亨德拉病毒和尼帕病毒g糖蛋白免疫原性组合物的制作方法

亨德拉病毒和尼帕病毒g糖蛋白免疫原性组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)免疫原性组合物和使用方法。本发明还涉及区分接种了本发明的免疫原性组合物的受试者与感染了亨德拉病毒和/或尼帕病毒的受试者的方法。
【专利说明】
亨德拉病毒和尼帕病毒G糖蛋白免疫原性组合物
技术领域
[0001] 本发明涉及包含来自亨德拉病毒(HeV)的G糖蛋白的免疫原性组合物和疫苗组合 物、以及在马中的使用方法。本发明还涉及改进的给药方案，所述方案有助于在疫苗接种后 的一段较长的时间内维持升高的抗体滴度。
【背景技术】
[0002] 导致大量人类死亡的NiV的反复暴发最近一直是成问题的（参见例如Butler (2000)Nature 429,7)。还已知他￥会导致人类和动物死亡并且与附￥在遗传学和免疫学上 密切相关。目前仅已知存在一种用于预防由尼帕病毒或亨德拉病毒所引起的感染或疾病的 疫苗(W0 2009/117035)。尼帕病毒和亨德拉病毒这两者均是美国国家过敏和感染性疾病研 究所（United States,National Institute of Allergy and Infectious Disease)生物 防御关注的C类优先级病原体。此外，由于这些病毒是人畜共患病生物安全等级-4病原体 (BSL-4)，因此安全地产生疫苗和/或诊断剂是成本非常高的和困难的。因此，需要允许高通 量生产疫苗和/或诊断剂的另外的和改进的尼帕病毒或亨德拉病毒疫苗和诊断剂。
[0003]诸如HeV和NiV的副粘病毒在病毒颗粒的包|旲中具有两种主要的|旲错定糖蛋白。一 种糖蛋白是为病毒体附着到宿主细胞上的受体所必需的并且被命名为血凝素-神经氨酸苷 酶蛋白（HN)或血凝素蛋白（H)，而另一种是糖蛋白（G)，它既没有血细胞凝集作用，也没有神 经氨酸苷酶活性。附着糖蛋白是II型膜蛋白，其中分子的氨基(N)末端是朝向细胞质取向的 并且蛋白质的羧基(C)末端在细胞外。另一种主要的糖蛋白是融合(F)糖蛋白，它是一种三 聚体I类融膜包膜糖蛋白，所述糖蛋白含有两个七肽重复(HR)区和疏水性融合肽。HeV和NiV 在受体结合后经由它们的附着G糖蛋白和F糖蛋白的协同作用而引起的向接受宿主细胞中 的非pH值依赖性膜融合过程来感染细胞。HeV和NiV附着G糖蛋白的主要功能在于接合宿主 细胞的表面上适当的受体，对于大部分的被充分表征的副粘病毒来说，所述受体是唾液酸 部分。HeV和NiV的G糖蛋白利用了宿主细胞蛋白质受体肝配蛋白B2和/或肝配蛋白B3，并且 已经研发了阻断通过G糖蛋白进行的病毒附着的抗体（W02006137931;Bishop(2008) J. Virol. 82:11398-11409)。此外，已经研发了如下的疫苗，所述疫苗也使用G糖蛋白作为产 生对抗HeV和NiV感染的免疫保护性反应的手段(W02009117035)。
[0004] 给药部位反应性对于在兽医学上以及对人类在疫苗制剂中使用奎尔A(Quil A)来 说都是一个主要的问题。避免奎尔A的这种毒性的一种方式是使用免疫刺激复合物(Rajput (2007)J.Zhejiang Univ. Sci .B，8:153-161)。这主要是因为奎尔A在被并入免疫刺激复合 物中时由于它与复合物中的胆固醇的缔合降低了它从细胞膜中提取胆固醇的能力，因此降 低了它的细胞裂解效应而具有更小的反应性。此外，需要更少量的奎尔A来产生相似水平的 佐剂作用。奎尔A皂苷的免疫调节特性以及在它们被并入免疫刺激复合物中时源自于这些 皂苷的附加益处已经描述于W02000041720中。
[0005] 在单一疫苗中HeV和/或NiV G糖蛋白与免疫刺激复合物的组合代表了在研发有效 的HeV和NiV疫苗方面的进步，这是鉴于在这些组分被组合施用时免疫反应性有所增强而佐 剂副作用有所减少的潜能。

【发明内容】

[0006] 本发明涵盖了一种免疫原性组合物，所述组合物包含有效量的亨德拉病毒和/或 尼帕病毒G蛋白、免疫刺激复合物（ISC)以及一种或多种赋形剂，所述量在向受试者施用后 有效引起对抗亨德拉病毒和/或尼帕病毒的中和抗体的产生。在一些实施方案中，所述免疫 原性组合物包含皂苷、磷脂、以及类固醇。
[0007] 在一些实施方案中，可溶性亨德拉病毒G糖蛋白由天然亨德拉病毒G糖蛋白（SEQ ID N0: 2)的氨基酸73至604组成。在一些实施方案中，所述可溶性亨德拉病毒G糖蛋白是由 包含SEQ ID N0:16的核苷酸64至1662的核苷酸序列编码的。在一些实施方案中，所述可溶 性亨德拉病毒G蛋白以二聚体形式存在，其中每一个可溶性亨德拉病毒G糖蛋白二聚体亚基 由一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，所述可溶性亨德拉病毒G蛋白以四聚体形式 存在。在一些实施方案中，所述四聚体形式以非共价连接和/或由一个或多个二硫键连接的 二聚体的二聚体形式存在。在所述免疫原性组合物中可溶性亨德拉病毒G蛋白的浓度可以 是约 5μg/ml 至 100μg/ml。
[0008] 在一些实施方案中，所述阜苷是从莫利纳阜皮树(Quillaja saponaria Molina) 中分离而来并且可以选自QH-A、QH-B、QH-C或QS21。在一些实施方案中，所述磷脂选自由以 下各项组成的组:磷脂酰胆碱(PC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酸(磷脂酸酯）（PA)、 磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂酰 肌醇双磷酸酯(PIP2)、磷脂酰肌醇三磷酸酯(PIP3)、磷酸胆碱(SPH)、神经酰胺磷酰乙醇胺 (Cer-PE)、以及神经酰胺磷酰甘油。在一些实施方案中，所述皂苷是奎尔A，所述磷脂是DPPC 并且所述类固醇是胆固醇，并且在所述组合物中奎尔A:DPPC:胆固醇的比率是以重量计5: 1:1〇
[0009] 本发明还涵盖了一种在受试者中产生对抗亨德拉病毒和/或尼帕病毒的中和抗体 反应的方法，所述方法包括以有效产生所述中和抗体反应的量和持续时间向所述受试者施 用本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述中和抗体反应减少了所述受试者 体内亨德拉病毒和/或尼帕病毒的繁殖并且还可以减少所述受试者体内亨德拉病毒和/或 尼帕病毒脱落。在一些实施方案中，所述受试者尚未暴露于亨德拉病毒和/或尼帕病毒，而 在其它实施方案中，所述受试者患有亨德拉病毒和/或尼帕病毒感染。在一些实施方案中， 本发明涵盖了一种在受试者中产生对抗亨德拉病毒的中和抗体反应的方法，所述方法包括 以有效产生所述中和抗体反应的量和持续时间向所述受试者施用本文所述的免疫原性组 合物。在一些实施方案中，本发明涵盖了一种在受试者中产生对抗尼帕病毒的中和抗体反 应的方法，所述方法包括以有效产生所述中和抗体反应的量和持续时间向所述受试者施用 本文所述的免疫原性组合物。
[0010] 在一些实施方案中，肌内施用所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，分多次剂 量施用所述免疫原性组合物，并且在首次剂量后是在首次剂量后的至少约二十一天至约四 十二天时给予的第二次剂量。在一些实施方案中，在首次剂量后是在首次剂量后的二十八 天时给予的第二次剂量，进一步继而是在第二次剂量后的二十八天时给予的第三次剂量。 在一些实施方案中，在最后一次剂量后的六个月时施用加强剂量。在实施方案中，在不施用 第三次剂量的情况下，所述第二次剂量是最后一次剂量。在实施方案中，在施用第三次剂量 的情况下，所述第三次剂量是最后一次剂量。在另一个实施方案中，在加强剂量后的一年时 施用另外的剂量。在一些实施方案中，每一次剂量含有约5〇yg或约lOOyg的可溶性亨德拉病 毒G蛋白。
[0011] 本发明还涵盖了一种区分接种了本文所述的免疫原性组合物的受试者与暴露于 亨德拉病毒和/或尼帕病毒的受试者的方法，所述方法包括在从所述受试者分离的生物样 品中检测对抗选自由以下各项组成的组的以下HeV和/或NiV病毒蛋白中的任一种的至少一 种的抗体的存在:融合蛋白（F)、基质蛋白（M)、磷蛋白（P)、大蛋白（L)以及核衣壳蛋白（N)。
[0012] 本发明的免疫原性组合物和方法可以向诸如以下各项的受试者施用:人类、马、母 牛、绵羊、猪、山羊、鸡、狗或猫。
[0013] 本发明还涵盖了一种在人类受试者中产生对抗亨德拉病毒和/或尼帕病毒的中和 抗体反应的方法，所述方法包括以有效产生所述中和抗体反应的量和持续时间向所述受试 者施用免疫原性组合物，所述组合物包含亨德拉病毒可溶性G糖蛋白。在一些实施方案中， 所述免疫原性组合物还包含佐剂。
【附图说明】
[0014] 图1示出了马随时间推移的直肠温度，所述马接受了用250yg的免疫刺激复合物佐 剂化的50yg或100yg/剂的重组亨德拉病毒可溶性糖蛋白（sG)的施用，继而在第0天暴露于 活的亨德拉病毒。
[0015] 图2示出了马随时间推移的心率，所述马接受了用250yg的免疫刺激复合物佐剂化 的50yg或100yg/剂的重组亨德拉病毒可溶性糖蛋白（sG)的施用，继而在第0天暴露于活的 亨德拉病毒。
[0016] 图3描绘了用于制备免疫刺激复合物的示意图。
[0017] 图4描绘了sGHeV疫苗接种和NiV攻击方案的示意图。sGHeV疫苗接种、NiV攻击以及 安乐死的日期由箭头指示。在如所示(*)的第-42天、第-7天、第0天、攻击后的第3天、第5天、 第7天、第10天、第14天、第21天、以及第28天采集血液和拭子样品。灰色文字表示攻击时间 线(顶行）；黑色文字表示疫苗接种时间线(底行）。示出了每一个疫苗剂量组中的受试者以 及一个对照受试者的非洲绿猴(AGM)编号。
[0018] 图5描绘了受NiV感染的受试者的存活曲线。使用来自对照受试者(n = 2)和接受 sGHeV疫苗接种的受试者（n = 9)的数据来产生卡普兰-迈耶存活曲线（Kaplan-Meier survival curve)。对照包括来自一个另外的历史对照受试者的数据。被接种疫苗的受试者 接受两次皮下施用的l〇yg、50yg或100yg的sGHeV。到终末期疾病的平均时间在对照受试者 中是11天，而所有被接种疫苗的受试者存活直到在研究结束时安乐死为止。
[0019] 图6描绘了被接种疫苗的受试者中的NiV特异性免疫球蛋白和HeV特异性免疫球蛋 白（Ig)。从被接种疫苗的受试者采集血清和鼻拭子并且使用sGHeV、和sGMV多重化微球体 测定来评价IgG反应、IgA反应以及IgM反应。单独地测定来自同一疫苗剂量组(n = 3)中的受 试者的血清或拭子，并且计算微球体中值荧光强度(M.F.I.)的平均值，它示于Y轴上。误差 棒表示平均值的标准误差。血清sG特异性I g以黑色符号（sGHeV (空心三角形）、sGNi V (实心 三角形））示出，并且粘膜sG特异性IgA以灰色符号（sGHeV(空心三角形）、sGNiV(实心三角 形））示出。
【具体实施方式】 疫苗和免疫原性组合物
[0020] 本发明的疫苗和免疫原性组合物在已经接受所述组合物的施用的受试者中诱导 多种体液免疫反应和细胞免疫反应中的至少一种，或有效增强对抗HeV和/或NiV中的至少 一种毒株的至少一种免疫反应，因此所述施用适用于实现疫苗接种的目的和/或预防HeV 和/或NiV中的一种或多种毒株所引起的HeV和/或NiV感染。本发明的组合物向有需要的受 试者递送来自HeV和/或NiV的G糖蛋白，包括可溶性G糖蛋白；以及免疫刺激复合物（ISC)，所 述免疫刺激复合物充当佐剂。在一些实施方案中，G糖蛋白的量包括但不限于每毫升5yg、10 yg、15yg、20yg、25yg、30yg、35yg、40yg、45yg、50yg、75yg、1 OOyg、150yg、200yg 或 250yg，它还 可以含有每毫升 10(^8、125以8、15(^8、17548、20(^8、22548、25(^8、27548或30(^8的13(：。在 一些实施方案中，G糖蛋白的量是每毫升5yg、50yg或100yg，并且ISC的量是每毫升250yg。 A. HeV和NiV的G蛋白
