非人灵长类实验动物的脑脊液动态采集方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及非人灵长类实验动物的脑脊液动态采集方法。
【背景技术】
[0002]脑脊液(Cerebrospinal fluid, CSF)为略带粘性的无色透明液体,充满了大脑各脑室、蛛网膜下腔和脊髓中央管内；脑脊液由脑室中的脉络丛产生，供应脑细胞一定的营养，运输脑组织的代谢产物，调节中枢神经系统的酸碱平衡，并对脑与脊髓有保护和支持作用，缓冲脑和脊髓所承受的压力。
[0003]研究和分析脑脊液对神经系统疾病及相关药物的研究至关重要；神经系统的病变通常会引起脑脊液理化性质和代谢产物的改变，并引发一系列临床症状，通过对脑脊液的理化、动力学检查，可明确疾病诊断；在药物研发方面，既可通过对脑脊液的分析来研究神经系统疾病的动物模型，也可通过检测脑脊液中的药物浓度来探索药物是否已有效地通过了血脑屏障，进而更精确地评估药物的有效性和靶向特征。
[0004]目前在生物医药研究领域，脑脊液的采集主要是在大鼠、小鼠上进行，少数有条件和实力的研究机构则在狗和非人灵长类实验动物上进行，如:食蟹猴、恒河猴，而由于与人类在遗传学上更为接近，所以在研究中分析来自非人灵长类实验动物的脑脊液无疑对人类神经疾病模型的研究更有意义。通常采集非人灵长类实验动物的脑脊液采用腰椎穿刺术，根据需要也可由小脑延髓池或侧脑室穿刺获取，但后者操作过程中要注意穿刺进针的方向和力度，否则非常容易造成脊髓损伤；但传统的穿刺术只能在动物麻醉状态下进行一次性采集，若要进行药物作用的自身前后对比，则必须进行多次穿刺，造成较大的重复创伤；若要进行动态的理化分析或药物代谢动力学研究时，则多采用分批采集不同个体动物的脑脊液的方法满足多时间点的数据要求，不仅动物数量较大，而且往往意味着高昂的研究成本；而且在麻醉状态下进行脑脊液采集，麻醉剂对有关成分或药物的影响是无法预期的，可能会导致不准确的分析结果；另外，腰椎穿刺术、小脑延髓池穿刺术和侧脑室穿刺术所采集到的脑脊液并不完全相同，在成分比例上略有差异；所以迫切需要一种可以连续、多次、微创，并在动物清醒状态下采集脑脊液的技术。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种可以在非人灵长类实验动物体上，连续、多次地在清醒状态下采集脑脊液，实现动态的同一动物的连续多次采样。
[0006]本发明提供了非人灵长类实验动物的脑脊液动态采集方法，它包括如下操作步骤:
[0007](I)硬膜外穿刺:
[0008]非人灵长类实验动物采取侧卧位，用硬膜外套管针在L3与L4或L4与L5腰椎之间进针，并将穿刺点标记为A，穿刺针头斜面与身体纵轴平行，朝向头部；出现落空感后，将穿刺针斜面旋转至与身体纵轴垂直，并使斜口朝向头部；
[0009](2)硬膜内穿刺:
[0010]取出硬膜外套管针的针芯，将腰麻针插入硬膜外套管针，将腰麻针通过黄韧带，随后进入蛛网膜下腔，并旋转针头直至有脑脊液流出；
[0011](3)通过DSA技术的引导进行埋管:
[0012]将一针头穿刺接近动物待采集脑脊液的部位，作为定位标记B;将导引钢丝置入末端封闭硬膜外导管直至导管末端，然后取出腰麻针，将置入了导引钢丝的导管插入硬膜外套管针；在DSA数字减影设备的定向引导下，计算穿刺点A和定位标记B之间的距离，将导管的末端推送至待采集脑脊液部位；参考之前的定位标记B，通道DSA数字减影技术的三维定位功能微调导管末端的位置，取出定位标记B处的针头；
[0013](4)皮下采样接口的埋置:
[0014]在穿刺点朝头部5-lOcm处，制作切口 C，分离皮肤和皮下脂肪组织层，形成皮下空间；取出导引钢丝，将硬膜外导管引导至切口 C ;然后将采样接口的导管和硬膜外导管稳固连接；最后将采样接口缝合固定在皮下，缝合切口 C ；
