神经鞘氨醇磷脂酰胆碱在制备抗乳腺癌药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种神经鞘脂类在制备抗癌药物中的应用，尤其涉及到一种神经鞘氨 醇磷脂酰胆碱（sphingosylphosphorylcholine，SPC)在制备抗乳腺癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 由于女性乳腺癌的发生率和死亡率越来越高，使其受到了更多的关注。目前乳腺 癌治疗的主要方法仍然是手术治疗结合放射及化学疗法。虽然可以在一定程度上治疗和缓 解该疾病，但是手术治疗会给患者带来一定的负面影响，并且放疗和化疗不能有效地针对 靶点，很难治愈癌症。因此，迫切需要寻找治疗乳腺癌的有效措施。
[0003] 据报道神经鞘氨醇磷脂酰胆碱（SPC)在癌症病人的腹腔液中的水平较高，说明 SPC在肿瘤的病理发生中可能具有非常重要的意义。尽管SPC能够广泛的抑制包括胰腺 肿瘤细胞，卵巢癌肿瘤细胞以及小鼠神经胶质瘤细胞等多种肿瘤细胞的增殖，但是对于肿 瘤细胞凋亡和迀移的调节具有细胞特异性；目前已报道的有SPC可以引起前列腺癌细胞系 DU145和PC3的凋亡，抑制非小细胞肺癌细胞A549的凋亡；也可以促进胰腺癌细胞的迀移， 抑制甲状腺未分化癌细胞的迀移。基于此，SPC可能是肿瘤细胞的重要调节因子。然而检 索发现SPC用于促进乳腺癌细胞凋亡和抑制乳腺癌细胞迀移等的研究及其药理和药效评 价的研究国内外还未见报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种神经鞘氨醇磷脂酰胆碱 (SPC)在制备抗乳腺癌药物中的应用。
[0005] 本发明所述的神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)分子式为：C23H49N 205P，分子量为： 464. 62,化学结构式如下：
[0007] 本发明所述的神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)在制备抗乳腺癌药物中的应用。
[0008] 其中，能有效促进乳腺癌细胞凋亡或抑制其迀移的神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)浓 度为10 μΜ。所述乳腺癌细胞优选是MDAI-MB-231乳腺癌细胞。
[0009] 为了更好地理解本发明的实质，下面结合如下的药理实验和细胞生物学及分子生 物学的方法来阐明其在制备抗乳腺癌药物中的应用。
[0010] 1.本发明所述神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)药用储存液的制备：纯甲醇溶解SPC粉 末（sigma公司，美国），分装若干管，用高纯氮气吹干-80°C冰箱保存，浓度为5mg/ml。
[0011] 2.10^1-1^-231乳腺癌细胞加入1以1~15以1系列的梯度浓度后在不同时间点的 形态学观察。
[0012] 3.定量分析SPC对MDAI-MB-231乳腺癌细胞存活的影响。
[0013] 4.定量分析SPC对MDAI-MB-231乳腺癌细胞凋亡的影响。
[0014] 5. MDAI-MB-231乳腺癌细胞加入10 μ M SPC后在不同时间点对迀移的影响。
[0015] 经上述实验的结果证实：分别用1 μ Μ、5 μ Μ、10 μ Μ、15 μ Μ的SPC处理 MDAI-MB-231乳腺癌细胞，可以发现随着时间的变化，SPC在18h，24h，48h均有明显的促存 活作用，显著有效的浓度为10 μΜ、15μΜ。并且会引起明显的MDAI-MB-231乳腺癌细胞凋 亡。然而只有10 μ Μ的SPC可以有效的抑制MDAI-MB-231乳腺癌细胞的迀移。基于此，10 μ Μ 的SPC可有望作为一个有效的用药浓度来进行抗乳腺癌药物的开发应用。
[0016] 本发明公开了一种神经鞘氨醇磷脂酰胆碱（SPC)在制备抗乳腺癌药物中的应用， 并利用大量的实验揭示了 SPC具有促进乳腺癌细胞凋亡和抑制乳腺癌细胞迀移的作用，并 且经试验筛选证明10 μ Μ的SPC有望作为一个有效的用药浓度来进行抗乳腺癌药物的开发 应用，本发明提供的应用对临床研究和开发具有特异性治疗乳腺癌的药物提供了基础，为 有效治疗乳腺癌又提供了一种内源性药物开发的途径。
【附图说明】