[0021] 在一些实施方案中，所述疫苗和免疫原性组合物包含如本文所述的一种或多种 HeV和/或NiV的G糖蛋白。术语蛋白质在本文中宽泛地用于包括多肽或其片段。举例来说而 非限制，HeV G糖蛋白可以呈可溶性形式，并且包含Wang(2000)J.Virol.74,9972-9979中的 HeV G糖蛋白的氨基酸序列的氨基酸73-604(还参见Yu(1998)Virology 251,227-233)。还 举例来说而非限制，NiV G糖蛋白可以呈可溶性形式，并且包含Harcourt(2000)Virology 271:334-349,2000中的NiV G糖蛋白的氨基酸序列的氨基酸71-602(还参见Chua( 2000) Science，288，1432-1)。
[0022] 一般来说，HeV和NiV的G糖蛋白的可溶性形式包含HeV或NiV的G糖蛋白的胞外域 (例如细胞外）的全部或一部分，并且一般是通过使G糖蛋白的跨膜结构域的全部或一部分 以及G糖蛋白的细胞质尾区的全部或一部分缺失而产生的。举例来说，可溶性G糖蛋白可以 包含HeV或NiV的G糖蛋白的完整胞外域。还举例来说而非限制，可溶性G糖蛋白可以包含HeV 或NiV的G糖蛋白的胞外域的全部或一部分以及跨膜结构域的一部分。
[0023]本发明的可溶性HeV G糖蛋白或NiV G糖蛋白一般保留相应的天然病毒糖蛋白的 一种或多种特征，如与病毒宿主细胞受体相互作用或结合的能力、可以一种低聚形式或多 种低聚形式产生、或引出能够识别天然的G糖蛋白的抗体(包括但不限于病毒中和抗体）的 能力。另外的特征的实例包括但不限于阻止或预防宿主细胞被感染的能力。可以利用常规 的方法来评价可溶性HeV G糖蛋白或NiV G糖蛋白的一种或多种特征。
[0024]举例来说而非限制，编码可溶性HeV G糖蛋白的多核苷酸可以包含编码Wang (2000)J.Virol.74,9972-9979中的HeV G糖蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)的大约氨基 酸73-604的多核苷酸序列。还举例来说而非限制，编码可溶性HeV G糖蛋白的多核苷酸可以 包含Wang(2000)J.Virol.74,9972-9979中的HeV G糖蛋白的多核苷酸序列的核苷酸9129至 10727。此外，还可以利用编码HeV G糖蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)的大约氨基酸73- 604的经过密码子优化的多核苷酸序列。在一些实施方案中，这些经过密码子优化的序列包 含SEQ ID N0:16的核苷酸64至1662或由SEQ ID N0:16的核苷酸64至1662组成。在另外的实 施方案中，所述经过密码子优化的序列包含SEQ ID N0:16或由SEQ ID N0:16组成，所述SEQ ID NO: 16包括编码IgK前导序列的核苷酸。
[0025] 举例来说而非限制，NiV G糖蛋白可以呈可溶性形式，并且包含Harcourt(2000) Virology 271,334-349中的NiV G糖蛋白的氨基酸序列的氨基酸71-602。可以用于构建可 溶性NiV G糖蛋白的序列的非限制性实例可以见于Harcourt(2000)Virology 271,334-349 中。一般来说，来自任何尼帕病毒分离株或毒株的G糖蛋白序列均可以用于衍生本发明的多 核苷酸和多肽。
[0026]举例来说而非限制，编码可溶性NiV G糖蛋白的多核苷酸可以包含编码Harcourt (2000)Virology 271,334-349中的NiV G糖蛋白的氨基酸序列的大约氨基酸71-602的多核 苷酸序列。还举例来说而非限制，编码可溶性NiV G糖蛋白的多核苷酸可以包含Harcourt (2000)Virology 271,334-349中的NiV G糖蛋白（SEQ ID N0:4)的多核苷酸序列的234- 2042。此外，还可以利用编码NiV G糖蛋白的氨基酸序列的大约氨基酸71-602的经过密码子 优化的多核苷酸序列。
[0027] 在本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物中可以使用这些G糖蛋白的功能等同 物。举例来说而非限制，功能上等同的多肽具有以下特征中的一种或多种:与病毒宿主细胞 受体相互作用或结合的能力、可以一种或多种二聚体或四聚体形式产生、引出能够识别天 然G糖蛋白的抗体(包括但不限于HeV和/或NiV病毒中和抗体)的能力和/或阻止或预防宿主 细胞被感染的能力。
[0028] 在一些实施方案中，所述G糖蛋白可以呈二聚体形式和/或四聚体形式。这样的二 聚体取决于G糖蛋白中的半胱氨酸残基之间所形成的二硫键的形成。这样的二硫键可以对 应于当在HeV或NiV的表面中表达时天然G糖蛋白中所形成的那些（例如半胱氨酸的位置保 持不变），或可以在G糖蛋白中的存在或位置上发生改变(例如通过改变氨基酸序列中的一 个或多个半胱氨酸的位置），以形成G糖蛋白的不同二聚体形式和/或四聚体形式，这些形式 增强了抗原性。此外，在再次考虑到G糖蛋白存在许多构象依赖性表位（即由三级三维结构 产生)并且维持许多这样的天然表位对于赋予中和抗体反应来说是非常优选的情况下，非 二聚化的形式和非四聚化的形式也落入本发明内。
[0029] 本发明的HeV免疫原性组合物和疫苗组合物可以含有具有可变长度的蛋白质，但 是包括SEQ ID N0:2的氨基酸残基73至604。在本发明的一个实施方案中，本发明的包膜蛋 白与SEQ ID勵：2的拖￥糖蛋白（包括氨基酸73至604)至少约85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一。因此，本发明的!^6糖蛋白包含天然!^6糖蛋 白的具有足够数目的氨基酸以产生构象表位的免疫原性片段。免疫原性片段的非限制性实 例包括可以具有至少530个、531个、532个、533个、534个或535个或更多个氨基酸的长度的 氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HeV G糖蛋白包含SEQ ID N0:2或还包含IgK前导序列 的合成构建体（SEQIDN0:15)或由SEQIDN0:2或还包含Igκ前导序列的合成构建体（SEQ ID N0:15)组成。
[0030] 本发明的NiV免疫原性组合物和疫苗组合物可以含有具有可变长度的蛋白质，但 是包括SEQ ID N0:4的氨基酸残基71至602。在本发明的一个实施方案中，本发明的包膜蛋 白与SEQ ID N0:4的NiV糖蛋白（包括氨基酸71至602)至少约85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一。因此，本发明的附￥6糖蛋白包含天然附￥6糖蛋 白的具有足够数目的氨基酸以产生构象表位的免疫原性片段。免疫原性片段的非限制性实 例包括可以具有至少528个、529个、530个、531个、532个、或533个或更多个氨基酸的长度的 氨基酸序列。在一些实施方案中，所述NiV G糖蛋白包含SEQ ID NO:4或还包含前导序列的 合成构建体或由SEQ ID NO:4或还包含前导序列的合成构建体组成。
[0031]如本文所述的免疫原性片段含有所述抗原的至少一个表位并且显示出HeV和/或 NiV抗原性，并且在存在于合适的构建体中时，例如像在与其它HeV和/或NiV抗原融合或存 在于载体上时，能够引起免疫反应，所述免疫反应是针对天然抗原。在本发明的一个实施方 案中，所述免疫原性片段含有来自HeV和/或NiV抗原的至少20个连续氨基酸，例如来自HeV 和/或NiV抗原的至少50个、75个或100个连续氨基酸。
[0032] HeV G糖蛋白和NiV G糖蛋白实施方案还包括一种分离的多肽，所述多肽包含与天 然HeV G糖蛋白或NiV G糖蛋白具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述多肽序列可以与天然HeV G糖蛋白 或NiV G糖蛋白的氨基酸序列相同，或与天然的HeV G蛋白或NiV G蛋白氨基酸序列相比可 以包括最多一定整数个氨基酸改变，其中所述改变选自由以下各项组成的组:至少一个氨 基酸缺失;取代，包括保守取代和非保守取代;或插入，并且其中所述改变可以存在于参考 多肽序列的氨基末端或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何位置处，这些位置单独地 穿插在参考序列中的氨基酸之间或以一个或多个连续组的形式穿插于天然HeV G糖蛋白或 NiV G糖蛋白的氨基酸序列内。
[0033] 在氨基酸序列水平上的序列同一性或同源性可以通过BLAST(基本局部比对搜索 工具）分析，使用由程序131&8七卩、131&81：11、131&8七叉、1：131&81：11以及1：131&8七叉(厶]^8(311111(1997) Nucleic Acids Res.25,3389-3402;以及 Karlin(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87， 2264-2268)所用的算法来确定，所述程序被定制用于序列相似性搜索。由BLAST程序所使用 的方法在于首先考虑在查询序列与数据库序列之间具有空位(非连续)和没有空位(连续） 的相似段，然后评价所鉴定出的所有匹配的统计显著性，以及最终仅汇总那些满足了预先 选择的显著性阈值的匹配。关于序列数据库的相似性搜索中的基本问题的论述，参见 八1七8(：11111(1994)似1：1^6 661161:;^8 6，119-129。用于直方图、说明、比对、期望值（即报告相 对于数据库序列的匹配的统计显著性阈值）、截止值、矩阵以及过滤器(低复杂度)的搜索参 数处在默认设置。由13]^8七口、13138七1、1：131381：11以及1：13138七1所使用的默认计分矩阵是 BL0SUM62 矩阵（Henikoff(1992)Proc .Natl .Acad. Sci. USA 89,10915-10919)，该矩阵被推 荐用于具有超过85个氨基酸的长度的查询序列。
[0034]本发明的疫苗组合物和免疫原性组合物还可以包含来自不同毒株的另外的HeV G 蛋白和/或NiV G蛋白，所述G蛋白可以进一步加强本发明的免疫方法。 B.免疫刺激复合物
[0035] -般来说，本发明提供了包括疫苗组合物在内的免疫原性组合物，所述组合物包 含HeV和/或NiV的G糖蛋白包膜蛋白的可溶性形式与免疫刺激复合物（ISC)的组合；以及使 用这些组合物在受试者中预防和治疗HeV和/或NiV感染的方法。在本发明中，疫苗组合物 和/或免疫原组合物包含免疫刺激复合物，它充当佐剂。如本文所用的"佐剂"指的是虽然本 身不具有任何特异性抗原作用，但是可以刺激免疫系统，从而提高对抗原的反应的试剂。 [0036] ISC具有使它成为对于某些应用来说理想的佐剂的许多特征：
[0037] 节约抗原：如例如Wee(2008)Mucosal Immunol · 1,489-496中所指出，在其中抗原 的可用性是有限的或抗原成本较高的情形下，ISC已经被证实允许节约抗原多达10倍至100 倍。这最有可能是因为与其它佐剂相比提高的效率或更适当的作用机制的组合。
[0038] 交叉提呈：如例如Schnurr(2009)J. Immunol · 182，1253-1259中所指出，由抗原提 呈细胞(APC)对抗原进行的提呈通常遵循两个途径之一。外来抗原通常由APC吞噬，然后被 加工并且在主要组织相容性复合体(MHC)II类分子的背景下重新表达在APC的表面上。它们 然后能够由淋巴细胞注意到，并且如果存在恰当的共刺激因子/信号，那么在适当时对其作 出反应。自身抗原或癌抗原以及病毒抗原通常被加工并且在I类分子的背景下表达，这是因 为它们存在于APC的细胞质中。针对癌抗原和病毒抗原的有效免疫需要进入I类途径。这在 病毒感染或细胞稳态(对内部抗原的细胞更新)期间自然发生。作为疫苗所引入的抗原（病 毒或自身）需要找到它们从细胞外部到细胞的抗原加工细胞器的方式并且进入II类途径到 I类途径中。这可以在树突状细胞(DC，专职APC)中自然发生或可以通过用与作为佐剂的ISC 混合的抗原进行疫苗接种来实现。外源性抗原找到它进入抗原提呈的I类途径中的方式的 这一过程被称作交叉提呈。ISC实现抗原的交叉提呈的精确机制没有完全被阐明，但是可能 依靠 ISC组分的膜扰动作用。