[0015](5)术后恢复:
[0016]术后给予抗生素，自行恢复。
[0017](6)采集脑脊液:
[0018]采集脑脊液时，将注射器经皮插入皮下采样接口的中部，待完全插到底部，即可抽取脑脊液。
[0019]进一步地，步骤(3)中，所述待采集脑脊液的部位选自穿刺点A、枕大池或者两者之间任意脑脊液存在部位。
[0020]进一步地,步骤(4)中，切口 C长度约3cm ;皮下空间约为3x3cm。
[0021]进一步地，步骤(5)中，抗生素连续给予3天，自行恢复期约为I周。
[0022]现有的采集脑脊液的主要技术腰椎穿刺术、小脑延髓池穿刺术，侧脑室穿刺术，须在实验动物麻醉状态下进行一次性的脑脊液采集；另外也有报道经小脑延髓池穿刺的连续多次脑脊液采集技术，但由于手术操作靠近颈部及脑干，且极易损伤颈部肌肉和神经，不仅创伤较大，而且不易操作，并且不利于动物福利的保护。
[0023]本发明提供的方案是经腰椎穿刺多位点动态采集技术，在数字减影技术的引导下，经腰椎穿刺将脑脊液采集导管穿入椎管内(蛛网膜下腔)，然后再根据需要将导管固定于某一位点，最高位点可达小脑延髓池(即枕大池，可完全替代小脑延髓池穿刺术)，而穿刺点A即为采集脑脊液的最低位点。
[0024]本发明提出的新技术是指通过微创手术埋置脑脊液采集导管后，在动物恢复后可以连续、多次地在清醒状态下采集脑脊液，避免了传统的技术中只能在动物麻醉状态下进行单次采样的缺点，排除了麻醉剂的干扰，减少了手术的创伤，降低了手术操作的难度，提高了采样操作的精度。
【具体实施方式】
[0025]实施例1本发明采集方法
[0026]一、术前准备
[0027]主要器械:
[0028]数字减影血管成像平台(DSA)，心电血氧监护仪
[0029]手术耗材
[0030]超硬导丝
[0031]一次性使用麻醉穿刺包(硬膜外及腰麻联合配套)【硬膜外穿刺针，腰麻针，低阻力注射器，末端封闭硬膜外导管，硬膜外导管连接器，20ml注射器，药液过滤器】
[0032]一次性注射器:2ml，5ml
[0033]动物准备
[0034]恒河猴(4Kg_10Kg)
[0035]二、手术操作
[0036]动物麻醉及备皮
[0037]静脉推注2.5%戊巴比妥钠将动物麻醉，剂量25mg/kg ;剔除背部脊柱周围，后颈和枕骨处的体毛并消毒。
[0038]动物的固定:保持动物的侧卧位，并向内侧弓曲，同时使枕骨大孔保持较大的间隙。
[0039]三、手术方法
[0040]2.1硬膜外穿刺:动物应采取侧卧位，用硬膜外套管针针从在L3与L4或L4与L5腰椎之间的穿刺点(A)进针，穿刺针头斜面与身体纵轴平行，朝向头部；出现落空感后，将穿刺针斜面旋转90度与身体纵轴垂直，并使斜口朝向头部。
[0041]2.2硬膜内穿刺:取出硬膜外套管针的针芯，将“铅笔头样”针头(腰麻针)插入的硬膜外套管针，当腰麻针通过黄韧带时，可感觉到一种突破感，针头一旦进入蛛网膜下腔，就会有CSF流出。(如果穿刺时有创伤，CSF可能稍带血色。收集CSF时，CSF应清澈无血，除非存在蛛网膜下腔出血。如果脑脊液流出不畅，可将针头旋转90度，因为针头开口处可能被神经根堵塞。)
[0042]2.3通过DSA技术的引导进行埋管(以采集枕大池脑脊液为例):将一支20号针头穿刺接近动物的小脑延髓池(勿刺破枕骨寰椎膜)作为定位标记B ;将导引钢丝置入末端封闭硬膜外导管(直到导管末端)，然后取出腰麻针，将置入了导引钢丝的导管插入硬膜外套管针；在DSA数字减影设备的定向引导下，计算穿刺点A和定位标记B之间的距离，将导管的末端推送至枕大池位置；参考之前的定位标记B，通道DSA数字减影技术的三维定位功能微调导管末端的位置，取出定位标记B处的一次性针头。
