千层纸素苷在制备抗肿瘤药中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗肿瘤药领域，涉及千层纸素苷在制备抗肿瘤药中的应用。
【背景技术】
[0002] 抗肿瘤药物通过不同的机制发挥抗肿瘤的作用，如有文献将化疗药物按传统分类 分为烷化剂、抗代谢药、抗癌抗生素、植物药、激素及杂类；有按作用机制分类为直接破坏 DNA药物、插入DNA模板药物、干扰核酸合成药物、抑制微管装配药物、影响蛋白质合成药 物、其他作用机制类药物等等。了解抗肿瘤药的作用机制更有利于在临床治疗肿瘤时根据 肿瘤与药物的特征正确选择相应药物。
[0003] 千层纸素是黄芩的活性组分之一，具有明显的抗肿瘤作用，是一个具有广阔应用 前景的天然抗肿瘤药物。然而，千层纸素药理作用广泛，其抗肿瘤作用的机制目前尚未完全 阐明。千层纸素 A-7-葡萄糖醛酸苷（千层纸素苷，Oroxyloside，OAG)也是黄芩的活性组 分之一，与千层纸素并非同一物质，目前对千层纸素苷的研宄较少，相关药理作用的研宄尚 未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供千层纸素苷在制备抗肿瘤药中的应用。
[0005] 本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
[0006] 千层纸素苷在制备抗肿瘤药中的应用，尤其是针对肝癌的抗肿瘤药，其发挥抗肿 瘤作用的机制是千层纸素苷针对肿瘤细胞具有生长抑制和杀伤作用。其制剂可以是药学上 允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、丸剂、口服液、注射剂、膜剂、胶囊剂、月旨 质体等。千层纸素苷的用量可根据用药途径、患者年龄、体重、体表面积、所治疗的疾病类型 和严重程度及疗程安排等变化，其日剂量可以是200-8000mg，可以一次或多次施用。
[0007] 本发明有益效果：
[0008] 千层纸素苷通过对肿瘤细胞产生生长抑制及杀伤作用从而起到抗肿瘤作用，具有 较好的效果，可制备成各种剂型的抗肿瘤的药物，为肿瘤病人提供了更好的选择。
【附图说明】
[0009] 图1.千层纸素苷对H印G2的凋亡诱导作用。
[0010] 图2.千层纸素苷对!fepG2的凋亡诱导作用的量化。
[0011] 图3. OAG对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤的生长抑制作用。
[0012] 图4. OAG对人肝癌细胞H印G2裸鼠移植瘤瘤重的影响。
[0013] 图5. OAG对人肝癌细胞H印G2裸鼠异种移植肿瘤实验动物体重的影响。
【具体实施方式】
[0014] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0015] 药效实施例1 :OAG对人肝癌细胞H印G2细胞的凋亡诱导作用
[0016] 1、实验材料
[0017] ⑴药物
[0018] 千层纸素 A-7-葡萄糖醛酸苷（千层纸素苷，Oroxyloside，OAG)从市场购得，浅黄 色粉末。含量：90%，用DMSO配成母液，置于-20°C保存。临用前用RPMI-1640培养液配成 所需浓度。
[0019] ⑵细胞株
[0020] 人肝癌细胞H印G2来自中国科学院上海生命科学研宄所生物化学与细胞生物学 研宄所细胞库，用含10%小牛血清的1640培养液培养。
[0021] ⑶试剂
[0022] 1)培养液：RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司产品。取RPMI-1640粉末10. 4g溶 于1000 mL灭菌三蒸水中，用似!10)3调pH值至7. 3~7. 4,圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4°C 冰箱保存。使用前加入10%胎牛血清、lOOU/mL青霉素和100mg/L链霉素。
[0023] 2)小牛血清：杭州四季青生物工程公司产品。经56°C水浴灭活30min，分装并保 存于-20 °C低温冰箱中。
[0024] 3)PBS 缓冲液：称取 NaCl 8. 0g、KCl 0· 20g、Na2HPCM · H2O I. 56g、KH2PO4 2. 0g，溶 于1000 mL三蒸水中，高压灭菌，4°C冰箱保存。
[0025] 4) 0. 02% EDTA溶液：称取EDTA 20mg，溶于IOOmL PBS缓冲液中，低速搅拌，调pH 值至7. 3~7. 4,圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4°C冰箱保存。
[0026] 5)0. 25%胰酶：称取胰酶0. 25g，溶于IOOmL PBS缓冲液中，高压灭菌。
[0027] 6)DMSO 溶液：美国 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo)公司产品
[0028] 7)Annexin-V/PI双染试剂盒：购自凯基公司。
[0029] 2、实验仪器：
[0030] I)YJ-875型医用净化工作台：苏州净化设备厂生产。
[0031] 2)3111型水套式CO2培养箱：美国Thermo electron公司产品。
[0032] 3)电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
[0033] 4)LD4-2普通离心机：北京医用离心机厂产品。
[0034] 5) Centrifuge 5810R 型离心机：德国 Eppendorf 公司产品。
[0035] 6)FACSCalibur 流式细胞仪：美国 Becton Dickinson(BD)公司产。
[0036] 3、实验方法：
[0037] (1)流式细胞仪检测细胞凋亡率