[0039] 体液反应和细胞介导的反应:如例如Maraskovsky(2009) Immunol. Cell Biol. 87, 371-376中所指出，凭借ISC的作用机制，使适应性免疫系统的体液分支和细胞分支这两者 均参与。在一些物种中，这类似于通过使用这种佐剂进行疫苗接种所刺激的细胞因子的特 征。1型免疫反应的特征在于白细胞介素-2和IFN-γ表达以及针对细胞内病原体(细菌、原 生动物以及病毒)的保护，并且2型反应的特征在于白细胞介素-4的表达以及产生中和抗体 以用于抗毒素和抗病原体相关免疫。ISC在这两个极端之间提供了平衡的细胞因子特征，从 而允许免疫反应的更大宽度。此外，许多研究已经显示ISC在疫苗被鼻内递送的情况下可以 是有效的。这允许粘膜表面的致敏并且因此在这种情况下特别相关的病原体进入部位提供 了相关免疫(粘膜免疫），还参见 Sj0lailder(2001)Vaccine 19,4072-4080。
[0040] 可无菌过滤和一致的制造标准：ISC颗粒的尺寸通常是40nm的直径，从而允许它穿 过用于在配制后期对制剂进行灭菌的过滤器。此外，在研发ISC的制造方法中已经利用了如 在奎尔A中所存在的三萜皂苷与胆固醇和磷脂缔合的自然倾向。将没有形成ISC颗粒的奎尔 A物质从最终产物中透析掉。通过控制组分的比率，由一系列异质的奎尔A皂苷产生一致的 产物。这一比率是重要的，这是因为偏差会产生不属于特征性40nm颗粒的结构(螺旋、薄片 等）。ISC胶体的自由流动的性质以及它能使用透射电子显微镜法、HPLC以及其它技术被测 量的能力使得这种佐剂适合于释放测定和其它质量量度的研发。
[0041]因此，基于以上所述，在一些实施方案中，免疫刺激复合物与最佳量的G糖蛋白的 制剂包括皂苷、磷脂以及类固醇分子。在一些实施方案中，皂苷、磷脂、类固醇分子的摩尔比 是5:1:1的比率。免疫刺激复合物可以含有例如5重量％至10重量％的皂苷、1重量％至5重 量％的类固醇分子和磷脂以及包含G糖蛋白的其余部分。G糖蛋白可以直接或在将载体蛋白 (例如嵌合蛋白或融合蛋白）并入到免疫刺激复合物中之后通过与所述载体蛋白化学偶联 而被并入到免疫刺激复合物中。在提到免疫刺激复合物时，应当理解的是，包括提到其衍生 物、化学等同物以及类似物。在一些实施方案中，将ISC与HeV G糖蛋白和/或NiV G糖蛋白分 开混合，然后将G糖蛋白与ISC混合。在一些实施方案中，将G糖蛋白直接与皂苷、磷脂以及类 固醇分子混合。
[0001]合适的皂苷包括三萜皂苷。这些三萜系化合物是一组来源于植物的表面活性糖苷 并且共有共同的化学核心，所述化学核心由亲水区（通常是若干糖链)构成，所述亲水区与 类固醇或三萜系化合物结构的疏水区缔合。由于这些相似性，因此共有这种化学核心的皂 苷有可能具有相似的佐剂化特性。适用于佐剂组合物中的三萜系化合物可以来自许多来 源，无论是植物衍生的或是合成的等同物，包括但不限于皂皮树、番茄碱、人参提取物、蘑 菇、以及在结构上类似于类固醇皂苷的生物碱糖苷。
[0042] 在一些实施方案中，用于本发明中的皂苷是奎尔A和/或它的衍生物。奎尔A是从南 美树木莫利纳阜皮树中分离的一种阜苷制剂并且最初由Dalsgaard( 1974)，《阜苷佐剂 (Saponin ad juvants)》，Archiv· fiir die gesamte Virusforschung，第44卷，Springer Verlag，第243-254页描述为具有佐剂活性。已经通过HPLC分离出奎尔A的纯化片段，所述片 段保留了佐剂活性而没有与奎尔A相关的毒性(EP 0362278)，例如QS7和QS21(也被称为QA7 和QA21KQS21是源自于莫利纳皂皮树的树皮的天然皂苷，它诱导CD8+细胞毒性T细胞 (CTL)、Thl细胞以及主要的IgG2a抗体反应并且是用于本发明的背景下的一种皂苷。用于 ISC中的其它合适的皂苷包括但不限于奎尔A的QH-A、QH-B以及QH-C亚级分、来自除皂树 (Quillaia saponaria)以外的物种的那些，如来自人参属（Panax)(人参）、黄苗属 (Astragalus)、牛膝属(Achyranthes)、大豆、金合欢属(Acacia)以及党参属（Codonopsis) 的那些。在一些实施方案中，皂苷是从除皂树以外的物种中分离的。
[0043] 用于本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物中的磷脂的非限制性实例包括具有 二酰基甘油酯结构的分子和鞘磷脂。具有二酰基甘油酯结构的磷脂的非限制性实例包括磷 脂酸(磷脂酸酯）(PA)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂）(PE)、磷脂酰胆碱(卵磷脂）(PC)、二棕榈酰基 磷脂酰胆碱(DPPC)或磷脂酰丝氨酸(PS)。具有二酰基甘油酯结构的磷脂的另一个非限制性 实例包括磷酸肌醇。示例性磷酸肌醇包括但不限于磷脂酰肌醇（PI)、磷脂酰肌醇磷酸酯 (PIP)、磷脂酰肌醇双磷酸酯(PIP2)或磷脂酰肌醇三磷酸酯(PIP3)。鞘磷脂的非限制性实例 包括神经酰胺磷酸胆碱(神经鞘磷脂）（SPH)、神经酰胺磷酰乙醇胺(神经鞘磷脂）（Cer-PE) 或神经酰胺磷酰甘油。
[0044] 用于本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物中的类固醇分子包括包含类固醇作 为它们结构的一部分的分子。类固醇分子的非限制性实例包括胆固醇、孕烯醇酮、17-α-羟 基孕烯醇酮、脱氢表雄酮、雄烯二醇、孕酮、17-α-羟基孕酮、雄烯二酮、睾酮、二羟基睾酮、脱 氧皮质酮、11-脱氧皮质酮、皮质醇、皮质酮、醛固酮、雌酮、雌二醇或雌三醇。
[0045]在一些实施方案中，免疫刺激复合物通常是但不限于具有30ηΜ-40ηΜ直径的小的 笼状结构。在一些实施方案中，免疫刺激复合物的制剂具有5:1:1比率的摩尔比的奎尔Α、胆 固醇以及磷脂酰胆碱。免疫刺激复合物可以含有例如5重量％至10重量％的奎尔A、1重量％ 至5重量％的胆固醇和磷脂以及包含G糖蛋白的其余部分。G糖蛋白可以直接或在将载体蛋 白（例如嵌合蛋白或融合蛋白）并入到免疫刺激复合物中之后通过与所述载体蛋白偶联而 被并入到免疫刺激复合物中。在提到免疫刺激复合物时，应当理解的是，包括提到其衍生 物、化学等同物以及类似物。举例来说，在提到免疫刺激复合物的衍生物时，包括提到了如 下的免疫刺激复合物，其中奎尔A、胆固醇、磷脂酰胆碱或蛋白质中的一种或多种例如被除 去、取代，或其中还将除奎尔A、胆固醇、磷脂酰胆碱或蛋白质之外的组分添加到复合物中。 免疫刺激复合物的功能等同物可以是如下的免疫刺激复合物，其中它的四种组分中的一种 或多种被替换为功能等同物。在本发明的一些实施方案中，免疫刺激复合物的G糖蛋白组分 被除去。这种类型的免疫刺激复合物在本文中被称为无蛋白质免疫刺激复合物。
[0046] 在一些实施方案中，本发明包括但不限于免疫原性组合物，所述组合物包含分离 的HeV G蛋白或NiV G蛋白，所述G蛋白能够在体外诱导对抗HeV和/或NiV的多种毒株的交叉 反应性中和抗血清产生；以及佐剂，所述佐剂包含奎尔A、DPPC以及胆固醇，例如其中所述组 合物含有:5yg、50yg或100yg的可溶性HeV G蛋白或NiV G蛋白以及适量的奎尔A、DPPC以及 胆固醇。免疫刺激复合物的另外的示例性实施方案以及其制备描述于EP 0242380B1和EP 0180564B1以及W02000041720中（参见例如其中第3页和第9页，参考:Cox和Coulter(1992) 《佐剂技术和应用在利用生物技术进行动物寄生虫控制方面的进步（Advances in Adjuvant Technology and Application in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology)》，第4章，Yong(编著），CRC Press;Dalsgard( 1974)GesamteVirusforsch， 44，243-254;澳大利亚专利说明书号558258、589915、590904以及632067)。还参见美国专利 6,506,386中所述的代表性方案，以及其中对以下公知事实的提及，即可以使用如下的免疫 刺激复合物，其中在形成时将蛋白质抗原包括在免疫刺激复合物中（参见EP 0109942B1)， 或作为另外一种选择，提供预先形成的免疫刺激复合物，然后将所述免疫刺激复合物与抗 原的单独添加的等分部分混合以形成疫苗(参见EP 0436620B1)。如一般将公认的那样，还 可以使蛋白质抗原与免疫刺激复合物共价连接(再次参见EP 0180564B1)。如也是本领域公 认的那样，可以经由粘膜疫苗接种来施用免疫刺激复合物（参见Mowat( 1991) Immunology 72,317-322)并且本发明的免疫刺激复合物可以通过包括膜靶向蛋白而被进一步改进用于 粘膜疫苗接种(W0 9730728)。
[0047] 在一些实施方案中，本发明包括但不限于免疫原性组合物，所述组合物包含分离 的HeV G蛋白或NiV G蛋白，所述G蛋白能够在体外诱导对抗HeV和/或NiV的多种毒株的交叉 反应性中和抗血清产生；以及佐剂，所述佐剂包含奎尔A、DPPC以及胆固醇，例如其中所述组 合物含有:5yg、50yg或100yg的可溶性HeV G蛋白或NiV G蛋白以及适量的奎尔A、二棕榈酰 磷脂酰胆碱（DPPC)以及胆固醇。免疫刺激复合物的另外的示例性实施方案描述于 W02000041720 中。
[0048] 在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗组合物和免疫原性组合物可以是药物组 合物的一部分。本发明的药物组合物可以含有合适的药学上可接受的载体，所述载体包括 赋形剂和辅剂，所述载体有助于将活性化合物加工成可以在药学上用于递送到作用部位的 制剂。 C.赋形剂
[0049] 本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物还可以包含药学上可接受的载体、赋形剂 和/或稳定剂(参见例如《雷明顿:药物科学和实践(Remington:The Science and practice of Pharmacy)》，（2005)Lippincott Williams)，它们呈冻干制剂或水溶液的形式。可接受 的载体、赋形剂或稳定剂在所述剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且可以包括缓冲剂，如 磷酸盐、柠檬酸盐、以及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（如汞 ((邻羧基苯基)硫代）乙基钠盐(硫柳汞）、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵;氯己双铵;苯扎氯 铵、苄索氯铵;苯酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烷酯，如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙 酯；儿茶酚；间苯二酚;环己醇；3-戊醇；以及间甲酚）；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫 球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨 酸、精氨酸、或赖氨酸;单糖、二糖、以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖;螯 合剂，如EDTA;糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成盐抗衡离子，如钠;金属络合物 (例如Zn-蛋白质络合物）；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)、吐温(TWEEN)或普 鲁兰尼克(PLURONIC)。
[0050] 本发明的组合物可以处在如下的剂量，所述剂量悬浮在具有足够体积以承载所述 剂量的任何适当的药物媒介物或载体中。一般来说，包括载体、佐剂等在内的最终体积通常 将是至少1.0ml。上限由待施用的量的实用性决定，所述量一般不多于约0.5ml至约2.0ml。 使用方法