[0043]2.4皮下采样接口的埋置:在穿刺点朝头部5-lOcm处，切开约3cm的切口 C，分离皮肤和皮下脂肪组织层，形成约3x3cm的皮下空间；取出导引钢丝，将硬膜外导管引导至切口 C ;然后将采样接口的导管和硬膜外导管稳固连接；最后将采样接口缝合固定在皮下，缝合切口 C。
[0044]2.5术后恢复
[0045]1.术后给予抗生素，连续三天。
[0046]2.恢复期约I周。
[0047]2.6采集脑脊液:
[0048]需要采集脑脊液时，可将动物的身体限制在笼具的一侧，将注射器经皮插入皮下采样接口的中部，待完全插到底部，即可缓慢抽取脑脊液。
[0049]抽取完毕后，消毒穿刺点；将抽取的脑脊液转移至保存管，以待检测。
[0050]上述方法在动物恢复后可以连续、多次地在清醒状态下采集脑脊液，实现动态的同一动物的连续多次采样，数据结果更有分析意义；相应地减少了实验动物的消耗，降低了实验动物成本；由于是微创的采样操作，无需麻醉动物，所以提高了动物的福利，同时也大大降低了 CSF采样的难度，减少了劳动力消耗。由于采样导管内置于指定位置，采集到的CSF样品质量更有保证。
【主权项】
1.非人灵长类实验动物的脑脊液动态采集方法，其特征在于:它包括如下操作步骤: (1)硬膜外穿刺: 非人灵长类实验动物采取侧卧位，用硬膜外套管针在L3与L4或L4与L5腰椎之间进针，并将穿刺点标记为A，穿刺针头斜面与身体纵轴平行，朝向头部；出现落空感后，将穿刺针斜面旋转至与身体纵轴垂直，并使斜口朝向头部； (2)硬膜内穿刺: 取出硬膜外套管针的针芯，将腰麻针插入硬膜外套管针，将腰麻针通过黄韧带，随后进入蛛网膜下腔，并旋转针头直至有脑脊液流出； (3 )通过DSA技术的引导进行埋管: 将一针头穿刺接近动物待采集脑脊液的部位，作为定位标记B ;将导引钢丝置入末端封闭硬膜外导管直至导管末端，然后取出腰麻针，将置入了导引钢丝的导管插入硬膜外套管针；在DSA数字减影设备的定向引导下，计算穿刺点A和定位标记B之间的距离，将导管的末端推送至待采集脑脊液部位；参考之前的定位标记B，通道DSA数字减影技术的三维定位功能微调导管末端的位置，取出定位标记B处的针头； (4)皮下采样接口的埋置: 在穿刺点A朝头部5-lOcm处，制作切口 C，分离皮肤和皮下脂肪组织层，形成皮下空间；取出导引钢丝，将硬膜外导管引导至切口 C ;然后将采样接口的导管和硬膜外导管稳固连接；最后将采样接口缝合固定在皮下，缝合切口 C ； (5)术后恢复: 术后给予抗生素，自行恢复； (6)采集脑脊液: 采集脑脊液时，将注射器经皮插入皮下采样接口的中部，待完全插到底部，即可抽取脑脊液。2.根据权利要求1所述的采集方法，其特征在于:步骤(3)中，所述待采集脑脊液的部位选自穿刺点A、枕大池或者两者之间任意脑脊液存在部位。3.根据权利要求1所述的采集方法，其特征在于:步骤(4)中，切口C长度约3cm ;皮下空间约为3x3cm。4.根据权利要求1所述的采集方法，其特征在于:步骤(5)中，抗生素连续给予3天，自行恢复期约为I周。
【专利摘要】本发明提供了非人灵长类实验动物的脑脊液动态采集方法。本发明提出的新技术是指通过微创手术埋置脑脊液采集导管后，在动物恢复后可以连续、多次地在清醒状态下采集脑脊液，避免了传统的技术中只能在动物麻醉状态下进行单次采样的缺点，排除了麻醉剂的干扰，减少了手术的创伤，降低了手术操作的难度，提高了采样操作的精度。
【IPC分类】A61B10/00
【公开号】CN104970835
【申请号】CN201410140816
【发明人】钟治晖, 熊涛, 叶雪飞
【申请人】四川大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月9日