塞来昔布在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及塞来昔布的药学应用，属于药物化学领域。
【背景技术】
[0002]细粒棘球蝴病(echinococcosis of the liver)亦称囊性包虫病(cysticechinococcosis，CE)，是由细粒棘球蝴绦虫(echinococcosis granulosus,Eg)的中绦期幼虫所致的一种人畜共患寄生虫病，目前尚无特效治疗药物，手术仍为唯一有效的治疗方法，但术中易造成包虫囊肿囊液外溢，使原头节残留，这是导致该病复发的最主要原因，有时候也会导致腹膜内包虫病的二次感染。
[0003]如果能寻找一种能在短时间内杀死头节又对周围正常组织损伤小的药物用于术后局部使用，对细粒棘球蝴病的治疗和预防复发将会产生积极效果。
【发明内容】
[0004]申请人在长期研究中惊喜的发现将常见的非留体类抗炎药塞来昔布用来抑制和杀灭原头节的生长具有积极效果，可应用于细粒棘球蝴病及其衍生疾病的临床治疗。
[0005]在本发明中，塞来昔布(celecoxib)是一种非留体类抗炎药，传统上用作骨关节炎，类风湿性关节炎，直肠息肉等的治疗，也可通过抑制C0X-2而抑制多种肿瘤细胞的生长，促进其凋亡。
[0006]首先，本发明公开了塞来昔布在制备治疗细粒棘球蝴病药物中的应用。
[0007]细粒棘球蝴病，既可以是动物体上的，也可以是人体上的，根据该症的临床发病部位，通常指的是囊性肝包虫病。
[0008]因此，本发明还公开了塞来昔布在制备治疗囊性肝包虫病药物中的应用。
[0009]根据需要，可使用不同浓度的塞来昔布，一般来说，为了有效的杀灭病原，塞来昔布的用药浓度不低于50 ymol/Lo
[0010]针对常见的原头节生长密度，申请人研究了不通浓度塞来昔布的杀灭效果，优选用药浓度为100-200 ymol/Lo
[0011]优选的，连续用药时间不低于2天。
[0012]在上述浓度下，对细粒棘球蝴原头节具有比较理想的抑制和杀灭效果，从而可有效治疗相关疾病。
[0013]在此基础上，本发明还公开了塞来昔布细粒棘球蝴原头节抑制剂的应用。
[0014]本领域技术人员可以理解，在多种实验环境下，尤其是动物离体实验情况下，为了防止由于动物体内的细粒棘球蝴原头节在体外的生长和头节外溢，需要加入必要的抑制剂，例如20%高渗盐水等。
[0015]与上述类似，作为抑制剂，塞来昔布的用药浓度为不低于50 ymol/L，优选为100-200 μmol/Lo
【附图说明】
[0016]图1为塞来昔布对细粒棘球蝴原头节形态的影响，其中，A:对照组原头节；B =DMSO对照组原头节；C:100 ymol/L的塞来昔布作用ID的原头节；D:100ymol/L的塞来昔布作用3D的原头节；E:150 ymol/L的塞来昔布作用ID的原头节；F:150ymol/L的塞来昔布作用3D的原头节；G:200 ymol/L的塞来昔布作用ID的原头节；H:200 ymol/L的塞来昔布作用3D的原头节。
[0017]图2为不同浓度的塞来昔布对细粒棘球蝴原头节活力的影响。
[0018]图3为不同浓度塞来昔布作用细粒棘球蝴原头节48h后磷酸化ERK2蛋白的表达效果。
【具体实施方式】
[0019]为了说明塞来昔布的应用效果，申请人进行了体外实验说明塞来昔布对细粒棘球蝴原头节的杀灭效果。
[0020]实验1:塞来昔布体外作用于细粒棘球蝴原头节的效果
[0021]取新鲜的自然感染细粒棘球蝴的绵羊肝脏，清洁羊肝表面，用75%酒精消毒表面，无菌条件下抽取含原头节的囊液，移入无菌瓶中。用PBS (pH = 7.2)清洗原头节3次至澄清，用0.1%伊红染液做染色排斥实验，98%以上拒染。肉眼观察原头节呈细白沙样均匀颗粒，活性好的原头节沉降速率快，活性不好的或者死亡的原头节沉降速率相对比较慢。
