一种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种耐热保护剂活疫苗及其制备方法，尤其是一种鸡马立克氏病耐热 保护剂活疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 马立克氏病是鸡的一种淋己组织增生性肿瘤病，目前是危害养鸡业健康发展的= 大主要疫病（马立克氏病、鸡新城疫及鸡传染性法氏囊病)之一，感染的鸡群出现较高的发 病率和死亡率，成为一种世界性疾病。其病理表现为外周神经淋己样细胞浸润和增大，引起 肢(翅)麻搏，并在性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤等部位出现肿瘤样的病灶。
[0003] 疫苗免疫是防控该病的重要手段。国内常用的弱毒疫苗有两种：一种为病毒与细 胞结合的马立克氏病液氮苗，它的需用液氮保存，运输及保存条件苛刻使疫苗的长期保存 和运输受到限制；另一种为病毒脱离细胞的火鸡瘤疹病毒冻干活疫苗(HVT)，保存相对较 易，使用广泛。
[0004] 目前，马立克氏病火鸡瘤疹弱毒疫苗采用鸡胚成纤维细胞生产，大多制成冻干活 疫苗。现有的冻干疫苗生产工艺存在着生产成本较高、保存困难和免疫效果不尽理想等问 题。因此，研发一种生产成本相对较低、适于大规模生产、保护功能强的马立克氏病活疫苗 耐热冻干保护技术显得尤为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服已有技术之缺陷，提供一种鸡马立克氏病耐热 保护剂活疫苗及其制备方法，制备的鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗具有耐热性能好、保 护功能强的特点。
[0006] 本发明的目的通过W下技术方案实现的： 一种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗，是由鸡马立克氏病病毒与耐热保护剂混合冻干 而成;所述耐热保护剂是由W质量体积百分含量计的下列组分构成:薦糖8~10%，聚乙締化 咯烧酬2~4%，聚赖氨酸3~6%，酶解明胶1~2%，乳蛋白水解物2~6%，谷氨酷胺0.4~1%，L-精氨酸0.05~0.5%，甘油1~4%，芦布若尔2~5%，余量为水。
[0007] -种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，包括如下步骤： a.细胞制备：用抓TA-膜酶消化SPF鸡胚成纤维细胞，并加入细胞生长液，在36~37°C 溫度下培养20~28小时，至生成细胞单层;所述邸TA-膜酶的浓度为质量体积百分含量为1% ~3〇/〇。
[000引b.接毒:接种鸡马立克氏病病毒，加入细胞培养液体积10%的辅助培养液，按100 ~200万个/毫升复种鸡胚成纤维细胞，36~37°C继续培养2~4日。
[0009] C.收获与冻干:细胞病变达75%~85%时，弃去90%细胞培养液，转动细胞培养瓶， 使细胞全部脱离瓶壁，收集、低速离屯、，取沉淀细胞并称重，加入耐热保护剂，进行匀浆和超 声波裂解，定量分装和冷冻真空干燥，制成鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗。
[0010] 上述鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，步骤a中抓TA-膜酶的消化溫度 为2~8°C，消化时间为10~18小时。
[0011] 上述鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，步骤b中辅助培养液为含有水 解乳蛋白、精氨酸和谷氨酷胺的水溶液。
[0012] 上述鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，步骤C中耐热保护剂的加入量 为每克沉淀细胞加入100~300ml。
[0013] 本发明所述疫苗及其制备方法具有W下特点： (1)本发明在耐热保护剂中添加表面活性剂芦布若尔、氨基酸聚合物聚赖氨酸，并与酶 解明胶、聚乙締化咯烧酬等最适配比，降低了病毒在冷冻和真空干燥过程中损伤，且提高了 产品在保存和使用中的稳定性。
[0014] (2)本发明采用高浓度抓TA-膜酶冷消化SPF鸡胚，显著提高了细胞产量和细胞活 性，结合细胞复种技术和直接收获病变细胞，有效提高了病毒产量，显著降低成本，为生产 高效价疫苗奠定基础。
