氧化亚铜纳米粒在制备治疗前列腺癌药物中的应用

氧化亚铜纳米粒在制备治疗前列腺癌药物中的应用
【专利摘要】本发明公开氧化亚铜纳米粒在制备治疗前列腺癌药物中的应用，氧化亚铜纳米粒对前列腺癌细胞系具有选择性的杀伤作用，在有效杀伤前列腺癌细胞的同时，对正常前列腺上皮细胞的毒性很小，具有良好的应用前景。
【专利说明】
氧化亚铜纳米粒在制备治疗前列腺癌药物中的应用
技术领域
[0001]本发明属于医药领域，更具体地讲，涉及氧化亚铜纳米粒在制备治疗前列腺癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤，发病随年龄增长而增加，全球范围内居男性癌症发病率的第3位，病死率的第6位，在美国则分别居男性癌症发病率第I位，病死率的第2位。近年来，中国男性前列腺癌发病率持续升高，对男性健康构成了严重威胁，也给社会带来了巨大压力。
[0003]纳米科学的发展给科学进步注入了新鲜动力，给包括医学在内的各个学科带来了深刻的变革。纳米医学及其分支纳米肿瘤学是纳米科学的子学科，它们的发展给肿瘤治疗及抗肿瘤药物研发提供了可行的方法和思路。脂质体靶向给药系统、磁性纳米粒给药体系、量子点、纳米分子成像技术以及无机纳米药物是抗肿瘤纳米药物的前沿研究对象。其中，抗肿瘤无机纳米药物既可以经改造成为载药体系，也可以作为抗肿瘤药物靶向肿瘤组织，表现出许多独特的作用，有许多有趣的科学问题亟待研究。棒状纳米金、星型纳米金、纳米氧化锌、纳米金铁复合材料等多种无机纳米药物表现出显著的抗肿瘤作用，且具有独特的亚细胞结构的靶向作用，可以选择性的靶向肿瘤细胞的细胞核、线粒体等结构，在细胞水平和实验动物水平均表现出良好的肿瘤治疗应用前景。对于无机纳米药物的作用机制研究发现，金纳米粒(Au NP s)可通过抑制MAPK信号通路抑制肿瘤的转移与增殖；纳米T i 02可上调Bak/Bax的比值;Mn纳米粒可上调转铁蛋白的表达;超磁性铁纳米粒通过激活β-catenin、cancer/testis抗原、间质金属蛋白酶丽P_2等蛋白的表达参与人间充质干细胞的分化调控，还可与c-erbB-2受体结合革E向乳腺癌细胞;ZnO纳米粒可抑制Akt、Erkl/2的磷酸化，激活JNK、P38;其中0-catenin、Akt、Erk、MMP等蛋白与肿瘤的转移密切相关。
[0004]氧化亚铜纳米粒(Cuprous Oxide Nanoparticles，⑶NPs)作为一种含铜纳米药物，与急性早幼粒白血病特效药物-亚砷酸(砒霜As2O3的水化物，为矿物中药)具有相似的化学性质。在重要中药学典籍《神农本草经》中记载曾青、扁青等含铜矿物中药具有“破症坚积聚”的作用，而“破症坚积聚”就包括肿瘤这类疾病；同时，含铜矿物中药具有“扶正祛邪”、“通血脉”、“疗恶疮”等作用，在治疗疾病的同时还可以调动机体自身的抗病能力。另外，铜元素作为人体必需的微量元素，与肿瘤的发生、发展、转移有着复杂的关系。目前已经开发出铜离子/亚铜离子配合物等肿瘤化疗药物，这些药物与在临床广泛应用的铂类抗肿瘤药物有着类似的作用，同时具有相对较小的毒副作用，这也提示我们开发新型含铜抗肿瘤药物具有良好的理论支持和应用前景。
[0005]受已有相关研究的启发，本课题组从2010年开始，在国内外首次对CONPs的抗肿瘤作用和机制进行了系统的研究，取得了一定的原创性成果。体外细胞水平的研究发现，CONPs(粒径分布在50-100nm之间)可以选择性的诱导肿瘤细胞凋亡，表现出选择性的肿瘤细胞毒性作用，对小鼠高侵袭性黑色素瘤B16-F10细胞和人黑色素瘤YUMAC细胞具有极强的杀伤作用，研究成果发表在纳米医学专业杂志Internat1nal Journal of Nanomedicine(2012,7,2641-2652 ；年度影响因子为4.976)；基于体外初步的研究结果，课题组进一步开展了 CONPs对黑色素瘤动物模型的治疗及凋亡诱导机制的相关实验，通过小鼠皮下荷瘤和肺转移瘤模型，发现CONPs可以显著抑制黑色素瘤增殖，延长小鼠的生存率，最重要的是研究还发现CONPs可以抑制黑色素瘤的肺转移，减少肺转移小鼠模型肺表面的黑色素瘤结节数目；并且初步阐明了线粒体介导的细胞凋亡通路在CONPs诱导肿瘤凋亡中起到的重要作用。与纳米金、纳米银、纳米二氧化钛等无机纳米药物及量子点很难被机体降解、排泄不同，而本课题组还发现CONPs可被小鼠快速排泄，具有极小的肝肾毒性，表现出良好的应用潜力。该部分的研究成果已发表在Nature出版集团旗下转化医学期刊Cell Death&Disease杂志(2013，4，e783 ；年度影响因子为6.044)。
[0006]本课题扩大了CONPs的肿瘤治疗谱，通过研究发现了 CONPs对前列腺癌细胞系具有选择性的杀伤作用，在有效杀伤前列腺癌细胞的同时，对正常前列腺上皮细胞的毒性很小，为进一步临床应用打下来坚实基础。