[0051] 本发明涵盖了预防和/或治疗亨德拉病毒和/或尼帕病毒感染的方法，所述方法包 括向任何哺乳动物受试者施用本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物。通过用HeV G糖蛋 白和/或NiV G糖蛋白连同本文所述的佐剂一起进行疫苗接种所引出的主动免疫可以引发 或加强细胞免疫反应或体液免疫反应。可以制备有效量的HeV G糖蛋白和/或NiV G糖蛋白 或其抗原片段与佐剂的混合物以制备疫苗。
[0052] 本发明涵盖了在人类受试者中预防和/或治疗亨德拉病毒和/或尼帕病毒感染的 方法，所述方法包括施用免疫原性组合物和/或疫苗组合物，所述组合物包含可溶性HeV G 糖蛋白和/或NiV G糖蛋白或其组合单独或与适用于人类的至少一种佐剂的组合。适用于人 类的佐剂可以被单独使用或组合使用。适用于人类的佐剂的实例包括但不限于铝盐。铝盐 的实例包括但不限于氢氧化铝、氢氧化铝凝胶(Alhydrogel?)、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾）、或 混合铝盐。适用于人类的佐剂的另外的实例包括但不限于油包水乳液、水包油乳液、以及 AS04(氢氧化铝和单磷酰脂质A的组合）以及CpG寡脱氧核苷酸。CpG寡脱氧核苷酸是合成寡 核苷酸，它们在特定的序列背景下含有未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序）。这些CpG基序在 细菌DNA中存在的频率是在哺乳动物DNA中的20倍。CpG寡脱氧核苷酸由Toll样受体9(TLR9) 识别，从而引起强免疫刺激作用。
[0053]包含HeV G糖蛋白和/或NiV G糖蛋白以及本文所述的一种或多种佐剂的疫苗组合 物或免疫原性组合物的施用可以用于实现预防目的或治疗目的。在本发明的一个方面，所 述组合物可用于实现预防目的。当被预防性提供时，所述疫苗组合物是在HeV和/或NiV感染 的任何检测或症状前提供的。有效量的所述一种或多种化合物的预防性施用用来预防或减 弱任何后续的HeV和/或NiV感染。
[0054]当被治疗性提供时，所述疫苗是在检测到实际感染的症状后以有效量提供的。如 果组合物的施用可以由接受者所耐受，那么将它说成是"药理学上可接受的"。如果所施用 的量在生理学上是有意义的，那么将这样的组合物说成是以"治疗或预防有效量"施用的。 如果本发明的疫苗组合物或免疫原性组合物的存在使得接受患者的生理发生可检测的变 化，这例如是通过增强对HeV和/或NiV的一种或多种毒株的广泛反应性体液免疫反应或细 胞免疫反应而实现的，那么它在生理学上是有意义的。所提供的保护不需要是绝对的（即 HeV或NiV感染不需要被完全预防或根除），前提条件是相对于对照群体，有统计显著性改 善。保护可以限于减轻疾病症状发作的严重程度或快速性。
[0055]本发明的疫苗组合物或免疫原性组合物可以赋予对HeV和/或NiV的多种毒株的抵 抗力。如本文所用，如果疫苗向受试者的施用使得感染的症状或病况有完全或部分的减弱 (即抑制)或使得个体对感染有完全或部分的免疫力，那么它被认为预防或减弱感染。
[0056]可以通过实现预期目的的任何手段，使用如本文所述的药物组合物来施用本发明 的至少一种疫苗组合物或免疫原性组合物。举例来说，这样的组合物的施用可以通过各种 肠胃外途径来实现，如皮下途径、静脉内途径、真皮内途径、肌内途径、腹膜内途径、鼻内途 径、透皮途径、或颊面途径。在本发明的一个实施方案中，皮下施用所述组合物。肠胃外施用 可以通过推注或通过随时间推移逐步灌注来实现。
[0057]通过活性特异性细胞免疫治疗来预防、抑制或治疗可以通过细胞免疫反应来缓解 的疾病或病况的典型方案包括施用有效量的如上文所述的疫苗组合物，所述组合物是作为 单一治疗施用的或在最多并且包括一周至约二十四个月的时间段内作为增强或加强剂量 反复施用。非限制性实例包括首次剂量，继而是在首次剂量(第〇天)后的约至少10天、11天、 12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天或24天时给予的第二 次剂量。在另一个实例中，在首次剂量后的42天时施用第二次剂量。在又另一个实例中，在 首次剂量后的28天时施用第二次剂量，继而在第二次剂量后的28天时施用第三次剂量。在 再又另一个实例中，在最后一次疫苗接种后的6个月时施用加强剂量，并且继之以在加强剂 量后的1年时进行每年的疫苗再接种。所述免疫原性组合物或疫苗组合物的剂量与在第0天 所施用的首次剂量相比可以更小、相同或更大。
[0058]根据本发明，疫苗组合物或免疫原性组合物的"有效量"是足以实现所期望的生物 效应，在这种情况下，是对HeV和/或NiV的一种或多种毒株的细胞免疫反应或体液免疫反应 中的至少一种的量。应当了解的是，有效剂量将取决于受试者的年龄、性别、健康情况、以及 体重、并行治疗（如果有的话）的种类、治疗频率、以及所期望的作用的性质。下文所提供的 有效剂量的范围不意图限制本发明并且代表了可能适用于施用本发明的组合物的剂量范 围的实例。然而，所述剂量可以被调控用于单个受试者，如本领域技术人员所了解和可确定 的那样，而无需过多的实验。
[0059] 本发明的疫苗组合物和免疫原性组合物的接受者可以是任何受试者，所述受试者 可以经由对HeV和/或NiV的细胞免疫反应或体液免疫反应而获得特异性免疫，其中所述细 胞反应是通过MHC i类或ii类蛋白所介导的。在哺乳动物当中，所述接受者可以是灵长目的 哺乳动物(包括人类、黑猩猩、猿以及猴）。在本发明的一个实施方案中，提供了一种用本发 明的疫苗组合物或免疫原性组合物治疗人类的方法。所述受试者可以感染了 HeV和/或NiV 或提供了实验研究中的HeV或NiV感染的模型。在一些实施方案中，所述受试者是驯养的哺 乳动物，包括但不限于马、母牛、公牛、水牛、绵羊、猪(Mingyi(2010)Vet.Res.41，33)、山羊、 狗（《生物安全警报：亨德拉病毒更新(Biosecurity Alert-Hendra Virus Update)》,2011 年7月27日，Press Release，Biosecurity Queensland)或猫。在一些实施方案中，所述受试 者是家禽，包括鸡。
[0060] 本发明的疫苗还以用于防止亨德拉病毒感染的剂量提供了对抗尼帕病毒感染的 交叉保护作用并且因此还提供了对抗尼帕病毒的有效疫苗接种。
[0061] 在提到有效免疫反应时，应当被理解为提到了直接或间接产生有益的预防作用或 治疗作用的免疫反应。在其中免疫原包含如本文所述的HeV G糖蛋白或NiV G糖蛋白的情况 下，这样的反应包括在动物中减少或阻止病毒繁殖和/或病毒脱落和/或减轻疾病症状。应 当了解的是，功效是功能量度并且不是单独通过参考抗HeV和/或抗NiV抗体滴度来确定的， 这是因为单独存在循环抗体并不一定指示了所述循环抗体阻止病毒繁殖和脱落的能力。
[0062] 还举例来说而非限制，如果本发明的可溶性G蛋白多肽被施用以加强感染了或疑 似感染亨德拉病毒或尼帕病毒的受试者的免疫反应和/或如果本发明的抗体是作为被动免 疫治疗的形式被施用的，那么所述组合物还可以包含例如其它治疗剂(例如抗病毒剂）。
[0063] 下文实施例4提供了有关用于对马进行疫苗接种的某些优选的组合物的信息。对 于可能感染了亨德拉病毒，并且因此需要接受疫苗接种以保护动物以及因此人类这两者防 止亨德拉病毒感染和尼帕病毒感染这两者的其它动物，以下信息一般也适用并且可以容易 由本领域技术人员调整。一般来说，伴侣动物(狗和猫)需要约25微克的亨德拉病毒抗原，并 且可以受益于25微克至150微克范围的ISC佐剂，虽然可以使用如本文所公开的组成物质中 的任一种，但是5:1:1比率的皂苷、磷脂以及固醇是优选的ISC组合物之一。对于伴侣动物， 优选的是，最终剂量是约lml。还可以使用Polygen?(MVP科技公司(MVP Technologies))，它 是一种基于共聚物的佐剂，优选以约5%-15%(v/v)使用。
[0064] 一般来说，对于更大的农畜（绵羊、母牛、猪等），本文另外对于马提供的抗原和佐 剂给药(和最终给药体积)量也适用，即可以使用50微克-100微克的抗原，以及通常约250微 克的ISC，最终体积例如是lml -3ml。对于猪来说，替代性和有效的佐剂制剂包括(对于大致 相同量的抗原来说）ISC和离子多糖的共混物，特别是在lml-3ml最终剂量体积中100mg DEAE葡聚糖和800微克ISC(再次是5:1:1的奎尔A:磷脂酰胆碱：胆固醇（参见W0 2000/ 41720))〇 被接种疫苗的动物的区分
[0065]本发明还涵盖了区分健康的被接种疫苗的动物与暴露于或感染了 HeV和/或MV的 动物的方法。在病毒感染期间，HeV和NiV表达除G糖蛋白（G)以外的另外的蛋白质，包括融合 蛋白（F)、基质蛋白（M)、磷蛋白（P)、大蛋白（L)以及核衣壳蛋白（N)。这些另外的蛋白质有以 与这些蛋白质结合的抗体或T细胞免疫的形式诱导动物的免疫反应的潜能。通常可以通过 诸如酶联免疫测定(EIA)的测定来测量对这些其它蛋白质的抗体反应的水平。在一些实施 方案中，本发明的免疫原性制剂和疫苗制剂仅含有G糖蛋白作为HeV和/或NiV抗原并且因此 将以仅针对HeV和/或NiV的G糖蛋白的抗体诱导免疫反应。接种了本文所述的免疫原性组合 物并且随后感染了HeV或NiV的动物将对G糖蛋白发动加强免疫反应，但是也将显示出对除G 糖蛋白以外的一些其它HeV和NiV蛋白质的抗体呈现的变化。因此，可以在EIA中测量针对融 合蛋白（F)、基质蛋白（M)、磷蛋白（P)、大蛋白（L)以及核衣壳蛋白（N)中的任一种的抗体的 存在来确定在血清样品中存在或不存在对这些蛋白质具有特异性的抗体。如果检测到针对 这些其它蛋白质（即除G糖蛋白以外）中的任一种的抗体，则所述动物已经暴露于HeV和/或 NiV。或者，如果没有发现针对这些其它蛋白质的抗体并且仅检测到结合G蛋白的抗体，则所 述动物只是已经被接种疫苗。
[0066]本发明的EIA在检测和区分感染了 HeV和/或NiV的动物与已经接种了本文所述的 免疫原性组合物的健康动物方面具有高特异性和高选择性。本发明可以在同质环境和异质 环境这两者中利用包括ELISA在内的多种测定程序。可以对诸如血液、血清、奶液、或含有抗 体的任何其它体液的样品进行测定程序。
[0067]在一些实施方案中，用于EIA中的抗体可以唯独与通过用G糖蛋白进行疫苗接种所 诱导的抗体竞争，但不与在动物中由感染HeV和/或NiV所诱导的抗体竞争。这不仅允许对 HeV感染和NiV感染进行血清学诊断，而且还允许在单一测定中区分了疫苗接种与感染。可 以对标准血清样品或含有抗体的任何体液或分泌物进行EIA程序。EIA程序可以使用针对G 糖蛋白和任何其它HeV和/或NiV病毒蛋白（例如融合蛋白（F)、基质蛋白（M)、磷蛋白（P)、大 蛋白（L)以及核衣壳蛋白（N)，这是因为这些蛋白质不存在于被接种疫苗的没有暴露于HeV 和/或NiV的健康的动物中）的单克隆抗体和/或多克隆抗体。可以在具有或没有计算机辅助 数据分析简化软件和硬件的许多可商购获得的固定或便携式的手动、半自动化或机器人自 动化ELISA设备中进行EIA。在一些实施方案中，可以对从驯养哺乳动物分离的生物样品进 行所述区分健康的被接种疫苗的动物与暴露于或感染了 HeV和/或NiV的动物的方法，所述 哺乳动物包括但不限于马、母牛、绵羊、猪、山羊、狗或猫。在一些实施方案中，所述受试者是 家禽，包括鸡。在一些实施方案中，所述受试者是人类。 实施例
[0068]以下实施例仅说明了本发明的某些而非所有的实施方案，并且因此不应当被视作 限制本发明的范围。 实施例1:载体构建体
[0069] 构建载体以表达跨膜/细胞质尾区缺失的HeV G或NiV G。通过PCR扩增全长HeV G 蛋白或NiV G蛋白的所克隆的cDNA以产生具有编码跨膜结构域/细胞质尾区缺失的HeV G蛋 白或NiV G蛋白的约2600个核苷酸的片段。
[0070] 合成以下寡核苷酸引物以扩增H e V G〇sHGS:5'- GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT-3'(SEQ ID NO :5)〇 sHGAS：5'- GTTTAAACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTGGGCAGGTATC-3'(SEQ ID NO:6)〇
