一种王不留行总皂苷的提取、纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种王不留行总皂苷的提取、纯化方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]王不留行为石竹科植物麦蓝菜Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke.的种子。种子含多种总皂苷，其中王不留行总皂苷由棉根总皂苷元、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、鼠李糖组成。另含异肥皂草甙，酸解时其甙元肥皂草素一部分脱水而生成牡荆素。又含棉子糖及一种化合物，水解得葡萄糖。此外，含淀粉、脂肪、蛋白质、灰分；预测有生物碱和香豆精类的反应。
[0003]总皂苷(saponins)又称皂素，是广泛存在于植物界的一类特殊的甙类，它的水溶液振摇后可生产持久的肥皂样的泡沫，因而得名。经现代研宄证明，总皂苷具有的药理作用:1、双向调节免疫作用；2、抗缺氧和抗疲劳作用；3、抗低温应激作用；4、抗脂质氧化作用；5、对中枢神经系统的作用；6、抗致突变作用；7、对肾有调节作用，补肾。
[0004]高速逆流色谱技术是一种不用任何同态载体的液、液色谱技术，其原理是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而分离，其分离效率和速度可以与HPLC相媲美。HSCCC分离效率高，产品纯度高，不存在载体对样品的吸附和污染，制备量大和溶剂消耗少，操作简单，能从极复杂的混合物中分离出特定的组分。被广泛应用天然产物分离制备中。
[0005]目前，国内很少见王不留行总皂苷提取方法的相关专利报道。在现有公开专利“一种同时分离王不留行黄酮苷和王不留行总皂苷的分离方法”(专利号201210512777.7 )中采用的工艺步骤为:用含水有机溶剂来提取王不留行脱脂干粉，并将提取液过滤，浓缩，干燥后继续用大孔树脂进行分离和制备，洗脱液经浓缩，干燥而成，该法溶剂使用量大，所得王不留行总皂苷纯度低。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种王不留行总皂苷的提取、纯化方法，此法操作简单，所得产品纯度高。
[0007]为实现上述目的，一种王不留行总皂苷的提取、纯化方法通过以下技术方案来实现:
1)取干燥的王不留行粉碎，过20-60目筛；
2)称取一定量的粗粉，加入重量体积比为1:0.5~1的蒸馏水浸润，并加入粗粉重量
0.1%~0.3%的生物酶在pH值4~5，温度为45~50°C的条件下酶解l~3h ；
3)酶解结束，加入料液比为1:1~3、60%~80%的乙醇进行超声提取l~3h，过滤，收集滤液，滤渣重复提取1~2次；
4)收集提取液减压浓缩至原体积的1/5~1/3，收集浓缩液，加入浓缩液体积2~4倍的乙醚搅拌，静置分层，弃去上层，收集下层； 5)下层溶液采用高速逆流色谱纯化，根据图谱收集目标成分，回收试剂，减压干燥即得王不留行总皂苷。
[0008]步骤2)中所述的生物酶为果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶中的一种或两种以上的混合物。
[0009]步骤3)中所述超声提取的频率为20~50KHz，温度为40~55°C。
[0010]步骤5)中所述的高速逆流色谱分离的溶剂体系为乙酸乙酯-甲醇-水溶剂系统，混合比例2-4:1-3:6-10，取下相做固定相，上相做流动相。
[0011]本发明具有的优点为:1、采用了生物酶酶解辅助超声提取的提取方法，提取效率高，溶剂用量少，对环境污染小；2、采用了高速逆流色谱法纯化，方法简便易操作，溶剂用量小，样品无损失，制备量大，可连续制备，而且无污染。
【具体实施方式】
[0012]下面将结合【具体实施方式】进一步说明本发明。
[0013]实施例1:
