一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用细胞系生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，属生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 禽脑脊髓炎（Avian Encephalomyelitis; AE)又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎 病毒（AEV)引起的一种主要危害4周龄以下雏鸡，以侵害雏鸡中枢神经系统，引起雏鸡非 化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病，病雏主要表现为运动失调、头颈震颤和后趾 麻痹等神经症状。具有突然出现和难以预测持续期等特点，能造成雏鸡的损失和母鸡产蛋 率的下降，成为当前世界上危害养禽业发展的主要疫病之一。我国自80年代中期有此病发 生的报道以来，在全国各地均有发生和流行，给养鸡业造成了较大的损失。目前该病尚无 有效的治疗药物，因此预防免疫显得更为重要。
[0003] 禽脑脊髓炎病毒（AEV)属于小RNA病毒科，肝病毒属，能在易感鸡群的雏鸡、鸡胚 中高效价繁殖。国内外已有应用原代鸡胚源细胞(鸡胚成纤维、肾细胞、神经胶质细胞、胰细 胞等)培养禽脑脊髓炎病毒的研究报道，但病毒效价低，均不超过1〇 3_ 5EID5tZml。还未有成功 应用细胞系培养禽脑脊髓炎病毒的报道，目前禽脑脊髓炎病毒疫苗制备均采用鸡胚法。用 鸡胚培养禽脑脊髓炎病毒，需要用大量SPF鸡胚，生产成本高、劳动强度大、产品批间差异 大，给疫苗产量、质量的提高带来困难。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种利用细胞系生产禽 脑脊髓病毒灭活疫苗的方法。
[0005] 本发明所述技术问题是由以下技术方案解决的。
[0006] -种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，包括如下步骤： a. 选择细胞系作为制苗用细胞； b. 制苗用细胞的传代与培养 制苗用细胞形成良好单层时，经EDTA-胰酶消化后，加入细胞生长液制备成细胞悬液， 用于继续传代或接种病毒； c. 生产用毒种的繁殖 将制苗用细胞悬液，分装细胞培养瓶，同时接种禽脑脊髓炎鸡胚组织毒，培养72h时更 换细胞维持液，继续培养48~72h，收获培养物，为一代细胞毒；一代细胞毒传代培养，为二 代细胞毒；取一代、二代细胞毒作为生产用毒种； d. 生产制苗毒液 将制苗用细胞悬液，分装细胞培养瓶，同时接入禽脑脊髓炎病毒生产用毒种进行培养， 72h时更换细胞维持液，继续培养48~72h，收获培养物，-15°C保存。
[0007] e.疫苗制备 将收获的制苗毒液灭活后加入佐剂，乳化制备成禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗。
[0008] 上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤a中细胞系是幼仓鼠肾传代 细胞（BHK21)、鸡胚成纤维细胞系（DF-1)。幼仓鼠肾传代细胞（BHK21)经过有限稀释法克隆 纯化筛选。
[0009] 上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤c和d中，禽脑脊髓炎鸡胚组 织毒的接种量为细胞生长液的〇. 5%~2% (V/V)，细胞毒接种量为细胞生长液的1%~3% (V/V)〇
[0010] 上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤c和d中，在幼仓鼠肾传代细 胞（BHK21)接种病毒后，37°C培养24h，转为33°C再培养96h~120h。
[0011] 上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤c和d中，在鸡胚成纤维细胞 系（DF-I)接种病毒后，37°C培养120 h~144 h。
[0012] 上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤b中，细胞生长液的配方是： 体积百分含量90~92%低糖DMEM或DMEM/F12液、8~10%新生牛血清、适量的抗生素 ，pH 值调整为7. 0-7. 4。
[0013] 上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤c和d中，细胞维持液的配方 是：体积百分含量97~99%低糖DMEM或DMEM/F12液、1~3%新生牛血清、适量的抗生素， pH值调整为7. 2-7. 4。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 1. 在本发明中，用细胞系替代鸡胚培养禽脑脊髓炎病毒，病毒适应性好、效价高； 2. 在本发明中，幼仓鼠肾传代细胞（BHK21)经过纯化筛选，提高了细胞对病毒的敏感 性，保证了细胞的状态均一，减小批次间差异，确保生产工艺参数和产品质量的稳定； 3. 本发明中，病毒接种时采用同步接种法，无需吸附，简化操作，节省人力； 4. 本发明中，在幼仓鼠肾传代细胞（BHK21)接种病毒24h后，降低培养温度，减慢了细 胞老化速度，提升了细胞活力，提高了病毒效价； 5. 本发明中，用细胞系生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗批间质量差异小，具有生产工艺 简单稳定、易操作、产量大、成本低、外源病毒污染几率小等特点，具备工业化大生产的可行 性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，其中各实施例仅用于解释本发 明的技术方案、而并非限定本发明的专利保护范围。
[0016] 实施例1有限稀释法克隆纯化筛选幼仓鼠肾传代细胞（BHK21) 幼仓鼠肾传代细胞（BHK21)、禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株（AEV VR株)均购自中国兽 医药品监察所。