[0071] 合成以下寡核苷酸引物以扩增N i V G。s N G S : 5 ' - CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA-3 ' ( SEQ ID NODosNCASd'- CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATTGCTCTGGTATC-3'(SEQ ID NO:8)〇 使用Accupol DNA聚合酶(PGS科技公司(PGS Scientifics Corp))，使用以下设置进行 所有的PCR反应:最初94°C，持续5分钟;然后94°C，持续1分钟；56°C，持续2分钟;72°C，持续4 分钟；25个循环。这些引物产生了由Sal 1位点侧接的sHeV G 0RF以及由Xho 1位点侧接的 sNiV G 0RF的PCR产物。将PCR产物进行凝胶纯化(快而精公司（Qiagen))。在凝胶纯化后，将 sHeV G和sNiV G亚克隆到Τ0Ρ0载体(英杰公司（Invitrogen))中。
[0072]将PSectag2B(英杰公司）购得并且修饰以含有S肽标签或myc表位标签。合成重叠 寡核苷酸，所述重叠寡核苷酸编码S肽的序列并且消化Κρη 1和EcoRl突出端。 SPEPS：5'-CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGATTCT-3'(SEQ ID NO:9)〇 SPEPAS：5,AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTTAGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC-3 ,(SEQ ID NO: 10)〇
[0073] 合成重叠寡核苷酸，所述重叠寡核苷酸编码myc表位标签的序列并且消化Kpn 1和 EcoRl突出端。 MTS：5'-CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3'(SEQ ID NO:11)〇MTAS：5'- AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC-3 '（SEQ ID NO:12)。
[0074] 将64pmol的SPEPS和64pmol的SPEPAS混合并且加热到65°C，持续5分钟，并且缓慢 冷却到50°C。将64pmol的MTS和64pmol的MTAS混合并且加热到65°C，持续5分钟，并且缓慢冷 却到50°C。将这两种混合物稀释并且克隆到Kpnl-EcoRl消化的pSecTag2B中以产生S肽修饰 的pSecTag2B或myc表位修饰的pSecTag2B。最初通过限制性消化对所有构建体进行筛选并 且通过测序进一步验证。
[0075]将Τ0Ρ0 sG构建体用Sal 1消化，进行凝胶纯化(快而精公司）并且在框内亚克隆到 S肽修饰的pSecTag2B或myc表位修饰的pSecTag2B的Xho 1位点中。最初通过限制性消化对 所有构建体进行筛选并且通过测序进一步验证。
[0076] 然后将IgK前导序列-S肽-s HeVG(sGs标签）和IgK前导序列-myc标签-sHeVG (sGmy。标构建体亚克隆到牛痘穿梭载体pMC02中。合成寡核苷酸SEQS:5'- TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTA-3 '（SEQ ID N0:13)，并且将其与寡核苷酸sHGAS组 合用于通过PCR扩增sGsfi^和sGmycfi签。使用Accupol DNA聚合酶(PGS科技公司），使用以下设 置进行所有的PCR反应:最初94°C，持续5分钟；然后94°C，持续1分钟；56°C，持续2分钟；72 °C，持续4分钟；25个循环。这些引物产生由Sal 1位点侧接的PCR产物。将PCR产物进行凝胶 纯化(快而精公司）。在凝胶纯化后，将sGstSl和sGmyc^l亚克隆到Τ0Ρ0载体(英杰公司）中。将 sG S标签和sG myc标签用Sal 1消化并且亚克隆到pMC02的Sal 1位点中。最初通过限制性 消化对所有构建体进行筛选并且通过测序进一步验证。随后产生经过密码子优化的核苷酸 序列以有助于在真核细胞系中产生，所述序列描绘于SEQ ID N0:16中。
[0077] 为了使用Chromos人工染色体表达(ACE)系统在CH0细胞中表达亨德拉病毒sG蛋 白，使用Pfx聚合酶(英杰公司），根据制造商的说明书，通过PCR扩增编码亨德拉病毒sG蛋白 的DNA。模板是p⑶NA亨德拉病毒sG(没有S肽标签）。用于扩增DNA的寡核苷酸引物是：5'_ GATATCGCCACCATGGAAACCGACACCCTG-3'（SEQ ID N0:18)和5'-GGTACCTCAGCTCTCGCTGCACTG- 3'（SEQ ID NO: 19)。使用QiaQuick凝胶提取(快而精公司），遵循制造商的说明书来对片段 进行凝胶纯化。然后将PCR产物连接到Zer〇Blunt?TOK>? (英杰公司）中，并且将连接混 合物转化到One Shot Max efficiency细胞(英杰公司）中。将来自阳性转化体的DNA纯化， 并且使用ΚρηΙ和EcoRV将sG插入序列切除，并且连接到pCTV927中，所述pCTV927是ACE系统 靶向载体(ATV)。然后将连接反应物转化到大肠杆菌OmniMax细胞(英杰公司）中。在鉴定阳 性克隆后，分离PCTV927/亨德拉病毒sG T1质粒，然后通过测序确认插入序列。 实施例2:使用CH0细胞进行的可溶性G蛋白的蛋白质产生 [0078]将来自圣路易斯(St. Loui s)的中国仓鼠卵巢(CH0)ChK2细胞解冻并且转移到容纳 CD-CH0培养基（英杰公司）和6mM Glutamax(Gibco公司）的无菌125ml烧瓶中，并且进行传 代。在转染前的1小时之时，将培养基去除并且更换为新鲜的ChK2贴壁培养基。将pCTV927/ 亨德拉病毒sG T1质粒分离，进行乙醇沉淀，并且重悬达到0.85yg/yL的浓度。用 Lipofectamine?2000(英杰公司），根据制造商的说明书，使用OptiMEM I(Gibco公司）将贴 壁细胞用ACE整合酶(pSI0343)和pCTV927/亨德拉病毒sG T1共转染。ACE整合酶由从噬菌体 λ?ΝΑ扩增，但是被优化用于哺乳动物表达的整合酶基因组成。在37°C/5%C02下将培养物与 新鲜的ChK2贴壁培养基一起孵育过夜。第二天，去除培养基，并且将细胞小心地用PBS洗涤， 继而添加2mL胰蛋白酶溶液以使细胞脱壁，并且再添加4mL新鲜的ChK2贴壁培养基。然后在 96孔板中对细胞进行有限连续稀释，继而在96孔板中沉积后的24小时之时，用2mg/mL潮霉 素(Hygromycin)选择。
[0079] 在小心监测17天后，选择80个单个转染的克隆并且将它们用含有6mM glutamax (Gibco公司）和O.lmg/ml潮霉素的lml⑶-CHO(英杰公司）（维持选择培养基)分配到24孔板 中。四天后，用维持选择培养基将克隆分到如下文所示的新的24个板中。将五百微升(yL)的 悬浮培养物从每一个表达烧瓶中取出，并且以500 Xg离心5分钟。将上清液取出并且转移到 清洁的新管中并且冷冻在-20°C。随后将所有上清液解冻并且使用NuPAGE?Novex? Bis-Tris微型凝胶（英杰公司）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。对于每一个样品运行两 组，一个用于进行凝胶染色并且另一个用于蛋白质印迹分析。使用iBlot?凝胶转移装置 (英杰公司）将第二组的凝胶转移到硝化纤维素上。使用抗G蛋白多克隆抗体作为一抗，继而 使用过氧化物酶缀合的亲和纯化的抗兔IgG抗体(罗克兰公司（Rockland))。然后通过添加 TMB膜过氧化物酶底物(KPL公司）使印迹显影。确认G蛋白的表达。 实施例3:使用牛痘进行的可溶性G蛋白的蛋白质产生
[0080]为了产生蛋白质，使用含有经过密码子优化的序列的基因构建体以产生重组痘病 毒载体(牛痘病毒，WR株）。然后使用标准技术，利用tk选择和GUS染色来获得重组痘病毒。简 单地说，使用磷酸钙转染试剂盒(普洛麦格公司(Promega))将CV-1细胞用pMC02sHeV G融合 体或pM⑶2sNiV G融合体转染。然后将这些单细胞层用牛痘病毒的西里瑟夫（Western Reserve，WR)野生型毒株以0.05PFU/细胞的感染复数(Μ0Ι)感染。2天后，收集细胞沉淀物作 为粗制的重组病毒原液。在25μg/ml的5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU) (Calbiochem公司）存在下 将ΤΙΓ细胞用重组粗制原液感染。2小时后，将病毒替换为含有1 %低熔点(LMP)琼脂糖(生命 科技公司（Life Technologies))和25μg/ml的BrdU的EMEM-10覆盖层。在孵育2天后，再添加 含有1 % LMP琼脂糖、25μg/ml的BrdU以及0.2mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸 (X-GLUC)(Clontech公司）的EMEM-10覆盖层。在24小时至48小时内，蓝色空斑是明显的，对 它们进行挑取并且再进行两轮双重选择空斑纯化。然后通过标准方法将重组牛痘病毒 vKB16(sHeV G融合体)和vKB22(sNiV G融合体)扩增和纯化。简单地说，将重组牛痘病毒通 过以下各项来纯化:空斑纯化，细胞培养扩增，在超速离心机中进行蔗糖垫沉淀以及通过空 斑测定来滴定。在细胞裂解物和培养上清液中验证sHeV G的表达。 实施例4:使用293F细胞进行的可溶性G蛋白的蛋白质产生 [0081 ]使用含有经过密码子优化的序列的基因构建体来将293F细胞(英杰公司）转化以 产生表达HeV可溶性G糖蛋白的稳定细胞系。也可以使用CH0-S细胞(英杰公司）进行转化和 表达HeV可溶性G糖蛋白。将转化的细胞用35ml DMEM-10接种到162cm2的组织培养瓶上。使 细胞贴壁并且在37 °C和5 % -8 % C02下培养几天。在细胞汇合时，将它们用含150μg/ml潮霉 素 B的DMEM-10(每个烧瓶30ml)分到多个烧瓶中。当细胞达到70%-80%汇合时，将它们用 30ml PBS洗涤两次，然后添加20ml的293SFM II(英杰公司）并且在37°C和5%-8%C02下将 细胞孵育过夜。第二天，将细胞用200ml的SFM II培养基转移到锥形瓶中。将细胞在37°C和 5 % -8 % C02下以125rpm培养5天-6天直到细胞开始死亡为止。此时，收集上清液。
[0082]将来自每一个锥形瓶的培养基以3,500rpm离心30分钟。然后将上清液转移到 250ml离心瓶中并且以10，OOOrpm旋转1小时。收集所得上清液并且根据制造商的建议添加 蛋白酶抑制剂以及添加 Triton X-100达到0· 1 %的最终浓度。然后将上清液经由0·2μπι低蛋 白结合滤膜过滤。
[0083]经由使用S-蛋白琼脂糖亲和柱将HeVsG纯化。将20ml床体积的S-蛋白琼脂糖 (Novagen公司）加入XK 26柱(通用电气医疗公司（GE Healthcare))中。将柱用10X床体积 的结合/洗涤缓冲液(0.15M NaCl、20mM Tris-HCl(pH 7.5)以及0.1%的Triton X-100)洗 涤。将所制备的HeVsG上清液施加到柱上以维持3毫升/分钟的流速。将柱用10 X床体积 (200ml)的结合/洗涤缓冲液I洗涤，继而用6 X床体积（120ml)的洗涤缓冲液1 X洗涤缓冲液 (0.15M NaCl和20mM Tris-HCl(pH 7.5))洗涤。
[0084]然后将栗停止并且使洗涤缓冲液排放直到在添加30ml洗脱缓冲液(0.2M柠檬酸， pH 2)时它到达珠粒表面为止。收集前10ml的流过液(这应当仍是洗涤缓冲液），然后将洗脱 缓冲液与珠粒一起孵育10分钟。随后，将15ml的洗脱液收集到容纳25ml的中和缓冲液（1M Tris，pH 8)的50mL无菌的尖底离心管中。将pH值调节到中性并且将洗脱和孵育重复三次。 将所有的经过中和的洗脱液合并并且浓缩到约4ml。将所收集的HeVsG(4ml)经由0.2μπι低蛋 白结合滤膜(具有〇.2μηι HT Tuffryn膜的Acrodisc 13mm注射式过滤器)纯化。
