肺纤维化动物模型的方法，包括以下步骤:
[0010]采用内窥镜引导下气管内灌注的滴注菌液方式，设备采用鼻O度4#硬式内窥镜、氙灯冷光源及松下KS-822摄录监视系统；
[0011]将大鼠置于直径为26cm的干燥器内乙醚麻醉，麻醉满意后迅速将鼠从麻醉器中取出，呈仰卧位状以弹力固定夹将其四肢分别固定于鼠板上；
[0012]两名操作者并排位于鼠头顶方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉镜，自鼠上唇齿伸入口腔、提压鼠舌，伸至鼠会厌缘处时提拉鼠舌根，以右手持牵拉套圈，套住鼠上列长尖牙门齿，左右手同时相反方向上下牵拉舌根与长尖牙门齿，使鼠自唇齿至喉部间上呼吸畅通暴露声门区域，此时主操作者以左手持O度硬式内窥镜，右手持7号长针注射器，内装定量造模所用肺炎链球菌菌悬液，在监视器显示引导下将7号长注射针插入气管内，并深入声门下15?20mm，此时观察鼠的声带活动情况，当双侧声带由内收状向外展状变化时，迅速推注药物博来霉素200 μ I入气管内，使药物随吸气时的气流充分进入支气管内，推注完毕后，将鼠板迅速立起鼠头在上左右翻转15?20秒，此目的是利用体位及重力作用，使药物充分能够达到细支气管以提高造模药物肺部覆盖面从暴露气道至推注药物完成时间用20?30秒；空白组不做处理，盐水对照组注入同等量的无菌生理盐水；每7天滴入一次，共2次；
[0013]解除鼠四肢弹力固定夹将鼠放回鼠笼内待复苏，鼠复苏时间30?60秒，然后置于恒温动物房饲养；接种后每日观察其活动、取食、精神的一般情况，记录相应数据。
[0014]进一步优选，所述博来霉素的浓度为2.5mg/ml。
[0015]本发明的有益效果为:
[0016]本发明造模方法采用无创气管内滴入博来霉素法构建肺纤维化动物模型，改方法你能够模拟临床肺纤维化的形成过程，其操作简便、快捷，减少气管切开等对动物造车的外源性损伤，且能够保证药物完全进入气管内，也缩短了造模时间。该方法既能保证药物的不浪费，也能缩短造模时间，从经济学角度考虑也减少了造模成本。
[0017]【附图说明】请
[0018]图1为空白组HE染色(400倍)；
[0019]图2为空白组Masson染色(400倍)；
[0020]图3为模型组第21天HE染色(400倍)；
[0021]图4为模型组第21天Masson染色(400倍)。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0023]实验动物:清洁级Wistar雄性大鼠60只，月龄3-6个月，体重180 士 20g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物合格(许可)证号:SCXK(京)2009-0004 ;实验大鼠喂养在天津实验动物中心，饲养环境室内相对湿度为50% -60%，温度控制在18-22°C ;常规饲料喂养，自由饮用水，按时通风冲刷粪便，保持环境安静，适应性喂养I周后开始实验。
[0024]实验药品:博莱霉素(造模型组芪术合剂组，泼尼松组)由日本化药株式会社生产，进口许可证号X20000349
[0025]造模方法
[0026]采用内窥镜引导下气管内灌注的滴注菌液方式，设备采用鼻O度4#硬式内窥镜、氙灯冷光源及松下KS-822摄录监视系统；
[0027]将大鼠置于直径为26cm的干燥器内乙醚麻醉，麻醉满意后迅速将鼠从麻醉器中取出，呈仰卧位状以弹力固定夹将其四肢分别固定于鼠板上；
[0028]两名操作者并排位于鼠头顶方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉镜，自鼠上唇齿伸入口腔、提压鼠舌，伸至鼠会厌缘处时提拉鼠舌根，以右手持牵拉套圈，套住鼠上列长尖牙门齿，左右手同时相反方向上下牵拉舌根与长尖牙门齿，使鼠自唇齿至喉部间上呼吸畅通暴露声门区域，此时主操作者以左手持O度硬式内窥镜，右手持7号长针注射器，内装定量造模所用肺炎链球菌菌悬液，在监视器显示引导下将7号长注射针插入气管内，并深入声门下15?20mm，此时观察鼠的声带活动情况，当双侧声带由内收状向外展状变化时，迅速推注药物博来霉素(浓度2.5mg/ml) 200 μ I入气管内，因为此时鼠呈吸气阶段，可以使药物随吸气时的气流充分进入支气管内，取得最佳的造模效果推注完毕后，将鼠板迅速立起鼠头在上左右翻转15?20秒，此目的是利用体位及重力作用，使药物充分能够达到细支气管以提高造模药物肺部覆盖面从暴露气道至推注药物完成时间约用20?30秒。空白组不做处理，盐水对照组注入同等量的无菌生理盐水；每7天滴入一次，共2次。
