硝酸盐防治恶性肿瘤的新用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及硝酸盐及其相关制剂在预防和治疗恶性肿瘤方面的新用途，属于医药卫生领域。
【背景技术】
[0002]硝酸盐是自然界广泛存在的一种无机物，植物能够吸收和利用土壤中的硝酸盐以供应体内所需的氮元素。食物中的硝酸盐大部分来源于绿色蔬菜中。传统的观点认为，饮食中的硝酸盐和亚硝酸盐类具有潜在的致癌倾向，随后人们认识到，亚硝酸盐只有跟胺类物质结合形成亚硝酸胺类化合物，且达到一定的浓度时，才会显现出致癌作用。目前，硝酸盐及其下游通路产生的一氧化氮(Nitric 0xide，N0)在降低血压，调节血管张力，承担神经信号传递信号分子和免疫调节等方面的确切作用已经达到共识，这种通过外源性硝酸盐的加载，增加体内硝酸盐及其下游通路NO等的表达水平，为某些疾病的防治开辟了一条新的途径。
[0003]口腔鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，近年来发病率有增高趋势，临床上由于肿瘤生长快、浸润性强，常发生早期颈淋巴结转移，常采取手术、放疗、化疗和靶向治疗等的综合治疗手段，预后较差。
[0004]目前，尚未有研究或专利报道硝酸盐饮食在预防和治疗肿瘤方面的应用。
【发明内容】
[0005]本发明人发现，硝酸盐饮食明显减缓口腔癌裸鼠移植瘤的快速增长，而硝酸盐的应用对裸鼠体重无明显变化。
[0006]我们发现，采用富含硝酸盐的饮食可以移植肿瘤快速增长，其每日摄取的硝酸盐浓度为0.5mmol/Kg即可。
[0007]我们发现，硝酸盐可以明显抑制口腔癌细胞的增殖及迀移，促进口腔癌细胞的凋亡。
[0008]本发明的发现可应用于预防、治疗口腔癌，对全身肿瘤的治疗也具有借鉴意义。
【附图说明】
[0009]图1为硝酸盐饮食对口腔癌CAL27细胞裸鼠移植瘤体积的影响。结果示硝酸盐饮食明显减缓口腔癌移植瘤体积的快速增长。
[0010]图2为硝酸盐饮食对口腔癌CAL27移植裸鼠体重的影响。结果示硝酸盐的应用对裸鼠体重无明显变化。
[0011]图3为硝酸盐对口腔癌CAL27细胞形态的影响。结果示倒置显微镜下，对照组细胞贴壁生长，细胞呈梭形或多角形，胞浆丰富，生长旺盛，相邻细胞生长融合成片。加入10mM的硝酸钠后，CAL27细胞开始变小、变圆，折光性增强，细胞贴壁性降低，呈现典型的凋亡形态，镜下可见染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变。
[0012]图4为硝酸盐对口腔癌CAL27细胞增殖的影响。结果示高浓度硝酸盐(30mM以上浓度)明显抑制肿瘤细胞的增殖。
[0013]图5为硝酸盐对口腔癌CAL27凋亡的影响。结果示10mM的硝酸盐明显促进肿瘤细胞凋亡。
[0014]图6为硝酸盐对口腔癌CAL27细胞迀移的影响。结果示50mM明显抑制口腔癌细胞的迀移。
【具体实施方式】
[0015]1、口腔癌裸鼠移植瘤模型的建立
[0016]选择4周龄雌性裸鼠为实验动物，常规培养人口腔鳞癌细胞系CAL27，按2.5X 17/ml浓度，以0.2ml/只推注入裸鼠右后肢腹股沟皮下。当瘤体进入快速增长期时给予各组处理因素。
[0017]2、硝酸盐饮水给药及裸鼠移植瘤观察
[0018]实验分为对照组和Nitrate组，每组10只。Nitrate组给予硝酸钠饮水，浓度为
2.5mmoI/L，每只大鼠每日摄取的硝酸盐含量约为0.5mmoI/Kg b.w.，连续硝酸盐饮水I个月，对照组正常饮水。定期记录移植瘤瘤体体积及裸鼠体重。
[0019]3、硝酸盐对口腔癌细胞增殖、凋亡及迀移的影响
[0020](1)CCK8 检测增殖
[0021]在96孔板中接种ΙΟΟμΙ细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24小时(在37°C，5%C02的条件下)，随后将培养板在培养箱孵育72小时，每孔换新的培养基ΙΟΟμΙ，并向每孔加入10μI CCK-8溶液。2小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0022](2)流式细胞术检测凋亡
[0023]I)细胞接种6孔板，药物处理后，用不含EDTA的胰酶消化收集；
[0024]2)用PBS洗涤细胞2次，离心，收集细胞；
[0025]3)加入500μ1 的Binding Buffer悬浮细胞；
[0026]4)加入5μ1 Annexin V-FITC混勾后，加入5μ1 Propidium 1dide，混勾；
[0027]5)室温、避光，反应5_15min;
[0028]6) Ih内上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
[0029](3)划痕法检测细胞迀移
[0030]将细胞分别于6孔板中培养，细胞生长至完全汇合后使用200μ1灭菌吸样枪头将细胞划痕，I X PBS洗I次，用含10 %新生牛血清的RPMI1640培养基继续培养6h，使细胞恢复再换用含0.5%胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养，在倒置显微镜下观察机械划伤后即刻(Oh)各划痕部位并照相，24h后，再次在倒置显微镜下观察机械划痕并照相。
[0031]4、统计学方法
[0032]采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析，多组计量资料比较采用ANOVA分析，P<0.05有统计学意义。
【主权项】
1.硝酸盐用于口腔癌及全身肿瘤的预防和治疗。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的硝酸盐选自硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙及其组合，包括富含硝酸盐的食物及提取物。3.根据权利要求1-2所述的应用，其特征在于，所述的防治肿瘤的药物的剂型为片剂、胶囊、丸剂、注射剂、糖浆、口服液、颗粒剂或贴剂。
【专利摘要】本研究选择人口腔鳞癌细胞系CAL27为研究对象为研究对象，建立口腔癌裸鼠移植瘤模型，在此基础上给予硝酸钠饮水(0.5mmol/Kg？b.w.)，1个月后处死动物，结果发现硝酸盐饮食明显减缓口腔癌移植瘤体积的快速增长，而硝酸盐的应用对裸鼠体重无明显变化。此外，我们对口腔癌CAL27细胞体外加入硝酸钠，发现高浓度硝酸盐可以明显移植肿瘤细胞的增殖、促进凋亡，对肿瘤细胞的迁移同样起到明显的抑制作用。总之，我们首次发现硝酸盐对口腔癌的抑制作用，提示其在口腔癌乃至全身肿瘤防治中的重要性。
【IPC分类】A61K33/00, A61K33/06, A61P35/00
【公开号】CN105535016
【申请号】CN201510634364
【发明人】王松灵, 庞宝兴, 曲兴民
【申请人】王松灵
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年9月30日