[0085]可以利用凝胶过滤将HeVsG进一步纯化。在质量控制分析和确认纯度和低聚状态 后，将四聚体+二聚体、二聚体以及单体的等分HeVsG的所汇集的级分储存在-80°C。 实施例5:对CHO HeVsG蛋白质进行γ辐照
[0086] 将CHO HeV主细胞种子储备液解冻，并且在摇瓶中通过4次连续传代按比例扩增。 将所收获的物质在生物反应器中通过3次连续传代进一步按比例扩增，达到8 X106个细胞/ 毫升的最终细胞密度。通过离心去除细胞(或者这可以通过深度过滤来进行）。然后将所得 的澄清了的HeVsG培养物质与抗坏血酸混合达到0.2 % (w/v)的最终浓度，并且经受Co-60 γ 辐照源达到50千戈瑞的累积剂量。 实施例6:疫苗制剂的制备
[0087] 概述了 ISC的制备的示意图示于图3中并且进一步描述于下文中。
[0088] 步骤1:在注射用水(WFI)中制备90g//L癸酰基-η-甲基葡糖酰胺(Mega-ΙΟ洗涤剂） 的溶液。将溶液加热以确保Mega 10完全溶解，然后将它立即用于步骤2中或过滤灭菌。 [0089] 步骤2:含有25g//L胆固醇和25g//L二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)的溶液是通过将这 些组分溶解在Mega 10洗涤剂的原液中来制备。将溶液加热以溶解所有组分，然后立即用于 步骤3中或过滤灭菌。
[0090] 步骤3:用WFI制备缓冲等渗盐水，即10mM磷酸盐缓冲液(pH6.2± 1) (BIS)并且如果 不立即使用，那么将它无菌过滤。
[0091] 步骤4:在BIS中制备奎尔A达到100g/L的最终浓度并且如果不立即使用，那么将它 无菌过滤。
[0092] 步骤5:在搅拌的温度受控的容器（22°C_37°C)中通过依次添加预热的BIS、胆固 醇/DPPC的Mega-10溶液（160ml/L)、以及奎尔A溶液(200ml/L)来配制ISC。通过添加 BIS使反 应物达到目标体积。
[0093] 步骤6:使整个制剂平衡到所需的温度（目标27°C，可接受的操作范围是22Γ-37 °C)，然后在搅拌下孵育15分钟以有助于ISC形成。将ISC溶液在步骤7中进一步处理或无菌 过滤以中间储存。
[0094]步骤7:通过在温度控制下（目标27°C，可接受的操作范围是21°C-37°C)相对于BIS 以最少20倍体积交换进行透析(膜:Hydrosart 30kDa(哥廷根的赛多利斯公司（Sartorius AG Goett ingen))来洗涤I SC反应混合物以去除未复合的组分。
[0095]步骤8:通过使用与用于透析的膜相同的膜进行超滤将透析过的ISC浓缩约2倍。用 BIS冲洗过滤系统以使I SC恢复到原始体积。
[0096] 步骤9:将ISC经由0.22μπι乙酸纤维素过滤器无菌过滤而转移到无菌储存容器中。
[0097] 步骤10:将ISC佐剂储存在2 °C -8 °C直到被释放用于疫苗制剂中为止。
[0098] 然后将免疫刺激组合物(250μg/ml)与适量的可溶性HeV G糖蛋白（例如5μg/ml、50 μg/ml、100μg/ml)组合并且在BIS中调整到一定体积。 实施例7:在马中进行的第一次临床实验
[0099]测试疫苗1:用250yg的免疫刺激复合物佐剂化的100yg/剂的重组亨德拉病毒可溶 性糖蛋白（sG);用盐水溶液将体积调整到lml/剂。
[0100] 测试疫苗2:用250yg的免疫刺激复合物佐剂化的50yg/剂的重组亨德拉病毒可溶 性糖蛋白（sG);用盐水溶液将体积调整到lml/剂。
[0101] 测试疫苗3:用250yg的免疫刺激复合物佐剂化的5yg/剂的重组亨德拉病毒可溶性 糖蛋白（sG);用盐水溶液将体积调整到lml/剂。
[0102] 已经从两批接受了含有更高水平的抗原(50yg/剂和lOOyg/剂)的疫苗的马收集到 来自马的血清学和攻击保护数据。
[0103] 血清学：各自用相隔21天的两次疫苗剂量（lOOyg sG/ISC)对两匹马进行免疫接 种。初免后和攻击前的血清学确认了疫苗诱导的向HeV的血清转化(表1)。攻击前病毒中和 抗体水平与已经被发现在暴露于原本致死剂量的密切相关的尼帕病毒的猫中具有保护性 的水平相当。仅接受佐剂的马（阴性对照)没有在病毒攻击之前产生针对HeV的抗体。 表1
[0104] 因此，使每一匹马在接受加强免疫接种后的27天时在BSL4容纳设施中暴露于活的 HeV。鼻内（1 X 106TCID5Q)和经口（1 X 106TCID5Q)施用病毒。在攻击时以及在之后的观测时间 段内，参与这一部分工作的工作人员不知道对照马的身份。
[0105] 对于VI的临床观测结果:这匹马在暴露于HeV后的观测期间在临床上保持良好，除 了在攻击后第8天时注意到留置颈静脉导管的进入部位有局部感染。这与疾病的任何全身 体征无关。在病毒攻击后的第9天使所述马择期安乐死。在肉眼死后检查时的异常局限于 l〇cm肠系膜脂肪瘤(偶然发现）以及归因于巴比妥酸盐(barbiturate)的在左心肺叶的腹侧 尖端处淋巴管的轻度扩张。对组织的初始筛选没有在这匹马中发现损伤或HeV抗原的迹象。
[0106] 对于V2的临床观测结果:这匹马在第3天时产生轻度的短暂鼻涕，但是然后在其它 方面保持良好直到在第6天时体温升高为止，所述体温升高与她的留置颈静脉导管部位处 局部炎症反应相关。将导管去除，但是损伤继续扩大并且这匹马变得非常烦躁，因此在第二 天(第7天)时，将这匹母马用长效青霉素治疗。在第8天时，她的体温和她的性情已经恢复正 常，并且将她择期安乐死。在肉眼死后检查时的异常局限于归因于巴比妥酸盐的在右心肺 叶的腹侧尖端处淋巴管的轻度扩张。对组织的初始筛选没有在这匹马中发现损伤或HeV抗 原的迹象;详细检查当前正在完成。
[0107] 对于V3的临床观测结果:这匹马在第4天时产生轻度的短暂鼻涕，但是然后在其它 方面保持良好直到在第6天时体温升高为止而没有局部体征。她的心率也已经升高，并且她 有符合轻度脱水的轻微的皮肤皱折和腹上提(tucked-up)外观。这一系列体征是在我们的 实验室条件下急性He V感染的典型。在随后的12小时内她的体温和心率继续增加（图1和图 2 )，她略微抑郁，因此在第7天时基于人道理由使她安乐死。在死后检查时，在肺的心叶上存 在淋巴管的中度严重扩张，腹侧8cm-10cm受累，伴有胸膜增厚和水肿。
[0108] 在组织学检查时，存在肺血管炎，伴有血管壁纤维素样坏死、小叶间隔水肿以及局 灶性坏死性肺泡炎。在以下各项中存在HeV抗原的广泛沉积:肺中血管的内皮和中膜;脑膜； 脑实质;三叉神经节;下颂下、支气管、腹股沟以及肾脏淋巴结;脾脏;肝脏;心脏;软腭；肾上 腺；肾小球;小肠和大肠;卵巢;咽和鼻甲；以及脾中的生发中心和偶尔的心肌细胞。脊髓、咽 鼓管囊、膀胱、以及脑的嗅极呈阴性。组织学和免疫组织学符合超急性HeV感染。
[0109] 对临床样品的分子分析:在整个临床观测期间在从接受免疫接种的马VI和V2采集 的任何生物样品中不存在HeV脱落的迹象。确切地说，在暴露后的任何一天从深鼻拭子或从 血液均没有回收到基因组。
[0110]相比之下，在没有接受免疫接种的马V3中，从攻击后的第3天开始，在鼻拭子中检 测到病毒基因组。在连续的采样日Ct值递减表明上呼吸道中的病毒复制，并且符合早先来 自我们实验室的在使首次接受实验的马暴露于HeV(雷德兰兹(Redlands)2008)后的观测结 果。在即将开始发热之前在血液中以及之后在所有的分泌物中发现病毒基因组符合对其它 临床体征(如抑郁症)的最早识别，这也符合早先的观测结果。 表2:在攻击阶段期间的样品分析结果

从攻击日开始获取样品直到使动物安乐死当天为止并且通过针对亨德拉病毒N基因的 存在所测定的TagMan PCR对样品进行分析。-意指阴性(没有扩增），+/-意指不确定(CT = 40-45)，+意指阳性(CT〈40,值在括号中），N/A =结果不可得
[0111] 死后样品:TaqMan PCR(HeV N基因）确认了在V3(对照）中攻击病毒的复制，伴有感 染向多个组织的播散(表3)。最高的复制水平似乎存在于肺、脾脏、肾脏、心肌、以及与上呼 吸道和下呼吸道相关的淋巴组织中，如先前所报告。在接受免疫接种的马(VI和V2)的组织 中不存在病毒复制的迹象。 表3:亨德拉病毒N基因 TagMan结果
从母一 Μ动物获取兆后组织样品开Μ通迓针对亨徳拉柄毐N基因的仔在所测足的 TagMan PCR对样品进行分析。-意指阴性(没有扩增），+/-意指不确定(CT = 40-45)，+意指阳 性(CT〈40,值在括号中），ND =未进行，以及N/A=由于缺少样品而结果不可得
[0112]攻击后血清学:接受免疫接种的马VI和V2在HeV攻击后没有滴度升高(表4)。这符 合在这些动物中攻击病毒没有显著复制。在对照马V3中，在攻击后第7天安乐死时，没有检 测到抗体。认为在这一动物的病毒暴露与死亡之间的时间不足以产生可检测的抗体，并且 这符合我们的实验室用HeV(雷德兰兹)在马中所得到的先前的观测结果。 表4 L〇113」 以初免-加强免疫万案接柙/l〇〇yg
sG+ISC佐刑的网匹与（VI和V2)在HeV暴露之 前向HeV进行血清转化。仅接受ISC的一匹马(V3)保持对攻击病毒呈血清阴性。
[0114] 在用原本致死剂量的HeV攻击后，接受免疫接种的马在整个观测期间在临床上保 持良好，这超过了所有在马中以实验方式诱导的HeV病例的发病时间。使没有血清学免疫力 迹象的马(V3)在产生符合急性HeV的临床体征后安乐死。在接受免疫接种的马中在攻击后 没有检测到抗体滴度的提高，这符合在这些动物中攻击病毒没有复制。
[0115] 不存在接受免疫接种的马脱落病毒的迹象，如由对所有每日临床样品所获得的 PCR阴性测试结果所反映。在没有接受免疫接种的对照中，从暴露于病毒后的第3天开始在 鼻拭子中、在即将开始发热之前在血液中、以及从产生发热之时起在所有的临床样品中检 测到病毒基因组。这种脱落模式符合在该设施处在早先的研究中在暴露于HeV的首次接受 实验的马中所发现的模式。
[0116] 在将被预期是急性感染期的期间实施安乐死后，在死后检查时所采集的接受免疫 接种的马的任何组织中没有HeV病毒复制的迹象。相比之下，HeV基因组和抗原以符合急性 HeV感染的模式分布于对照马的组织各处，并且还鉴定出HeV感染典型的血管病变。 实施例8:在马中进行的第二次临床试验
[0117] 各自用相隔21天的两次疫苗剂量(50yg sG/ISC)对三匹马进行免疫接种。初免后 和攻击前的血清学确认了疫苗诱导的向HeV的血清转化(表5)。攻击前病毒中和抗体水平与 已经被发现在暴露于原本致死剂量的密切相关的尼帕病毒的猫中以及在本文所述的第一 次临床试验中对暴露于HeV的马具有保护性的水平相当。在对接受免疫接种的马进行病毒 攻击之前，仅接受佐剂的马没有产生针对HeV的抗体(数据未示）。 表5
[0118] 因此，使每一匹接受免疫接种的马在接受加强免疫接种后的27天时在BSL4容纳设 施中暴露于活的HeV。鼻内（1 X 106TCID5Q)和经口（1 X 106TCID5Q)施用病毒。在这一研究中使 用四只豚鼠作为致病力对照，并期望这些中的至少一只将死于HeV疾病。通过腹膜内途径使 豚鼠暴露于50,000 1'(：1〇5()他￥。
[0119] 对于V4的临床观测结果:这匹马在暴露于HeV后观测期间在临床上保持良好，并且 体温和心率保持在正常限度内。在病毒攻击后的第8天时使所述马择期安乐死。在肉眼死后 检查时没有注意到异常。对组织的初始筛选没有在这匹马中发现损伤或HeV抗原的迹象;详 细检查当前正在完成。
[0120] 对于V5的临床观测结果:这匹马在暴露于HeV后观测期间在临床上保持良好，并且 体温和心率保持在正常限度内（图2)。在病毒攻击后的第7天时使所述马择期安乐死。在肉 眼死后检查时没有注意到异常。对组织的初始筛选没有在这匹马中发现损伤或HeV抗原的 迹象;详细检查当前正在完成。
[0121] 对于V6的临床观测结果:这匹马在暴露于HeV后观测期间在临床上保持良好，并且 体温和心率保持在正常限度内（图2)。在病毒攻击后的第9天时使所述马择期安乐死。在肉 眼死后检查时没有注意到异常。对组织的初始筛选没有在这匹马中发现损伤或HeV抗原的 迹象;详细检查当前正在完成。
[0122] 豚鼠：4只豚鼠中有一只（3号）在HeV攻击后的第3天时开始体重减轻。体重减轻不 断发展直到第5天在所述动物表现出神经系统体征(歪头、震颤)并且使它安乐死时为止。在 死后检查时异常局限于腹膜后结缔组织的水肿。