[0029]解除鼠四肢弹力固定夹将鼠放回鼠笼内待复苏，鼠复苏时间约30?60秒，然后置于恒温动物房饲养；接种后每日观察其活动、取食、精神的一般情况，记录相应数据
[0030]实验结果:
[0031]动物一般情况
[0032]造模后的I?7天内，模型组组大鼠有不同程度的耸毛、精神萎靡、活动减少，并见有明显的体重下降，正常组无明显异常。
[0033]动物组织病理
[0034]光镜下观察其病理形态学改变:肺泡扩张，间隔变窄，肺泡孔扩大，肺泡间隔断裂，扩张的肺泡融合成较大的囊腔，并伴随小气道，周围肺间质及肺泡间隔有大量炎细胞的浸润，以单核、巨噬细胞为主，大部分形成炎症灶，成纤维细胞增多，病灶内出现肺泡萎缩，Masson染色可见少量胶原纤维被染成蓝色，显示造模成功，具体如图1_图4所示。
[0035]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1.一种无创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤: 采用内窥镜引导下气管内灌注的滴注菌液方式，设备采用鼻O度4#硬式内窥镜、氙灯冷光源及松下KS-822摄录监视系统； 将大鼠置于直径为26cm的干燥器内乙醚麻醉，麻醉满意后迅速将鼠从麻醉器中取出，呈仰卧位状以弹力固定夹将其四肢分别固定于鼠板上； 两名操作者并排位于鼠头顶方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉镜，自鼠上唇齿伸入口腔、提压鼠舌，伸至鼠会厌缘处时提拉鼠舌根，以右手持牵拉套圈，套住鼠上列长尖牙门齿，左右手同时相反方向上下牵拉舌根与长尖牙门齿，使鼠自唇齿至喉部间上呼吸畅通暴露声门区域，此时主操作者以左手持O度硬式内窥镜，右手持7号长针注射器，内装定量造模所用肺炎链球菌菌悬液，在监视器显示引导下将7号长注射针插入气管内，并深入声门下15?20mm，此时观察鼠的声带活动情况，当双侧声带由内收状向外展状变化时，迅速推注药物博来霉素200 μ I入气管内，使药物随吸气时的气流充分进入支气管内，推注完毕后，将鼠板迅速立起鼠头在上左右翻转15?20秒，利用体位及重力作用，使药物充分能够达到细支气管以提高造模药物肺部覆盖面从暴露气道至推注药物完成时间用20?30秒；空白组不做处理，盐水对照组注入同等量的无菌生理盐水；每7天滴入一次，共2次； 解除鼠四肢弹力固定夹将鼠放回鼠笼内待复苏，鼠复苏时间30?60秒，然后置于恒温动物房饲养；接种后每日观察其活动、取食、精神的一般情况，记录相应数据。
2.根据权利要求1所述的无创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征在于，所述博来霉素的浓度为2.5mg/mlo
【专利摘要】本发明公开了一种无创制作肺纤维化动物模型的方法，采用内窥镜引导下气管内灌注的滴注菌液方式，设备采用鼻0度4#硬式内窥镜、氙灯冷光源及松下KS-822摄录监视系统；将大鼠置于直径为26cm的干燥器内乙醚麻醉，推注药物博来霉素200μl入气管内，使药物随吸气时的气流充分进入支气管内，解除鼠四肢弹力固定夹将鼠放回鼠笼内待复苏，鼠复苏时间30～60秒，然后置于恒温动物房饲养；接种后每日观察其活动、取食、精神的一般情况，记录相应数据。
【IPC分类】A61D7-00
【公开号】CN104605958
【申请号】CN201510038225
【发明人】孙增涛, 郑兆晔, 廉富, 杨晓敏, 闫博, 刘恩顺, 祁海燕, 李美凤, 封继宏
【申请人】天津中医药大学第二附属医院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月26日