一种家蝇复合抗菌肽制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及提供一种家蝇复合抗菌肽制剂。
【背景技术】
[0002] 抗生素在医学上一直发挥着重要的作用，是西医治疗感染疾病的核心药物。但随 着抗生素的广泛和长期使用，以及滥用抗生素的情况日益严重，造成许多具耐药性的突变 菌株出现，使现用抗生素失效。
[0003] 抗菌肽是生物体内产生的一种具有抗菌功能的小分子多肽，在低等和高等生物体 系中都显示出先天性免疫功能。研宄表明，家蝇体内含有丰富的抗菌肽，这类活性多肽具 有分子量小(大部分抗菌肽都在20Kda以下)、热稳定性强、水溶性好、抗菌谱广、杀菌活力高 及原料来源丰富等优点，特别是其能杀死耐药菌株，而且杀菌机制使病原菌不易产生耐药 性突变，使其成为传统抗生素的理想替代物，引起生物学界和医药界的广泛重视。
[0004] 目前关于家蝇抗菌肽提取的报道，基本方法是通过醋酸溶解的方法提取家蝇体内 的蛋白质，再通过100°c加热沉淀热不稳定蛋白，进一步通过吸附法将剩余的溶解在醋酸中 的热稳定蛋白吸附在海藻糖上，通过对吸附的蛋白进行洗脱、浓缩(冻干或沉淀法）后获得 复合抗菌肽。但是海藻糖的成本高，不能重复使用，影响此方法的工业化应用。Hou等人 还通过直接冻干酸提取液的方法获得浓缩的复合抗菌肽，但冻干后由于大量的灰粉无法去 除，进而会降低复合抗菌肽的溶解度，影响复合抗菌肽的进一步分离和纯化。
[0005] 切向流超滤技术是指液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式，切向流过 滤时，待过滤的液体的流动方向和过滤膜平面的方向平行，液体就会垂直于膜表面穿过膜 孔。超滤时，过滤较大规模的料液就需要采用切向流过滤方式，它会产生湍流(二次流)，由 于有了湍流，液体流动在过滤介质表面（即超滤膜表面）产生剪切力，减小了滤饼层或凝胶 层在膜表面的堆积，使沉淀从膜表面剥离，降低膜污染，保证稳定的过滤速度，超滤膜截留 分子量的差异，可以使切向流超滤技术应用于分离不同分子量的蛋白，在大规模的蛋白质 浓缩及分离中广泛应用。
[0006] 抗菌肽在常温下具有较高的稳定性，不容易失活，但也存在随着保存时间延长，抗 菌活性减退的问题。海藻糖的化学性质稳定，具有不同于其它双糖的独特特性，对抗菌小肽 的保护作用未见研宄。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种家蝇复合抗菌肽制剂，该制剂通过常规醋酸溶解法提取家蝇体内 的蛋白质，提取液离心取上清液，上清液置于100°c加热沉淀热不稳定蛋白，离心，上清液滤 膜抽滤，滤液采用IOKda和5Kda膜两次分子截留，获得分子量为5Kda~10Kda之间的复合抗 菌肽溶液，在复合抗菌肽溶液中添加海藻糖，使溶液中海藻糖终浓度为0.1mol/L~0. 2mol/ L，混合均匀后真空冷冻干燥，制得家蝇复合抗菌肽制剂。
[0008] 所述滤液采用IOKda和5Kda膜包切向流超滤方法进行分子截留。
[0009] 本发明方法的优点和技术效果： 本发明制剂为分子量呈连续分布的由多种抗菌肽组成的复合抗菌肽，其不仅对枯草芽 孢杆菌有抑菌效果，还对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌有抗菌作用，其抗 菌谱不仅能抑制革兰氏阳性细菌，也能抑制革兰氏阴性细菌，添加海藻糖作为保护剂还能 提尚抗菌狀的活性和稳定性。