[0123] 在组织学检查时，存在与HeV抗原的沉积相关的肺血管炎、肾周血管的血管炎、卵 巢炎、以及非化脓性脑炎。所述组织学和免疫组织学符合急性HeV感染并且确认了攻击病毒 的致病力。
[0124] 在整个临床观测期间从V4、V5或V6采集的任何生物样品中均没有HeV脱落的迹象， 除了在第3天时来自V6的直肠拭子以外，其中在两个重复孔中的一个中通过TaqMan PCR观 测到36.2的Ct值(HeV N基因）而第二个孔没有表现出扩增(表6)。确切地说，在暴露后的任 何一天从深鼻拭子或从血液均没有回收到基因组。 表6:亨德拉病毒N基因 TagMan结果

从攻击日开始获取样品直到使动物安乐死当天为止并且通过针对亨德拉病毒N基因的 存在所测定的TagMan PCR对样品进行分析。-意指阴性(没有扩增），+/-意指不确定(CT = 40-45)，+意指阳性(CT〈40,值在括号中），*结果被认为是不确定的，这是因为之前、之后的 样品以及在同一天的其它样品全部均呈阴性，N/A=由于缺少样品而结果不可得
[0125]死后样品：在接受免疫接种的马V4、V5或V6的组织中不存在病毒复制的迹象。在一 只豚鼠（3号）中，在攻击后的第5天时在血液(Ct 34.2)、脑、肺、以及脾脏中检测到病毒基因 组，这证实了在这只动物中有关急性HeV感染的临床、组织学以及免疫组织学发现(表7)。 表7:亨德拉病毒N基因 TagMan结果

从每一只动物获取死后组织样品并且通过针对亨德拉病毒N基因的存在所测定的 TagMan PCR对样品进行分析。-意指阴性(没有扩增），+/-意指不确定(CT 40-45)，+意指阳 性(CT〈40,值在括号中），ND =未进行，以及N/A=由于缺少样品而结果不可得
[0126] 攻击后血清学:接受免疫接种的马V4、V5以及V6在HeV攻击后没有滴度升高(表8)。 这符合在这些动物中攻击病毒没有显著复制。 表8
[0127] 以初免-加强免疫方案接种了50yg sG+ISC佐剂的三匹马(V4、V5以及V6)在HeV暴 露之前向HeV进行血清转化。仅接受ISC的一匹马保持对攻击病毒呈血清阴性。
[0128] 在用原本致死剂量的HeV攻击后，接受免疫接种的马在整个观测期间在临床上保 持良好，这超过了所有在马中以实验方式诱导的HeV病例的发病时间。使用作致病力对照的 一只豚鼠在产生符合急性HeV的临床体征后安乐死。在接受免疫接种的马中在攻击后没有 检测到抗体滴度的提高，这符合在这些动物中攻击病毒没有复制。
[0129] 不存在接受免疫接种的马脱落病毒的迹象，如由对所有每日临床样品所获得的 PCR阴性测试结果所反映，除了在第3天时来自V6的直肠拭子的一个重复测定以外。正在重 复这一测试;如果观测到相似的结果，那么一种解释是这表示低水平的残余接种物。在一只 没有接受免疫接种的豚鼠中，在暴露于病毒后的第5天时在主要器官和血液中检测到病毒 基因组。
[0130] 在将被预期是急性感染期的期间实施安乐死后，在死后检查时所采集的接受免疫 接种的马的任何组织中没有HeV病毒复制的迹象。相比之下，HeV基因组和抗原以符合急性 HeV感染的模式分布于易感豚鼠的组织各处，并且还在这只动物中鉴定出HeV感染典型的血 管病变。 实施例9:评价使用亨德拉病毒疫苗对马进行的替代性疫苗接种方案
[0131] 将3个月大或年龄更大的健康的马招收到这一试验中。研究组如表9中所概述。 表9
*对于研究的其余部分，至少每隔一天进行一次总体健康观测。
[0132] 在第0天时在疫苗接种之前从所有马采集血液以确认先前没有暴露于马亨德拉病 毒。此外，在第80天和第91天时采集血液样品。通过使用经过验证的实验室程序进行血清中 和测定来评估对针对亨德拉病毒的抗体的检测。
[0133] 在指定的研究日用IVP对马进行疫苗接种。所述IVP由用250yg/剂的免疫刺激复合 物（ISC)佐剂化的116yg经过γ辐照的亨德拉病毒可溶性G蛋白（SG)组成。疫苗的剂量是每 一次每匹马lml。
[0134] 首先将疫苗接种部位用80%乙醇擦拭以确保它是清洁的。由有经验的兽医，使用 单个3ml无橡胶注射器和18G 1.5英寸的针头进行疫苗施用。在所有情况下，根据标准兽医 学程序，将疫苗施用到颈部左侧中央的肌肉中。
[0135] 有效测试的标准被限定为：1)所有马在第0天时疫苗接种之前在临床上是正常的； 2)所有马在第0天时无针对马亨德拉病毒的抗体;3)对照组T01中的马在整个研究过程中保 持无针对马亨德拉病毒的抗体。
[0136] 结果:没有动物被报告为在整个研究过程中遭受对疫苗的不良反应。对于处理组 T02，所有动物对疫苗作出反应，从而在第80天时实现256或更大的血清中和滴度(SNT)以及 在第91天时实现64或更大的SNT。对于处理组T03,所有动物也对疫苗作出反应，从而在第80 天时实现256或更大的SNT以及在第91天时实现32或更大的SNT。最终，对于处理组T04,所有 动物也对疫苗作出反应，从而在第80天时实现512或更大的SNT以及在第91天时实现128或 更大的SNT。
[0137] 总之，处理组T02、T03以及T04中的所有动物均对疫苗作出反应，从而在第80天时 实现256至>1024的SNT以及在第91天时实现32至2048的SNT。这些结果表明使马亨德拉病毒 疫苗的疫苗接种时间间隔从相隔3周施用2次剂量(Τ02)到相隔6周施用2次剂量(Τ03)或相 隔4周施用3次剂量(Τ04)变动使得到最后一次剂量被递送后的约3周（24天)时产生对抗马 亨德拉病毒的血清中和抗体反应。基于其中马在相隔3周的2次疫苗接种后受到攻击并且受 到保护的早先功效研究，在当前研究中在第80天和第91天时在所有三个疫苗接种组(Τ02、 Τ03以及Τ04)中所测量的SNT将预期同样具有对抗马亨德拉病毒的保护性。 实施例10:亨德拉病毒疫苗在马中免疫的持续时间
[0138] 仅将5岁-14岁大的在临床上健康的马招收到所述研究中。此外，使用以下标准来 选择用于这一攻击研究的马：身体适应性(总体健康、心肺功能、马蹄和四肢的完整性）；性 情；以及攻击前低抗体滴度。所述研究的设计示于表10中。 表10
*从第219天开始没有从一匹马采集血液样品。
[0139] 由于有关容纳设施的限制、与有人类使用活病毒和受感染(未被接种疫苗）的马进 行工作相关的风险、以及动物福利考虑的制约，这一研究仅利用了一组非常少的动物，而在 研究的攻击阶段期间没有目标动物(马)对照。先前涉及用亨德拉病毒攻击未被接种疫苗的 马的实验工作已经一致地证实了所述攻击模型的有效性，并且随后已经成功地利用雪貂作 为致病力对照。在这一研究中使用相同的实验设计，在攻击阶段期间使用2只雪貂作为对照 以确认攻击病毒的致病力。通过口鼻途径使每一只雪貂暴露于50,000TCID5QHeV。向雪貂对 照施用的攻击病毒与向马施用的攻击病毒相同。
[0140] 对于攻击，制备马亨德拉病毒在组织培养上清液中的有病毒的溶液。将病毒培养 物培养在Vero细胞中。在攻击当天早晨，根据以下程序制备攻击物质:将储备亨德拉病毒在 组织培养上清液中的等分部分从-80°C取出，解冻，并且适当稀释以提供攻击接种物。保留 接种物的等分部分以进行反滴定以确认所施用的接种物的滴度。将接种物保持在湿冰上直 到向实验用马和致病力对照（雪紹)施用为止。向马鼻内（以1X106TCID5Q为目标)和经口（以 1 X 106TCID5〇为目标)施用攻击病毒。
[0141 ]在暴露于马亨德拉病毒之前从马采集血液。此外，在第21天、第42天、第56天、第84 天、第120天、第136天以及第178天采集血液样品以确定在疫苗接种后针对HeV的抗体水平。 从攻击当天(第218天)开始，每天或每隔一天采集血液样品直到第226天为止。在第218天后 由于留置导管的问题而没有从一匹马采集血液样品。通过使用经过验证的实验室程序进行 血清中和测定来评估对针对亨德拉病毒的抗体的检测。
[0142] 在攻击前的2天(第216天和第217天）内，每天两次记录体温;还在攻击当天对它们 进行记录(在攻击前一次，以及在4小时-5小时后再一次）；然后每天两次记录体温直到每一 匹马安乐死当天为止。
[0143] 每天对马进行观测长达4小时-5小时，并且每天两次记录心率和临床体征(攻击前 一次，攻击后的4小时-5小时之时一次，然后之后每天两次）。
[0144] 在第218天(攻击前)对所有马获取鼻拭子、口腔拭子以及直肠拭子样品以用于病 毒鉴定和分离，然后每天获取这些样品一次直到每一匹马安乐死为止。在每一个采样日，还 从每一匹马的马圈采集尿液和粪便。
[0145] 在攻击后的第7天、第8天以及第9天(第225天、第226天以及第227天)使马择期安 乐死，并且在它们的马圈内进行验尸。如上文所述采集拭子样品，并且采集组织样品以用于 病毒学和组织病理学。对所有的主要器官系统进行采样，其中特别关注脑、呼吸道以及淋巴 系统。
[0146] 结果:对攻击接种物进行的反滴定确认马各自接受了3.06 X 106TCID5Q，并且雪貂 各自接受了 5.87 X 105TCID5Q的亨德拉病毒。
[0147] 有效测试的标准被限定为在雪貂致病力对照中的一只或多只中在研究的每一个 攻击阶段后产生符合急性HeV感染的临床体征、以及组织学/免疫组织学发现。这一标准得 到满足，这是因为在研究的这个阶段中这两只雪貂均死于急性HeV感染。主要结果标准是在 受到攻击的马中产生符合急性亨德拉病毒感染的临床疾病或相反。
[0148] 表11和表12列出了被招收到这一研究中的三匹马的HeV血清中和抗体滴度。所述 表中的天数是从疫苗的第一次给药之时(第〇天)起计数的。 表11
[0149] 所有动物在死后检查时在肉眼上是正常的，并且在任何马中在对以下各项检查时 没有检测到组织学损伤:脾脏、肝脏、心脏、肾脏(皮质、髓质、肾盂）、膀胱、淋巴结(包括头部 的淋巴结）、肺、肾上腺(皮质和髓质）、脊髓(2个水平）、大肠、小肠、卵巢、垂体、三叉神经节、 脑(所有主要区域，包括嗅球）、咽鼓管囊、咽以及鼻甲。
[0150] 没有动物被报告为在整个研究过程中遭受对疫苗的不良反应。
[0151] 总之，在加强(第二次)疫苗接种后的197天时对三匹马进行攻击，并且分别在攻击 后的第7天、第8天以及第9天时使它们择期安乐死。所有马在观测期间在临床上保持良好， 并且没有观测到心率和体温上升超出正常限度。
[0152] 在攻击后从3匹马中的2匹采集的血液样品的血清学显示滴度没有提高，这符合在 这些被接种疫苗的动物中没有显著的病毒复制(表12)。由于留置导管所遇到的问题而没有 从第三匹马(#V12)采集血液。
[0153]在暴露于HeV后的任何时间点没有从自靜12和靜14所采集的任何临床样品中回收 到亨德拉病毒基因组(N基因）；在攻击后的第2天、第3天、第4天以及第7天时，在来自靜13的 鼻拭子样品中发现低水平的基因组，但是在安乐死当天没有发现。没有从任何临床样品中 重新分离出病毒，包括显示出低拷贝数的HeV N基因的鼻拭子在内。显然，与首次接受实验 的对照动物相比，在被接种疫苗的马的上呼吸道中的病毒复制要低得多。
[0154] 在死后检查时所有动物在肉眼上都是正常的，并且在检查所采集的组织时在任何 马中没有检测到组织学损伤。在从任何马中采样的任何组织中均没有检测到HeV抗原。这些 免疫组织病理学发现还得到了Tagman qPCR结果的支持，这是因为在死后检查时从这三匹 马中的任一匹所采集的任何组织中没有回收到HeV基因组(数据未示）。
[0155] 综上所述，在疫苗接种后的约6个月时受到马亨德拉病毒的活的毒株攻击的马受 到保护而防止亨德拉病毒感染的临床体征。这确认了通过相隔21天的两次剂量的HeVsG疫 苗所赋予的免疫的持续时间是至少197天(约6个月）。 实施例11:在灵长类动物中针对尼帕病毒进行的临床试验
[0156] 统计:在生物安全等级4(BSL_4)上进行动物研究，特别是非人类灵长类动物研究 严重限制了动物受试者数、可以获得的生物样品的体积以及独立地重复测定的能力并且因 此限制了统计分析。因此，以由重复样品而非重复测定计算的平均值或中值形式呈现数据， 并且误差棒表示重复样品间的标准差。
[0157] 病毒:NiV-马来西亚(NiV_Malaysia)(基因库保藏号:AF212302)是从乔治亚州亚 特兰大的疾病控制和预防中心（Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta,Georgia)的特殊病原体部门（Special Pathogens Branch)获得的。如Rockx等 (2010) J. Virol. 84，9831中对于HeV所述使NiV在Vero细胞上繁殖和滴定。