[0015] (3)本发明在接毒后不更换细胞培养液，而是添加少量辅助液，降低了生产成本。
[0016] (4)发明的禽用耐热保护剂活疫苗，实现了疫苗储运过程中的冷藏保存，延长了保 存期，由原来-15°C W下保存18个月提高到2~8°C保存36个月。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合【具体实施方式】做进一步的说明。
[001引实施例1耐热保护剂的制备 薦糖、聚乙締基化咯烧酬(K30)和酶解明胶等耐热保护剂组方原料均为常规试剂，市场 上有售。
[0019] (1)配制耐热保护剂1 配制1000 ml耐热保护剂:称取薦糖lOOg、聚乙締化咯烧酬(K30)40g、聚赖氨酸60g、酶解 明胶lOg、乳蛋白水解物20g、谷氨酷胺4g、L-精氨酸0.5g、甘油10ml、芦布若尔50g加入去离 子水中并定容到1000ml，制得耐热保护剂1，除菌备用。
[0020] (2)配制耐热保护剂2 配制1000 ml耐热保护剂:称取薦糖80g、聚乙締化咯烧酬化30)30g、聚赖氨酸30g、酶解 明胶20g、乳蛋白水解物60g、谷氨酷胺10g、L-精氨酸5g、甘油40ml、芦布若尔30g加入去离 子水中并定容到1000ml，制得耐热保护剂2,除菌备用。
[0021 ]辅助培养液为含有水解乳蛋白、精氨酸和谷氨酷胺的水溶液，水解乳蛋白、精氨酸 和谷氨酷胺的含量(m: V)依次为50~150g/L、0.70~2. lOg/L和1~3g/L。
[0022] 实施例2鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备 鸡马立克氏病火鸡瘤疹病毒(FC126株)毒种购自中国兽医药品监察所。
[0023] (1)细胞制备 将10日龄SPF鸡胚放入2000ml螺口瓶（30胚/瓶），加入浓度为2%(m: V)的抓TA-膜酶 45ml，在4°C的条件下消化SPF鸡胚16小时，纱布过滤，滤液经1500巧m离屯、10分钟，弃上清。 向沉淀中加入60ml细胞生长液制得细胞悬液，并进行细胞计数。用细胞生长液将细胞密度 调整至150万个/ml,接入细胞培养瓶，36~37°C培养24小时，长成致密的细胞单层。本次试 验消化获得纤维细胞的活细胞数为3 X IO8个/胚，约为常规方法的2倍。
[0024] (2)接毒 按体积百分含量(V: V)2%接种鸡马立克氏病病毒于细胞培养液中，然后加入辅助培养 液，辅助培养液的加入量为细胞培养液体积百分含量10%(V:V)，并按100万个/毫升复种鸡 胚成纤维细胞，36~37°C继续培养。辅助培养液为含有水解乳蛋白、精氨酸和谷氨酷胺的水 溶液，浓度依次为50g/L、0.70g/L和3g/L。
[0025] (3)收获与冻干 培养至72小时，细胞病变达80%时收获，弃去90%细胞培养液，转动细胞培养瓶，使细胞 全部脱离瓶壁，将细胞收集于离屯、瓶中，20(K)rpm离屯、10分钟，取沉淀细胞，并称重。按照每 克沉淀细胞中加入200ml耐热保护剂的量，分别加入上述制备好的耐热保护剂1和耐热保护 剂2，然后进行匀浆和超声波裂解，最后将裂解的细胞液进行定量分装和冷冻真空干燥，审U 成鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗1和鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗2。
[0026] 按照农业部297号公告（鸡马立克氏病火鸡瘤疹病毒耐热保护剂活疫苗制造及检 验试行规程、同类耐热苗行业标准)方法制备同类耐热苗作为对照1;按照《中华人民共和国 兽用生物制品规程》(2000版XW下简称"规程"）方法制备常规苗作为对照2。
[0027] (4)疫苗稳定性测定 ① 检测冷藏保存的稳定性:于冻干前、冻干后2~8°C放置0、6、12、24和36个月时随机取 样测定病毒含量，3瓶/次。结果见表2 ② 检测37°C保存的稳定性:每批取20瓶，于37°C放置0、5、10和15天时随机取样测定病 毒含量，3瓶/次。结果见表1、2 表1不同保存期鸡马立克氏病活疫苗病毒含量检测结果(2~8°C) 单位:P即/羽
表2不同保存期鸡马立克氏病病毒含量检测结果(37°C) 单位:P即/羽
由W上结果可W看出：采用本发明方法制备的两组鸡马立克氏病活疫苗，在2~8°C条 件下保存36个月其病毒含量下降幅度不大，病毒含量远高于"规程"标准中鸡马立克氏病活 疫苗病毒含量应含2000 PFU/羽的要求，保存期在36个月时疫苗中病毒存活率高达78%;对 照U同类耐热苗)和对照2(常规苗)2~8°C条件下保存，病毒含量下降较快，对照1保存期为 24个月时病毒存活率仅为52%、对照2保存期仅为6个月，6个月的病毒存活率为67%。