[0038] 将H印G2细胞以浓度为5X105个/L接种于6孔培养板，置于37°C、5% CO2培养 箱内培养24h后，加入终浓度为25、50和100 ymol/L的千层纸素苷处理细胞48h。消化收 集细胞，l〇〇〇r/min离心5min，PBS液洗绦1次，离心去PBS，加入冰预冷的500 μ I Binding Buffer重悬，然后分别加入5 μ Annexin V和PI染料，常温染色20min，染色后经流式细胞 仪（Becton-Dickinson FACSCalibur)检测，实验数据由 CellQuest 软件分析。〇
[0039] 4、实验结果：
[0040] 实验结果显示，如图1及图2,千层纸素苷（25, 50,100 μ M)作用于人肝癌H印G2细 胞24h后，能诱导其发生凋亡，凋亡率分别为18. 68%，30. 63%，48. 3%，具有剂量依赖性。
[0041] 药效实施例2 :OAG对人肝癌细胞H印G2裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
[0042] 1、实验材料
[0043] (1)受试药物：千层纸素 A-葡萄糖醛酸苷从市场购得，纯度为99%以上，制成冻干 粉末，使用前用注射用生理盐水将药物配成所需浓度。
[0044] (2)对照药物：氟尿嘧啶注射液，购自天津金耀药业有些公司，批号：140929,规 格：10ml/支。配制方法：给药前精密吸取氟尿嘧啶注射液0. 12ml，溶解于0. 9%氯化钠注 射液（生产厂家：辰欣药业股份有限公司；批号：1303207021 ;规格：500ml*0· 9% )0· 88ml 配制成浓度为3mg/ml的液体，给药体积为0. 2ml/20g，即给药剂量为30mg/kg。
[0045] ⑶实验动物
[0046] 来源、种系、品系：BALB/c裸小鼠，由中国军事医学科学院实验动物研宄中心提供 (实验动物生产许可证：SCXK (军）2007-004)。日龄：35-40天，体重：18-24g，性别：雌性。
[0047] 2、实验方法：
[0048] (1)实验动物分组
[0049] 阴性对照组（空白对照） 12只 阳性对照组（5-FU 30mg/kgi.v.三天一次） 6只 药物治疗组（OAG90mg/kg Lv.三天一次） 6只 药物治疗组（〇AG45mg/kg i.v.三天一次） 6只
[0050] (2)造模方法
[0051] 取对数生长期的人肝癌细胞H印G2细胞株，在无菌条件下后制备成2 X IO8Ail细 胞悬液，以0.1 ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径， 待肿瘤生长至100~300mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗 肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2-3天测1次，。给药体积为0. 2ml/20g。19天后， 小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积（tumor volume，TV)的计算公式为：
[0052] TV =1/2 XaXb2
[0053] 其中a、b分别表示长宽。
[0054] 根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV)，计算公式 为：RTV = VtZiVtl。其中Vtl为分笼给药时（即(I tl)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的 肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(%)，计算公式如下：
[0055] T/C(% ) = Tetv/CetvX100%
[0056] Tktv:治疗组RTV ;C κτν:阴性对照组RTVo
[0057] 抑瘤率计算公式如下：
[0058] 抑瘤率（％ ) = (l-Tweight/Cweight) Χ100%
[0059] Tweight:治疗组平均瘤重；C weight:阴性对照组平均瘤重。
[0060] 3、结果：
[0061] 千层纸素苷对人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤的实验性治疗结果见表1，2和图3,4， 5。实验结果如下，OAG分别以90mg/kg，45mg/kg尾静脉注射给药，3天一次，给药21天，共 给药7次。实验组对人肝癌细胞H印G2裸小鼠移植瘤的T/C分别为56. 74%，71. 57% ;抑 瘤率分别为40. 23%，28. 45%。5-FU以30mg/kg尾静脉注射给药，3天1次，给药21天，共 给药7次后对人肝癌细胞H印G2裸小鼠移植瘤的T/C为30. 74 %，抑瘤率达70. 11 %。其中 5-FU 30mg/kg剂量组对实验鼠体重有极显著影响（P〈0. 01)。
[0062] 结论：千层纸素苷对肝癌HepG2细胞有明显生长抑制和杀伤作用。
[0063] 表1 :OAG对人肝癌细胞HepG2裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的影响（X土SD，肿 瘤体积：单位mm3)
[0064]
【主权项】
1. 千层纸素苷在制备抗肿瘤药中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤是肝癌。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的抗肿瘤是指对肿瘤细胞具有生长抑 制和杀伤作用。
【专利摘要】本发明属于抗肿瘤药领域，公开了千层纸素苷在制备抗肿瘤药中的应用。根据本发明提出了千层纸素苷在制备抗肿瘤药中的应用，可将千层纸素苷制备成各种剂型的治疗肿瘤的药物，为肿瘤病人提供了更好的选择。
【IPC分类】A61K31-7048, A61P35-00
【公开号】CN104706649
【申请号】CN201510115263
【发明人】郭青龙, 卢娜, 魏立彬, 赵丽, 李志裕, 周煜新
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月16日