[0022]倒置显微镜下观察未经处理的原头节，虫体呈内陷型，虫体结构饱满，呈椭圆形，结构清晰完整，钙颗粒清亮而明显。将原头节分装至含10%小牛血清的RPMI1640培养基中(青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)，置37°C、5% 0)2培养箱内培养。
[0023]实验分组:塞来昔布对体外培养细粒棘球蝴原头节的影响实验分6组:RPMI1640空白对照组、DMSO组及药物作用组(50 μ mo I/L组、100 μ mol/L组、150 μ mol/L组、200 ymol/I^)o
[0024]取6孔板，每孔设5ml体系，按以上分组配制相应的培养液。
[0025]将在体外培养5天后的细粒棘球蝴原头节用PBS (pH = 7.2)清洗3遍，每组培养液中加入约2000个原头节，置37°C，5% CO2孵育箱内培养，在倒置显微镜下观察不同实验分组对细粒棘球蝴原头节形态和活力的影响。
[0026]数据统计方法:加药后24h开始，每组每天均匀抽取200 μ L培养液(平均含原头节约90-120个)，用0.1 %伊红染色15min，倒置显微镜下观察原头节的活力。活头节拒染、不着色，且有活动性；死亡或活力减弱的原头节红染着色，伴有结构破坏。计算每组每天平均死亡率。每隔4d换液一次(每组体系和浓度同第一次加药时)，连续观察，直至最大作用浓度的原头节全部死亡。实验重复三次。
[0027]实验2:塞来昔布作用后P-ERK蛋白定量表达
[0028]取出100，150，200 μ mol/L塞来昔布作用48h组，DMSO组及空白对照组的细粒棘球蝴原头节，用PH 7.2的磷酸盐缓冲液洗涤3遍，弃上清液，在电子天平中各组称取质量为1mg的细粒棘球蝴原头节，加入150 μ LRIPA裂解液，用超声粉碎仪迅速使原头节粉碎。置于冰上裂解15min。然后移入高压过且在冰上预冷的1.5mLEP管中，置4°C离心机中离心，12000g，25min，离心毕，小心抽取各管中的上清液置新的EP管中。提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量，每个泳道蛋白的溶液体积50 μ L，上样于SDS-PAGE进行电泳分离后，转移至PVDF膜，用5% BSA(内参用5%牛奶)均用TBST配制，在常温下封闭2小时。一抗(β-actin，P-ERK2)效价均为1: 1000，4°C过夜，TBST洗膜6次，每次5min，随后加辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗小鼠效价为1: 25000)室温下脱色摇床上摇动孵育2h.用TBST洗膜6次，每次5min。加入化学发光剂显影.将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的相对分子质量和净光密度值。每组实验重复5次。
[0029]实验结果:
[0030]参考图1，倒置显微镜下观察，刚从绵羊肝包虫囊肿中抽取的原头节的虫体大多呈内陷型，形态呈椭圆形、近似圆形，体部饱满，虫体各部分清晰完整，虫体内遍布着许多晶莹光亮的钙颗粒，伊红拒染，且有活动性。原头节活性不好或者死亡正常结构被破坏或显示不清，并伊红红染，且无活动性。1640培养基正常体外培养5d后无明显变化。
[0031]倒置显微镜下观察发现，不同浓度的塞来昔布作用细粒棘球蝴原头节后，开始原头节活动度较1640培养基对照组增强。药物作用3d后，各浓度药物作用组的原头节均出现不同程度的形态变化，由内陷型变为外翻型，吸盘清晰可见，随着药物作用时间的延长，原头节活动度逐渐减弱，并出现虫体边缘不规整，部分头节由于应激会出现“吐泡”现象，顶突处可见大空泡产生，头节体内钙颗粒显著减少。伊红染色可观察到原头节红染比例增加。
