钙黄绿素在防治甲型流感药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物应用领域，具体涉及钙黄绿素在制备抑制甲型流感病毒药物中的 应用。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒（以下简称流感）是由黏液病毒科的RNA病毒引起的急性病毒性呼吸 道传染病，它具有感染性强，传播速度快等特点。每年世界范围内流感都会导致25-50万人 口死亡，给全球人类经济和健康带来巨大损失，是人类至今尚不能有效控制的世界性传染 病。流感病毒又根据其核蛋白（Nucleoprotein, NP)和膜蛋白（Membrane protein, MP)中 抗原特性和基因特性不同，病毒被分为甲（A)，乙（B)和丙（C)三型。其中，甲型流感病毒感 染范围广，危害大，最常见也最容易引起世界大流行和地区流行。
[0003] 由于甲型流感病毒是引起流感流行的主要病原体，因此也成为流感预防与治疗的 主要关注点。与其他两种类型流感病毒一样，甲型流感病毒表面有两种类型糖蛋白，分别是 血凝素（Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶（Neuraminidase, NA)。而甲型流感病毒根据 HA和NA的抗原特性和基因特性不同将其分为很多亚型，迄今为止，发现血凝素有15个亚 型（H1-15)，神经氨酸酶有9个亚型（N1-9)。研究发现，NA在流感病毒的感染、复制、成熟、 脱壳、释放等过程都发挥了重要的作用，使得以NA为靶点研发而成的神经氨酸酶抑制剂 (NAI)成为抗流感病毒最有效的药物。目前已在临床上市的NAI包括扎那米韦（Zanamivir ; 商品名：乐感清)、奥司他韦（Oseltamivir ;商品名：达菲）和帕拉米韦（Peramivir)。然而， NA突变而造成的耐药病毒株的出现和现有药物的副作用，使得研究和发现新的种类的NAI 显得尤为迫切。
[0004] 药物的设计与开发是一件耗资巨大而效率很低的工作，据国际上的统计，研制成 功一种新药，平均需要花费10-12年的时间，耗资2. 0-3. 5亿美元，并且这一费用正以每年 20%的速度递增。造成这种状况的一个重要原因就是缺乏深入的理论指导，因此，迫切需要 应用新的理论方法和技术加以改进。在此，我们应用计算机技术与新药设计、开发过程相结 合的计算机辅助药物设计技术，通过虚拟筛选的方法获得了新颖的具有NA抑制活性的化 合物一一钙黄绿素，以此来寻找抑制流感NA，从而抑制流感病毒的新药物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供钙黄绿素在制备防治甲型流感病毒药物中的应用。钙黄 绿素能够有效的抑制神经氨酸酶的活性，从而抑制流感病毒在体内的繁殖，进而减轻或治 愈流感患者。本发明对化合物钙黄绿素对H1N1，H3N2,安徽H7N9 (野生型）和上海H7N9 (耐药型）的神经氨酸酶进行了体外酶学抑制性的检测，发现其IC5。分别为54. 69± 11. 56， 48. 97±13. 59,59. 08±5. 37 ymol/L 和 38. 22±4. 26 ymol/L，我们又对这几种流感病毒感 染MDCK细胞并加以此种化合物进行了细胞存活率的测定，发现此化合物均能提高病毒感 染后的细胞存活率。最后我们对此种化合物钙黄绿素对流感小鼠模型的体重变化、致死率 及肺指数进行了测定，发现钙黄绿素能明显缓解流感病毒对小鼠的症状。本发明为开发以 神经氨酸酶为靶点的新药提供基础，为钙黄绿素应用于人类流感的治疗提供了参考。
【附图说明】
[0006] 图1是不同浓度钙黄绿素对H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9流感病毒神经氨 酸酶的抑制作用。
[0007] 图2是不同浓度钙黄绿素与H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9共同作用后，混合 液对MDCK细胞的损伤作用。
[0008] 图3是不同浓度钙黄绿素对感染了 H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9的MDCK细 胞的治疗作用。
[0009] 图4是不用浓度钙黄绿素对感染了 HlNl流感病毒的小鼠体重的影响。
[0010] 图5是不用浓度钙黄绿素对感染了 H3N2流感病毒的小鼠体重的影响。
[0011] 图6是不用浓度钙黄绿素对感染了安徽H7N9流感病毒的小鼠体重的影响。
[0012] 图7是不用浓度钙黄绿素对感染了上海H7N9流感病毒的小鼠体重的影响。
[0013] 图8是不用浓度钙黄绿素对感染了 H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9流感病毒 的小鼠肺中病毒载量的影响。
【具体实施方式】
[0014] 以下通过实例形式的【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明。