取干燥的王不留行粉碎，过20目筛；称取100g的粗粉，加入重量体积比为1:0.5的蒸馏水浸润，并加入粗粉重量0.1%的果胶酶在pH值为4，温度为45°C的条件下酶解Ih ;酶解结束，加入料液比为1:1、60%的乙醇在频率为20KHz，温度为40°C的条件下超声提取3h，过滤，收集滤液，滤渣重复提取I次；收集提取液减压浓缩至原体积的1/5，收集浓缩液，加入浓缩液体积2倍的乙醚搅拌，静置分层，弃去上层，收集下层；下层溶液以乙酸乙酯-甲醇-水溶剂系统，混合比例2:1:6，取下相做固定相，上相做流动相，采用高速逆流色谱纯化，根据图谱收集目标成分，回收试剂，减压干燥即得王不留行总皂苷。经HPLC检测，含量为 95.2%ο
[0014]实施例2:
取干燥的王不留行粉碎，过40目筛；称取100g的粗粉，加入重量体积比为1:0.5的蒸馏水浸润，并加入粗粉重量0.2%的纤维素酶在pH值为5，温度为50°C的条件下酶解2h ;酶解结束，加入料液比为1:2、70%的乙醇在频率为30KHz，温度为50°C的条件下超声提取2h，过滤，收集滤液，滤渣重复提取2次；收集提取液减压浓缩至原体积的1/4，收集浓缩液，加入浓缩液体积3倍的乙醚搅拌，静置分层，弃去上层，收集下层；下层溶液以乙酸乙酯-甲醇-水溶剂系统，混合比例3:2:8，取下相做固定相，上相做流动相，采用高速逆流色谱纯化，根据图谱收集目标成分，回收试剂，减压干燥即得王不留行总皂苷。经HPLC检测，含量为 96.5%ο
[0015]实施例3:
取干燥的王不留行粉碎，过60目筛；称取100g粗粉，加入重量体积比为1:1的蒸馏水浸润，并加入粗粉重量0.3%的半纤维素酶在pH值为5，温度为50°C的条件下酶解3h ;酶解结束，加入料液比为1:3、80%的乙醇在频率为50KHz，温度为55°C超声提取lh，过滤，收集滤液，滤渣重复提取2次；收集提取液减压浓缩至原体积的1/3，收集浓缩液，加入浓缩液体积4倍的乙醚搅拌，静置分层，弃去上层，收集下层；下层溶液以乙酸乙酯-甲醇-水溶剂系统，混合比例4:3:10，取下相做固定相，上相做流动相采用高速逆流色谱纯化，根据图谱收集目标成分，回收试剂，减压干燥即得王不留行总皂苷。经HPLC检测，含量为95.8%。
【主权项】
1.一种王不留行总皂苷的提取、纯化方法，其特征在于包括以下步骤: 1)取干燥的王不留行粉碎，过20-60目筛； 2)称取一定量的粗粉，加入重量体积比为1:0.5~1的蒸馏水浸润，并加入粗粉重量0.1%~0.3%的生物酶在pH值4~5，温度为45~50°C的条件下酶解l~3h ； 3)酶解结束，加入料液比为1:1~3、60%~80%的乙醇进行超声提取l~3h，过滤，收集滤液，滤渣重复提取1~2次； 4)收集提取液减压浓缩至原体积的1/5~1/3，收集浓缩液，加入浓缩液体积2~4倍的乙醚搅拌，静置分层，弃去上层，收集下层； 5)下层溶液采用高速逆流色谱纯化，根据图谱收集目标成分，回收试剂，减压干燥即得王不留行总皂苷。2.根据权利要求1所述的一种王不留行总皂苷的提取、纯化方法，其特征在于步骤2)中所述的生物酶为果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶中的一种或两种以上的混合物。3.根据权利要求1所述的一种王不留行总皂苷的提取、纯化方法，其特征在于步骤3)中所述超声提取的频率为20~50KHz，温度为40~55°C。4.根据权利要求1所述的一种王不留行总皂苷的提取、纯化方法，其特征在于步骤5)中所述的高速逆流色谱分离的溶剂体系为乙酸乙酯-甲醇-水溶剂系统，混合比例2-4:1-3:6-10，取下相做固定相，上相做流动相。
【专利摘要】本发明公开了一种王不留行总皂苷的提取、纯化方法。其制备过程如下：取干燥的王不留行粉碎，过20-60目筛；称取一定量的粗粉，加入重量体积比为1：0.5~1的蒸馏水浸润，并加入粗粉重量0.1%~0.3%的生物酶酶解；酶解结束，加入料液比为1：1~3、60%~80%的乙醇进行超声提取，过滤，收集滤液，滤渣重复提取1~2次；收集提取液减压浓缩至原体积的1/5~1/3，收集浓缩液，加入乙醚搅拌，静置分层，弃去上层，收集下层；下层溶液采用高速逆流色谱纯化，根据图谱收集目标成分，回收试剂，减压干燥即得王不留行总皂苷。本方法高效、快速、应用范围广，适合高纯度王不留行总皂苷的生产。
【IPC分类】A61K36/36
【公开号】CN104940268
【申请号】CN201510265056
【发明人】刘东锋, 杨成东
【申请人】南京泽朗医药科技有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月22日