[0032]参考图2，显示了不同浓度塞来昔布作用后的细粒棘球原头节活力曲线。经X 2检验，各浓度塞来昔布组作用的原头节死亡率与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05 =，DMSO组作用7d后活力(95.5% ±0.5% )和对照组(96.5% ±0.3% )比较差异无统计学意义(P > 0.05)。
[0033]其中，药物作用24h后，200 ymol/L塞来昔布组，活力仅为(3.1% ±0.7%)。
[0034]从活力曲线图(图2)看出，随着药物浓度的增加和用药时间的延长，塞来昔布对原头节的抑制率增加，即药物对原头节的抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。
[0035]同时，Western blot法检测实验组100，150，200mol/L塞来昔布作用于细粒棘球蝴原头节48h (图3)，观察其对细粒棘球蝴原头节内P-ERK2蛋白表达水平的影响，以ERK磷酸化程度作为衡量ERK2信号转导通路活性指标。
[0036]测各组P-ERK2及内参β -actin蛋白的灰度值，以P-ERK2/ β -actin灰度比值进行P-ERK2蛋白表达水平的相对半定量分析。实现验结果显示，不同浓度塞来昔布(100，150, 200 ymol/L)处理细胞48h后，P-ERK2蛋白表达浓度依赖性下降，组间比较差异有统计学意义(P < 0.05)。
[0037]综合上述实验结果可以看到，不同浓度的塞来昔布对体外细粒棘球蝴原头节均有抑制作用，浓度为200 ymol/L的塞来昔布对细粒棘球蝴原头节杀伤作用最明显，随着时间的延长，抑制作用显著增加(P < 0.05 =。
[0038]在证实塞来昔布对原头节有抑制作用的基础上，探索不同浓度的塞来昔布对细粒棘球蝴原头节的形态学影响。研究结果显示，塞来昔布作用后，可导致体外细粒棘球蝴原头节的形态发生不同程度的改变。内陷型和外翻型原头节是虫体不同的存在形式。当条件适适宜时，原头节顶突内凹，可保护头钩、吸盘、微毛不受损害；当加入塞来昔布后，外翻型的原头节增多。Western blot法检测显示塞来昔布能使细粒棘球蝴原头节磷酸化ERK2表达减少，呈剂量依赖性。塞来昔布能阻断ERK2磷酸化，从而达到抑制细粒棘球蝴原头节生长的作用。间接地提示塞来昔布抑制细粒棘球蝴原头节生长作用与ERK途径有关。总而言之，塞来昔布对体外细粒棘球蝴原头节有杀伤作用。
【主权项】
1.塞来昔布在制备治疗细粒棘球蝴病药物中的应用。2.塞来昔布在制备治疗囊性肝包虫病药物中的应用。3.根据权利要求1或2的应用，其特征在于塞来昔布的用药浓度不低于50μ mol/L。4.根据权利要求3的应用，其特征在于塞来昔布的用药浓度为100-200μ mol/L。5.塞来昔布作为细粒棘球蝴原头节抑制剂的应用。6.根据权利要求5的应用，其特征在于塞来昔布的用药浓度为不低于50μ mol/L。7.根据权利要求6的应用，其特征在于塞来昔布的用药浓度为100-200μ mol/L。
【专利摘要】本发明公开了塞来昔布在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用，通过塞来昔布杀灭细粒棘球蚴病的病原-细粒棘球蚴绦虫，具有显著的抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的效果，从而实现细粒棘球蚴病的治疗。
【IPC分类】A61P33/10, A61K31/635
【公开号】CN105012319
【申请号】CN201510445931
【发明人】吕海龙, 姜玉峰, 郭文平
【申请人】吕海龙
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月27日