[0015] 实施例1。
[0016] 我们用含有甲型流感病毒的 HlNl (A/New Caledonia/20/1999)，H3N2 (A/ Fujian/411/2002)，含有重组野生型甲型流感病毒H7N9 (A/Anhui/1/2013)和耐药型甲 型流感病毒H7N9 (A/Shanghai/1/2013)的神经氨酸酶在pH 6.5 MES缓冲液（32.5mM) 中进行配制，我们将49 y L的NA液及其与不同浓度的I y L钙黄绿素的混合物加入到反应 缓冲液中，在37°C孵箱中放置30min，然后加入50 y L 20剛MU-NANA底物缓冲液，在酶标 仪上进行检测，激发波长为360nm，发射波长为450nm，检测时长8min。检测结果为，钙黄 绿素对几种流感病毒神经氨酸酶的活性抑制一半时的浓度（ICm)分别为54. 69±11. 56， 48. 97±13. 59,59. 08±5. 37 ymol/L 和 38. 22±4. 26 ymol/L。
[0017] 实施例2。
[0018] 为了检测钙黄绿素在细胞水平的抗流感作用，我们用两种不同的处理对其进行 实验：首先将钙黄绿素按浓度梯度稀释成不同浓度，I将上述溶液与100 TCID5。的甲型 HlNl，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9流感病毒等体积孵育2小时，总体积为200 y L。然后将 混合液加入到MDCK细胞中孵育2h ; II将100 TCID5。的甲型H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海 H7N9流感病毒在MDCK细胞中孵育2小时，在加入不用浓度的钙黄绿素孵育2小时。2种不 同处理稀释液都用维持液（10 y g/ml胰酶的DMEM)。2小时后，换一次上述的维持液继续培 养24小时。24小时后换含有2%血清的维持液，连续观察2~3天，用MTT法检测细胞病变 效果。上述实验均在37°C、5% CO2条件下培养。
[0019]结果如图2和图3所示，在不同处理条件下，加入钙黄绿素与流感病毒时，随着钙 黄绿素浓度的增加，细胞存活率也随着增加。说明钙黄绿素可以抑制流感病毒，保护MDCK 细胞免受病毒破坏，而且保护效应也随着钙黄绿素浓度的增加呈现浓度依赖性。
[0020] 实施例3。
[0021] 为了检测钙黄绿素在小鼠流感模型中的保护作用，我们采用50yL IOLD5。的甲 型H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9流感病毒滴鼻感染小鼠。实验小鼠随机分为6组， 分别为NC组；10 LD5。组；10 LD 5Q+50mg/kg Tamif Iu组；钙黄绿素低、中、高剂量组：10 LD5Q+50, 100, 200mg/kg钙黄绿素。每组10只，病毒攻击前1天开始给药，均采用灌胃给药 的方式，每天2次，连续7天，每只小鼠灌胃0.2ml。每天记录小鼠生存状态，体重变化。然 后在15天时，处死小鼠，记录肺重，对肺组织研磨加入PBS，后测定其NA活性。
[0022] 结果如图4、图5、图6和图7所示，说明钙黄绿素可以抑制流感感染小鼠体重的减 轻程度，改善小鼠的生存状态，使小鼠逐渐恢复到健康水平。
[0023] 结果如下表所示，说明不同浓度的钙黄绿素能显著降低流感小鼠的肺指数。
[0024] 以上结果均说明，钙黄绿素能对感染流感的小鼠起到治疗的作用，使小鼠逐渐恢 复到健康水平。
【主权项】
1. 化合物钙黄绿素在防治甲型流感药物中的应用。2. 如权利要求1中钙黄绿素以作为单一成分在防治甲型流感药物的应用。3. 如权利要求1中钙黄绿素以作为复方药物中的一种成分在防治甲型流感药物的应 用。4. 如权利要求1中钙黄绿素以口服给药方式的应用。5. 如权利要求1中钙黄绿素以注射给药方式的应用。6. 如权利要求1中钙黄绿素以喷雾吸入方式的应用。
【专利摘要】钙黄绿素在制备甲型流感病毒药物中的应用，属于药物应用领域，本发明是通过以下技术方案实施的：首先将钙黄绿素与取自H1N1，H3N2，安徽H7N9和上海H7N9病毒的神经氨酸酶液在37℃培养箱中孵育30分钟，然后加入荧光底物缓冲溶液进行检测，随后发现钙黄绿素对这几种流感病毒的神经氨酸酶均有抑制作用，然后我们检测了钙黄绿素在细胞水平上的抗甲型流感病毒的作用，发现钙黄绿素也能对感染甲型流感病毒的细胞起到防治作用，最后，我们检测了钙黄绿素对小鼠流感模型的影响，发现加入钙黄绿素后，可以明显抑制甲型流感病毒感染小鼠体重的减轻程度，使小鼠逐渐恢复到健康水平，并且能显著降低流感小鼠的肺指数。
【IPC分类】A61K31/365, A61P31/16
【公开号】CN105193785
【申请号】CN201510723092
【发明人】王烨, 房学迅, 于淼, 于大海, 王溪竹
【申请人】王烨
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月29日