[0010] 鉴于切向流超滤法一次可以处理大体积抗菌肽酸提取液，浓缩效率高，并且可以 重复使用，不需要昂贵的设备，对于工业化生产抗菌肽来说，此法更加便捷可靠。
【附图说明】
[0011] 图1为复合抗菌肽溶液的抑菌效果图，其中1为金黄色葡萄球菌S. atfrew5ATCC6538 ; 2 为枯草芽孢杆菌 B. CMCC(B)63501 ; 3 为大肠杆菌 E. co/i Rosetta ;4 为大肠杆菌 E. Cb/i0157N0TC12900 ;5 为沙门氏菌 S. CMCC (B) 50335 ;6 为志贺氏菌 S?办seateriae A7CC10231); 图2为含有不同浓度海藻糖的复合抗菌肽制剂对金黄色葡萄球菌（S. atfr<9W5ATCC6538)抑菌结果不意图； 图3为含有不同浓度海藻糖的复合抗菌肽制剂对大肠杆菌（E. 0157N0TC12900) 抑囷结果不思图。
【具体实施方式】
[0012] 下面通过实施例对本发明方法作进一步详细说明，但本发明方法的保护范围不局 限于所述内容。
[0013] 实施例1:本家蝇复合抗菌肽制剂，具体制备如下： (1) 将400g蝇蛆粉末（20目）溶解于2L 0? 5mol/L的醋酸溶液中，在4°C下过夜提取； (2) 提取液以7000rpm离心15min收集上清液，上清液在100°C的中水浴IOmin以 沉淀大分子热不稳定性蛋白，7000rpm离心15min去除热不稳定性蛋白沉淀，上清液利用 0. 22 y m的滤膜进行真空抽滤，收集滤液； (3) 将步骤（2)得到的滤液通过截留分子量为IOKda膜包切向流系统进行超滤浓缩，收 集透过液，再将上述透过液通过截留分子量为5Kda膜包切向流系统进行超滤浓缩，收集浓 缩液50ml，得到切向流浓缩法浓缩的抗菌肽溶液。
[0014] (4)将步骤（2)得到的滤液冻干后，再用50ml 0. lmol/L的醋酸溶解，获得冻干法 浓缩的抗菌肽溶液。
[0015] (5)利用考马斯亮蓝法测定不同浓缩法得到的抗菌肽溶液可溶性蛋白的浓度，结 果见表1。
[0016]表1 :
【主权项】
1. 一种家蝇复合抗菌肽制剂，其特征在于：通过常规醋酸溶解法提取家蝇体内的蛋白 质，提取液离心取上清液，上清液置于l〇〇°C加热IOmin沉淀热不稳定蛋白，离心，上清液滤 膜抽滤，滤液采用IOKda和5Kda膜两次分子截留，获得分子量为5Kda~10Kda之间的复合抗 菌肽溶液，在复合抗菌肽溶液中添加海藻糖，使溶液中海藻糖终浓度为0.1mol/L~0. 2mol/ L，混合均匀后真空冷冻干燥，制得家蝇复合抗菌肽制剂。
2. 根据权利要求1所述家蝇复合抗菌肽制剂，其特征在于：滤液采用IOKda和5Kda膜 包切向流超滤方法进行分子截留。
【专利摘要】本发明公开了一种家蝇复合抗菌肽制剂，该方法通过常规醋酸溶解法提取家蝇体内的蛋白质，提取液离心取上清液，上清液置于100℃加热10min沉淀热不稳定蛋白，离心，上清液滤膜抽滤，滤液采用10Kda和5Kda膜两次分子截留，获得分子量为5Kda~10Kda之间的复合抗菌肽溶液，在复合抗菌肽溶液中添加海藻糖，使溶液中海藻糖终浓度为0.1mol/L~0.2mol/L，混合均匀后真空冷冻干燥，制得家蝇复合抗菌肽制剂；此复合抗菌肽制剂具有广谱杀菌能力，且保质期较长。
【IPC分类】A61K38-00, A61K47-36, A61P31-04
【公开号】CN104740599
【申请号】CN201510094256
【发明人】林连兵, 雷琎, 孙宇杰, 国洪旭, 邓先余
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月3日