[0028] 37°C条件下保存15天其病毒含量下降幅度不大，病毒含量远高于"规程"规定，保 存期在15天时疫苗中病毒存活率高达79%;对照1(同类耐热苗）、对照2(常规苗)37°C条件下 保存，病毒含量下降较快，对照1保存期为10天、对照2保存期不足5天。
[0029] 另外，本次制苗SPF胚用量30枚，制得1000羽/瓶的耐热苗304瓶，冻干前8000PFU/ 羽，单胚可W生产病毒量为8.1 X IO7PFU,是常规方法的4~10倍(常规方法单胚生产病毒量 为 0.8 ~2.0Xl〇7pFU)。
【主权项】
1. 一种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗，其特征在于，由鸡马立克氏病病毒与耐热保 护剂混合冻干而成;所述耐热保护剂是由以质量体积百分含量计的下列组分构成:蔗糖8~ 10%，聚乙烯吡咯烷酮2~4%，聚赖氨酸3~6%，酶解明胶1~2%，乳蛋白水解物2~6%，谷氨酰 胺0.4~1%，L一精氨酸0.05~0.5%，甘油1~4%，芦布若尔2~5%，余量为水。2. -种根据权利要求1所述的鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在 于，包括如下步骤： a. 细胞制备：用EDTA-胰酶消化SPF鸡胚成纤维细胞，并加入细胞生长液，在36~37°C 温度下培养20~28小时，至生成细胞单层;所述EDTA-胰酶的浓度为质量体积百分含量为1% ~3%; b. 接毒:种入鸡马立克氏病病毒，加入细胞培养液体积10%的辅助培养液，按100~200 万个/毫升复种鸡胚成纤维细胞，36~37°C继续培养2~4日； c .收获与冻干:细胞病变达75%~85%时，弃去90%细胞培养液，转动细胞培养瓶，使细 胞全部脱离瓶壁，收集、低速离心，取沉淀细胞并称重，加入耐热保护剂，进行匀浆和超声波 裂解，定量分装和冷冻真空干燥，制成鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗。3. 根据权利要求2所述的鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于， 步骤a中EDTA-胰酶的消化温度为2~8°C，消化时间为10~18小时。4. 根据权利要求3所述的鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，步 骤b中辅助培养液为含有水解乳蛋白、精氨酸和谷氨酰胺的水溶液。5. 根据权利要求4所述的鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，步 骤c中耐热保护剂的加入量为每克沉淀细胞加入100~300ml。
【专利摘要】本发明公开了一种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。本发明鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗由病毒液与耐热保护剂混合冻干而成；其耐热保护剂组方包括：蔗糖8～10%、聚乙烯吡咯烷酮2～4%、聚赖氨酸3～6%、酶解明胶1～2%、乳蛋白水解物2～6%、谷氨酰胺0.4～1%、L－精氨酸0.05～0.5%、甘油1～4%、芦布若尔2～5%；本发明通过胰酶冷消化、接毒后添加辅助液提高生产效率、降低成本；通过添加耐热保护剂，降低了病毒在冷冻和真空干燥过程中损伤，提高了产品在保存和使用中的稳定性；本发明方法制备的鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗，实现了储运过程中冷藏保存，保存期延长到2～8℃保存36个月。
【IPC分类】A61K47/42, A61P35/00, A61K39/245, A61K47/32, A61K47/34
【公开号】CN105497888
【申请号】CN201511000683
【发明人】何平有, 韩佳丽, 邹立宏, 马明, 柳珊, 郁宏伟, 刘涛, 梁武, 朱秀同, 杨保收
【申请人】瑞普（保定）生物药业有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月29日