[0017] 图1不同浓度和时间点的SPC对DAI-MB-231乳腺癌细胞形态观察
[0018] 其中：nor正常组，ctr对照组，SPC 10 μ Μ实验组倒置显微镜观察细胞凋亡状态。
[0019] 图2不同SPC浓度和时间点的SPC对DAI-MB-231乳腺癌细胞存活的影响。
[0020] 其中显示：分别加入1 μ Μ、5 μ Μ、10 μ Μ、15 μ Μ的SPC，处理18h后SRB检测 MDAI-MB-231细胞的存活状态。
[0021] 图3不同SPC浓度和时间点的SPC对DAI-MB-231乳腺癌细胞坏死的影响
[0022] 其中显示：加入10 μ Μ的SPC分别处理18h，24h，48h乳酸脱氢酶活性测定 MDAI-MB-231细胞坏死程度。
[0023] 图4 10 μ Μ的SPC处理不同时间点对MDAI-MB-231细胞迀移的变化
[0024] 其中：A加入10 μΜ的SPC处理12h和18h后观察对MDAI-MB-231细胞迀移的影 响；
[0025] B MDAI-MB-231细胞的迀移率的统计。
[0026] 图5 Western blot检测SPC对DAI-MB-231乳腺癌细胞凋亡的影响
[0027] 其中：A 加入 1 μ M，5 μ M，10 μ Μ 的 SPC 处理，western blot 表不 Prap-Ι 和 caspase 3切割带的表达。
[0028] B Parp-1切割带的统计图。
[0029] C caspase 3切割带的统计图。
【具体实施方式】
[0030] 神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)应用液的制配：首先用纯甲醇溶解SPC粉末（sigma 公司，美国），分装若干管，用高纯氮气吹干_80°C冰箱保存，加药时用无水乙醇重新溶解应 用。
[0031] 实施例1 :
[0032] 形态学观察不同浓度和时间点的SPC对DAI-MB-231乳腺癌细胞存活的影响。
[0033] 在37°C含5% 0)2的环境下，用DMEM/10%胎牛血清培养基培养MDAI-MB-231细胞 备用。
[0034] 进行形态学观察前需将处于对数生长期的细胞用血球计数板计数按照8X 104个 细胞/ml的密度接种于小皿中，24h后，加入10 μ Μ浓度的SPC作为实验组，加入乙醇的 作为溶剂对照组（ctr对照组），而不做任何处理的作为正常组（nor正常组）。分别在 18h，24h，48h后用倒置显微镜进行观察。
[0035] 结果说明：形态图显示10 μ Μ的SPC实验组与ctr对照组和Nor正常组相比，可以 有效的促进MDAI-MB-231细胞的凋亡（见图1)。
[0036] 实施例2 :
[0037] SRB方法和LDH方法测定不同浓度和时间点的SPC对DAI-MB-231乳腺癌细胞存活 的影响。
[0038] SRB检测：首先进行实验分组，确定实验组（SPC)，对照组（control)。
[0039] 将处于对数生长期的细胞按2000个/孔的密度接种于96孔板中，种板后第24h， 移弃各孔中的旧培养液。向实验组各孔中分别加入含1 μ M、5 μ M、10 μ M、15 μ Μ浓度SPC的 培养液原液，每孔100 μ 1 ;向对照组各孔加入含乙醇的培养液，每孔100 μ 1 ;细胞培养I8h 后，弃去旧培养液，每孔加10% TCA 100 μ 1，4°C固定60min ;去离子水洗5次，风干；加入 50 μ 1 0.4%的SRB，室温染色5min (平板震荡）；弃染液，1 %的乙酸洗5次，风干；每孔加 100 μ 1的Trisbase液（10mM)，在平板震荡器上震荡5min ;酶联免疫检测仪测定A值，空白 对照调零，波长为490nm〇
[0040] 乳酸脱氢酶活性测定：将处于对数生长期的细胞接种到24孔板中，使其2 X 104个 细胞/ml ;培养24h后，移弃各孔中原有培养液，向实验组中加入含10 μ Μ度SPC的培养液， 每孔lml ;对照组各孔中只加入含相应乙醇的培养液，每孔lml ;每组设三个平行孔；分别在 18h、24h、48h后，分别将各孔中的培养液移入1. 5ml印pendorf管中；室温离心300g，10分 钟；将各管上清分别转入新的1. 5ml eppendorf管中，作为待测样品，可冷冻保存一周；按 照试剂盒说明检测样品中乳酸脱氢酶的酶活性。
[0041] 结果说明：SRB显示在18h的时间点，加入10 μΜ和15 μΜ的SPC可以有效的促进 MDAI-MB-231细胞的存活。（见图2,图3)