[0017] 细胞生长液的配方为体积百分含量为92%低糖DMEM液，8%新生牛血清，调整PH 值为7. 2 ; A.单克隆细胞株制备 a.细胞的有限稀释 制备BHK21细胞悬液，细胞计数后，用细胞生长液进行梯度稀释到IO1个细胞/ml，即每 0.1 ml 1个细胞。
[0018] b.细胞的克隆培养 将上述稀释好的细胞悬液加入96孔细胞培养板中，0.1 ml/孔，显微镜下观察，弃去非 单一细胞并且细胞状态不佳的细胞孔，置于37°C，5% CO2培养，每天观察细胞生长状态并及 时换液，待细胞增殖为克隆群落，选取生长状态良好的细胞孔，用EDTA-胰酶进行消化，制 成悬液，重复上述克隆方法1~2次，直至筛选出单克隆生长孔。
[0019] c.单克隆化细胞株的扩大培养 选取单克隆生长孔，用EDTA-胰酶消化，先后经24孔细胞培养板和细胞培养瓶进行扩 大培养，细胞培养到一定数量，进行单克隆细胞的冻存及细胞库的建立。
[0020] B.禽脑脊髓炎病毒高适应性细胞株的筛选 a. BHK21单克隆细胞株接种禽脑脊髓炎鸡胚组织毒 按V:V 1%接种量将禽脑脊髓炎病毒鸡胚组织毒接种BHK21单克隆细胞株，37°C培养 94h，收获病毒液。收获病毒液冻融3次后，接种BHK21单克隆细胞，进行继代培养，连传6 代。
[0021] b. BHK21单克隆细胞株培养禽脑脊髓炎病毒的EID5tl检测 将病毒液用灭菌生理盐水进行梯度稀释，经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚，置37°C孵 育288h，判定。按照《中华人民共和国兽药典》（三部、2010年版）记载方法计算EID5Q。
[0022] C.结果 a.禽脑脊髓炎病毒疫苗株高适应性BHK21单克隆细胞株的筛选。
[0023] 通过有限稀释法扩大培养获得BHK21单克隆细胞株32株。通过禽脑脊髓炎病毒 疫苗株感染BHK21单克隆细胞株后EID 5tl的检测，筛选出1株BHK21单克隆细胞：第26株， 为禽脑脊髓炎病毒疫苗株高适应性BHK21单克隆细胞株，并标号为B26。
[0024] b.禽脑脊髓炎病毒疫苗株感染BHK21单克隆细胞株的EID5Q。
[0025] 表1禽脑脊髓炎病毒疫苗株感染B26单克隆细胞株的EID5tl
【主权项】
1. 一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：包括如下步骤： a. 选择细胞系作为制苗用细胞； b. 制苗用细胞的传代与培养 制苗用细胞形成良好单层时，经EDTA-胰酶消化后，加入细胞生长液制备成细胞悬液， 用于继续传代或接种病毒； c. 生产用毒种的繁殖 将制苗用细胞悬液，分装细胞培养瓶，同时接种禽脑脊髓炎鸡胚组织毒，培养72h时更 换细胞维持液，继续培养48~72h，收获培养物，为一代细胞毒；一代细胞毒传代培养，为二 代细胞毒；取一代、二代细胞毒作为生产用毒种； d. 生产制苗毒液 将制苗用细胞悬液，分装细胞培养瓶，同时接入禽脑脊髓炎病毒生产用毒种进行培养， 72h时更换细胞维持液，继续培养48~72h，收获培养物，-15°C保存； e. 疫苗制备 将收获的制苗毒液灭活后加入佐剂，乳化制备成禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗。
2. 根据权利要求1所述的一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步 骤a中细胞系是幼仓鼠肾传代细胞（BHK21)、鸡胚成纤维细胞系（DF-I);幼仓鼠肾传代细胞 (BHK21)经过有限稀释法克隆纯化筛选。
3. 根据权利要求2所述的一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步 骤c和d中，禽脑脊髓炎鸡胚组织毒的接种量为细胞生长液的0. 5%~2% (V/V)，细胞毒接 种量为细胞生长液的1%~3% (V/V)。
4. 根据权利要求3所述的一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步 骤c和d中，在幼仓鼠肾传代细胞（BHK21)接种病毒后，37°C培养24h，转为33°C再培养 96h~120h。
5. 根据权利要求4所述的一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步 骤c和d中，在鸡胚成纤维细胞系（DF-I)接种病毒后，37°C培养120h~144h。
6. 根据权利要求5所述的一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步 骤b中，细胞生长液的配方是：体积百分含量90~92%低糖DMEM或DMEM/F12液、8~10% 新生牛血清、适量的抗生素，pH值调整为7. 0-7. 4。
7. 根据权利要求6所述的一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步 骤c和d中，细胞维持液的配方是：体积百分含量97~99%低糖DMEM或DMEM/F12液、1~ 3%新生牛血清、适量的抗生素，pH值调整为7. 2-7. 4。
【专利摘要】本发明公开了一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：a.选择细胞系作为制苗用细胞；b.制苗用细胞的传代与培养；c.生产用毒种的繁殖；d.生产制苗毒液；e.疫苗制备。本发明采用传代细胞系作为制苗用细胞，并筛选了敏感细胞系，加强了病毒与细胞的匹配性。本发明具有生产工艺简单稳定、易操作、批间差异小、成本低等特点，生产的禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗安全性和免疫原性好。CCTCC NO：C201420920141112
【IPC分类】C12N7-00, A61P31-14, A61K39-125
【公开号】CN104689311
【申请号】CN201410846776
【发明人】韩佳丽, 邱贞娜, 梁武, 刘涛, 柳珊, 朱秀同, 郁宏伟, 杨保收, 何平有, 徐倩倩, 郑朝朝
【申请人】瑞普（保定）生物药业有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2014年12月31日