[0158] 疫苗制剂：使用sGHeV的三种疫苗制剂（10yg、50yg或100yg)。如先前在Pallister (2011) Vaccine 29,5623中所述对sGHeV进行产生和纯化。每一种疫苗制剂还含有 Allhydrogel?(Accurate Chemical&Scientific公司）和含有完全硫代磷酸酯骨架的CpG寡 脱氧核苷酸(0DN)2006(InViV〇Gen公司）。如下配制疫苗剂量，所述疫苗剂量含有固定量的 0DN 2006、不同量的sGHeV以及铝离子（以1:25的重量比）：100yg剂量：100yg sGHeV、2.5mg 铝离子以及150yg的0DN 2006;50yg剂量：50yg sGHeV、1.25mg铝离子以及150yg的0DN 2006;以及10yg剂量：5yg sGHeV、250yg铝离子以及150yg的0DN 2006。对于所有剂量，在添 加 ODN 2006之前首先将Alhydrogel?和sGHeV混合。用PBS将每一个疫苗剂量调整到lml并且 在注射前将混合物在旋转轮上在室温下孵育至少两小时至三小时。每一个受试者针对初免 和加强免疫接受同样的lml剂量并且经由肌内注射给予所有的疫苗剂量。
[0159] 动物：将重4kg_6kg的十只年轻的成年非洲绿猴(AGM) (Chlorocebus aethiops) (三泉科技公司（Three Springs Scientific Inc·))单独笼养。在第-42天(初免)和第-21 天(加强免疫)时通过肌内注射氯胺酮（l〇mg/kg-15mg/kg)使受试者麻醉并且用sGHeV进行 疫苗接种。三个受试者接受两次l〇yg剂量(AGM 16、AGM 17、AGM 18)，三个受试者接受两次 50yg 剂量(AGM 13、AGM 14、AGM 15)，三只动物接受两次 100yg 剂量(AGM 10、AGM 11、AGM 12)并且一个受试者(AGM 9)接受单独的佐剂。在第0天时，使受试者麻醉并且用于4ml杜氏 最低必需培养基(Dulbecco's minimal essential medium，DMEM)(西格玛-奥德里奇公司 (Sigma-Aldrich))中的1X105TCID5Q(半数组织培养感染剂量）的NiV进行气管内接种。在感 染后(P.i.)的第〇天、第3天、第5天、第7天、第10天、第14天、第21天以及第28天使受试者麻 醉以进行临床检查，包括体温、呼吸速率、胸部X光照片、抽血以及鼻、口腔和直肠粘膜拭子。 在感染后的第10天时，根据获得批准的人道终点不得不使对照受试者(AGM 9)安乐死。所有 其它受试者继续生存直到研究结束为止，并且在感染后的第28天时安乐死。在验尸时，采集 各种组织以用于病毒学和组织病理学。所采样的组织包括:结膜、扁桃体、口咽/鼻咽、鼻粘 膜、气管、右支气管、左支气管、右肺上叶、右肺中叶、右肺下叶、左肺上叶、左肺中叶、左肺下 叶、支气管淋巴结(LN)、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、胰腺、空肠、横结肠、脑(额叶）、脑 (小脑）、脑干、颈脊髓、脑下垂体、下颂LN、唾液LN、腹股沟LN、腋窝LN、肠系膜LN、膀胱、睾丸 或卵巢、股骨骨髓。在BSL-2容纳设施下进行疫苗接种。疫苗接种方案、攻击以及生物样品采 集日的时间线示于图4中。
[0160]疫苗接种和NiV攻击:先前，我们已经证实了用105TCID5Q(半数组织培养感染剂量） 的NiV对AGM进行气管内接种会引起均一致命的结果(Rockx等(2010) J. Virol. 84,9831)。在 这些研究中注意到快速进行性临床疾病；临床体征包括重度抑郁、导致急性呼吸窘迫的呼 吸道疾病、重度神经病以及严重降低的灵活性;并且达到获得批准的安乐死人道终点标准 的时间在7天至12天的范围。在此，我们试图确定用sGHeV进行疫苗接种在AGM中是否可以预 防NiV感染和疾病。如方法中所述将10yg、50yg或100yg剂量的sGHeV与明矾和CpG部分混合。 在第〇天时（初免)并且再次在第21天时（加强免疫）向三个受试者皮下施用每一种疫苗制 剂，并且一个对照受试者(AGM 9)在同样的那些天接受单独的佐剂以进行初免和加强免疫。 在第42天时，用105TCID5QNiV对所有受试者进行气管内接种。对照受试者(AGM 9)在晚期疾 病时显示出食欲不振、严重的持续行为变化(抑郁、活动减少、驼背姿势）、血小板数减少以 及呼吸速率逐渐增加。随后，AGM 9在感染后的第10天时产生急性呼吸窘迫并且根据获得批 准的人道终点不得不使其安乐死。相比之下，被接种疫苗的受试者中无一者患有临床疾病 并且全部均存活直到研究结束为止。卡普兰-迈耶存活率图表示于图5中。
[0161]在对照受试者中NiV介导的疾病:对照受试者中的肉眼病理变化与先前在感染了 NiV的AGM中所发现的那些一致(Geisbert等（2010)PL〇S One 5，el0690)。存在脾肿大和脑 表面上的血管充血并且所有的肺叶均是湿而重的。没有从AGM 9血液样品中回收到NiV RNA 和感染性病毒并且不存在病毒血症的迹象。AGM 9具有显著水平的NiV特异性IgM以及可检 测的NiV特异性IgG和IgA。对组织样品进行的进一步分析揭示了广泛的NiV组织嗜性，这类 似于先前在AGM中所看到的广泛分布的NiV感染(Geisbert等（2010)PL〇S One 5，el0690)〇 AGM 9在如所示的大部分组织中具有NiV RNA并且从许多组织中回收到感染性病毒。显著损 伤包括间质性肺炎、亚急性脑炎以及脾白髓的坏死和出血。肺泡腔被水肿液、纤维蛋白、核 破裂和细胞碎片、以及肺泡巨噬细胞充满。多灶性脑炎的特征在于魏-罗二氏隙(Virchow- Robins space)被中等数目的淋巴细胞和较少的中性粒细胞扩充。更少数目的这些炎症细 胞扩展到相邻的实质中。许多神经元膨胀并且形成空泡（变性)或支离破碎而伴有核溶解 (坏死）。脾白髓中的脾小结的多灶性生发中心被出血和纤维蛋白以及少数的中性粒细胞和 细胞碎片以及核破裂碎片而隐没。这些发现符合脾中生发中心的坏死和丧失。大量的病毒 抗原存在于脑干中，突出了在中枢神经系统中NiV所导致的广泛损害。
[0162] 对接受sGHeV疫苗接种的受试者的保护:包括在攻击后所采集的所有血液样品以 及在验尸时所采集的所有组织在内的所有生物样品均呈NiV RNA阴性，并且没有从任何样 品中分离出感染性病毒。在仔细检查来自被接种疫苗的受试者的组织切片时，组织结构似 乎是正常的并且使用免疫组织化学技术在任何组织中均没有检测到NiV抗原。为了进一步 剖析疫苗所引出的保护机制，在被接种疫苗的动物中测量血清和粘膜sGNiV特异性和sGHeV 特异性IgM、IgG和IgA以及NiV和HeV血清中和滴度。如在图6中所示，在攻击前七天时，接受 最低sGHeV剂量的受试者具有可检测的抗原特异性血清IgM以及最高水平的sGHeV特异性血 清IgG。接受了50yg sGHeV的受试者在攻击前七天时也具有可检测水平的血清IgM以及它们 最高水平的血清IgG。在第-7天时，与其它两组相比，高剂量受试者没有可检测的血清IgM并 且血清IgG水平显著更低。直到NiV攻击当天，高剂量受试者的血清IgG水平升高并且所有被 接种疫苗的受试者具有相似的IgG水平。在NiV攻击后，在任何受试者中，血清IgM水平都没 有变化。中剂量受试者的血清IgG水平在NiV攻击当天降低，并且低剂量受试者的IgG水平在 NiV攻击后立即降低。有趣的是，这两组的IgG水平到感染后的第3天和第5天时升高，但是从 未超过在攻击前七天所存在的IgG水平并且在这两组中，到感染后第28天时滴度均显著减 少。
[0163] 相反，高剂量组的血清IgG水平保持较高并且在感染后第28天时处于它们的最高 水平。在接种疫苗后在所有受试者中，抗原特异性血清IgA均是可检测的；然而，水平非常 低，并且攻击前水平和攻击后水平似乎没有显著差异（图6)。在感染后的第14天时在来自低 剂量受试者的鼻拭子中检测到粘膜抗原特异性IgA的最小程度增加，然而，所述水平如此低 以至于这些粘膜抗体在防止NiV在攻击后的扩散中可能没有起作用。来自血清中和测试 (SNT)的结果示于表9中。对于所有的被接种疫苗的受试者，HeV特异性中和滴度到感染后第 28天时仍相同或减少，并且NiV特异性中和滴度到感染后的第7天时没有显著变化，甚至是 在攻击前具有最低滴度的受试者中也是如此。一个低剂量受试者和一个高剂量受试者到感 染后的第14天时NiV SNT滴度有对数增加，并且一个中剂量受试者到感染后的第21天时NiV SNT滴度有对数增加。对于所有其它被接种疫苗的动物，SNT滴度的变化是不一致的（滴度将 增加，然后减少)或不显著的(滴度增加到3倍-4倍，但不超过对数）。最终，在NiV攻击后在被 接种疫苗的受试者中测量向NiV融合(F)包膜糖蛋白的血清转化。分别在感染后的第10天和 第21天时，在低剂量受试者和中剂量受试者中检测到最低水平的血清抗NiV F IgM，并且这 些低的M. F. I.值表明在NiV攻击后弱的初次抗体反应。在高剂量受试者中没有检测到血清 抗NiV-F IgM，这表明这些动物在攻击后有很少到没有循环病毒。
实施例12:在灵长类动物中针对亨德拉病毒进行的临床试验
[0164] 在AGM中进行第二次临床试验以评估用亨德拉病毒进行的疫苗接种和攻击。使用 与实施例9中所述的制剂相同的制剂作为疫苗，但是还与接受sGHeV和单独作为佐剂的 Alhydr〇gelTM(不存在0DN 2006)的另一组相比较。将动物在第-21天时接种疫苗，在第0天时 加强免疫，并且在第21天时接受攻击。除非另外指明，否则所有条件与实施例7中的那些相 同。实验概述如下：
[0165] 结果:在用105TCID5q的亨德拉病毒进行气管内接种后，这两组(A和B)中的所有动 物(n = 4)在经历亨德拉病毒攻击后存活。对照受试者在第8天时死亡。在被接种疫苗的受试 者中的任一个中均没有观测到临床疾病，并且它们保持健康并且良好直到研究终点为止。
[0166] 通过考虑本说明书和实施本文所公开的发明，本发明的其它实施方案和用途对于 本领域技术人员来说将是显而易见的。本文所引用的所有参考文献，包括所有的出版物、美 国和外国专利和专利申请均具体并完全以引用方式并入本文。本说明书和实施例仅意图被 认为具示例性，而本发明的真实范围和精神由以下权利要求书所表明。
【主权项】
1. 一种施用免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物包含亨德拉病毒G糖蛋白和/ 或尼帕病毒G糖蛋白、免疫刺激复合物（ISC)以及一种或多种赋形剂，其中分多次剂量施用 所述免疫原性组合物，进一步其中首次剂量之后是在所述首次剂量后的至少约二十一天至 约四十二天时给予的第二次剂量。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述首次剂量之后是在所述首次剂量后的二十八天 时给予的第二次剂量，进一步后面是在所述第二次剂量后的二十八天时给予的第三次剂 量。3. 如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中在所述最后一次剂量后的六个月时施用 加强剂量。4. 如权利要求3所述的方法，其中在所述加强剂量后的一年时施用另外的剂量。5. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中每一次剂量含有约50yg或约lOOyg的可 溶性亨德拉病毒G糖蛋白。6. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类、马、母牛、绵羊、猪、 山羊、鸡、狗或猫。7. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述G糖蛋白来自亨德拉病毒。8. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述G糖蛋白来自尼帕病毒。
【文档编号】A61K39/155GK105828836SQ201480068468
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年12月15日
【发明人】N·爱德华兹, J·黄, M·韦尔林
【申请人】硕腾服务有限责任公司