[0042] 实施例3 :
[0043] 形态学测量10 μ M SPC对MDAI-MB-231乳腺癌细胞在不同时间点对迀移的影响。
[0044] 将处于对数生长期的细胞用血球计数板计数按照8X 104个细胞/ml的密度接种 于小皿中，分为实验组（SPC)和对照组（control)，24h后在小皿的皿底用无菌的枪尖画上 线，使在皿底留有一部分空隙，加入10 μ M SPC培养。倒置显微镜观察并在12h和18h时测 量皿底空隙的宽度。
[0045] 结果说明：10 μΜ的SPC可以有效的抑制DAI-MB-231乳腺癌细胞的迀移。（见图 4)
[0046] 实施例4 :
[0047] Western blot检测SPC对DAI-MB-231乳腺癌细胞凋亡的影响。
[0048] 分别将培养好的加入1、5、10 μ Μ浓度的SPC作为实验组，加入乙醇的作为对照组 (ctr对照组），不做任何处理的作为正常组（nor正常组）细胞在加药处理后提取总蛋白， 将处理好细胞用1 XPBS清洗一次；弃1 XPBS后，将配置好的Western及IP细胞裂解液加 入到培养板中；裂解lOmin后，收集到1. 5ml eppendorf管中置于冰上；将收集的蛋白，在 4°C下以12000rpm离心15分钟；将上清液移至新的eppendorf离心管中，放置冰上；取出 2 μ 1蛋白悬液测蛋白浓度，分装后-20°C保存，-80°C长期保存。
[0049] BCA法测量所提取蛋白的浓度，取出10ul BSA蛋白标准品，用1 X PBS稀释到浓度 为 0· 5mg/ml ;分别取 0、1、2、4、8、12、16、20ul 的 lmg/ml BSA 蛋白，加入 1. 5ml 的 eppendorf 管内，然后在每个管内分别加1XPBS将总体积补齐到20ul ;取2ul提取的蛋白样品到 印pendorf管内，加18ul 1XPBS补足20ul ;将BCA蛋白浓度测定试剂盒中的A液和B液， 按1:50配制成反应液，每管加200ul，混匀，50°C孵育20min ;取出96孔板，每孔加200ul孵 育的溶液，562nm波长处酶标仪测定吸光值；根据蛋白标准品的吸光值绘制标准曲线，计算 样品的蛋白浓度。
[0050] Western blot :做胶，分离胶12-15%，浓缩胶5% ;100°C蛋白样品变性5min，上样 15-40 μ g ;60v恒压入胶，溴酚蓝前沿进入分离胶后，调为120v恒压跑胶；用转移槽100mA 恒流转膜，2h ;PBST配制的5 %脱脂牛奶室温封闭lh ;用PBST配制的3 %的BSA溶液按 1:1000的比例稀释一抗，PVDF膜4°C孵育过夜；PBST洗膜，3次，每次5min ;用PBS配制的 3 %的脱脂牛奶溶液将二抗按1:5000的比例稀释，室温孵育lh ;用PBST洗膜，3次，每次 5min ;ECL底物显膜；扫描显膜底片，用Image J分析凝胶电泳图并定量。
[0051] 结果说明：与正常组和对照组相比，SPC可以明显上调凋亡的相关蛋白Parp-Ι和 caspase3切割带的表达量（见图5)。
【主权项】
1. 一种神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)在制备抗乳腺癌药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征是：能有效促进乳腺癌细胞凋亡或抑制其迀移的 神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)浓度为10μM。3. 如权利要求2所述的应用，其特征是：所述乳腺癌细胞是MDAI-MB-231乳腺癌细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)在制备抗乳腺癌药物中的应用，其中能有效促进乳腺癌细胞凋亡或抑制其迁移的神经鞘氨醇磷酸胆碱浓度为10μM。本发明提供的应用对临床研究和开发具有特异性治疗乳腺癌的药物提供了基础，为有效治疗乳腺癌又提供了一种内源性药物开发的途径。
【IPC分类】A61K31/688, A61P35/00
【公开号】CN105287608
【申请号】CN201510643903
【发明人】赵静, 张尚立, 李文静, 高葭
【申请人】山东大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年9月30日