【发明内容】

[0007]本发明的第一个目的在于提供氧化亚铜纳米粒在制备治疗前列腺癌药物中的应用。
[0008]本发明的第二个目的在于提供一种治疗前列腺癌的药物。
[0009]为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案:氧化亚铜纳米粒在制备治疗前列腺癌药物中的应用。
[00?0]作为一个优选方案，所述氧化亚铜纳米粒的粒径为50-100nm之间。
[0011]为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案:一种治疗前列腺癌的药物，所述药物由氧化亚铜纳米粒和药学上可接受的载体或赋形剂组成。
[0012]作为一个优选方案，所述氧化亚铜纳米粒的粒径为50-100nm之间。
[0013]本发明的优点在于:CONPs对前列腺癌细胞系具有选择性的杀伤作用，在有效杀伤前列腺癌细胞的同时，对正常前列腺上皮细胞的毒性很小，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0014]图1为CONPs对前列腺癌细胞具有显著地选择性杀伤作用。
[0015]图2为CONPs可显著诱导前列腺癌DU145(A)和PC-3(B)细胞系凋亡。
[0016]图3为CONPs可显著抑制前列腺癌DU145(A)和PC-3(B)细胞系迀移。
[0017]图4为CONPs可活化自噬相关蛋白LC3A和LC3B。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0019]实施例
[0020]I，实验材料:
[0021]PC-3^LNCaP FGC、RWPE-1细胞:ATCC公司引进。
[0022]DU145、RM-1:中科院细胞库引进。
[0023]F12、DMEM、K-SFM、RPMI 1640培养基、胎牛血清 FBS:Gibco 公司。
[0024]2，实验方法:
[0025]2.1，细胞增殖实验
[0026]选择人PC-3、LNCaP FGC、DU145和小鼠RM-1等前列腺癌细胞系为研究对象，选择人正常前列腺上皮RWPE-1细胞为对照，其中PC-3细胞应用F12培养基培养，LNCaP FGC和DU145细胞应用RMPI 1640培养基培养，RM-1选择DMEM培养基，上述细胞培养基均添加10%FBS和
I%青霉素-链霉素，RWPE-1应用K-SFM培养基(添加rhEGF和牛垂体提取物)。取96孔板，每孔加入200μ1的细胞悬液，每孔3000个细胞，孵育过夜，弃培养基，按浓度梯度加入CONPs，除对照组以外，实验组浓度梯度设定为0.625yg/ml、1.25yg/mU2.5yg/mU5yg/ml、10yg/ml每个浓度梯度设置5个复孔，分别在48h、72h弃去加入药物的培养基，按10:1的比例每孔加入10μI的CCK8溶液和ΙΟΟμΙ培养基配好的混合液，37°C孵箱避光孵育4h，用酶标仪在450nm处测定细胞吸光度，按照抑制率(%) = ( 1-实验组平均A值/对照组平均A值)X 100 %的公式计算出抑制率，通过SPSS16.0计算出IC50，利用GraphPad Prism 5进行量效柱状图绘制，并以RWPE-1细胞为对照进行Student’s t test。
[0027]2.2，细胞凋亡实验
[0028]主要检测⑶NPs对DU145、PC_3细胞系凋亡的影响。六孔板中，每孔加入10万个细胞，每孔2ml培养基，孵育过夜，72小时实验组第二天按照浓度梯度加入CONPs，浓度梯度为2.5、5、10yg/ml。48小时实验组在第三天按照浓度梯度加药。在同一天上流式分析仪，分别收集细胞上清液入离心管，PBS清洗贴壁细胞，胰酶消化贴壁细胞，按照浓度梯度加入对应上清液中，离心弃培养基，PBS重悬离心弃上清，Annexin V binding buffer重悬离心弃上清，细胞量少，200μ1 Annexin V binding buffer重悬(细胞量多可加至300_400μ1)，加入Annexin V FITC 5μ1，避光孵育15分钟后，加入5μ1 PI，并上机检测。实验原始数据用f1wjo 7.6分析。
[0029]2.3细胞迀移实验
[0030]将PC-3和DU145细胞饥饿处理24小时，第二天弃培养基，胰酶消化，离心，用无血清培养基重悬，调整细胞密度为每200μ1含有I万个细胞，12孔板中放入小室，小室上层加入200μ1的I万个细胞悬液，小室下层加入600μ1含10%胎牛血清的培养基。注意小室上下不要形成气泡，48小时后，用PBS淋洗小室上下层，棉签轻轻擦去小室上层的细胞，用无水乙醇固定3h，后用结晶紫染色lh，风干后显微镜下放大100倍，随机选选取10个视野拍照。
[0031]2.4自噬相关蛋白的检测
[0032]将PC-3细胞培养于6cm培养皿中，至密度为50%左右时加入⑶NPs至终浓度为1.25、2.5、5yg/ml，处理48h，应用RIPA裂解液裂解细胞，蛋白应用BCA试剂盒进行定量，采用12.5% SDS-PAGE凝胶电泳80V浓缩胶电泳15min、120V分离胶电泳50min，PVDF膜300mA转膜90min ο5 %脱脂奶粉室温封闭3h，TBST洗涤5次，每次3min ； LC3A、LC3B—抗4°C孵育过夜，TBST洗涤5次，每次3min; 二抗孵育Ih，TBST洗涤5次，每次3min，应用ECL发光试剂盒进行发光，于扫膜仪进行扫膜。
[0033]3，结果:
[0034]3.1 CONPs可选择性抑制前列腺癌细胞增殖，对正常细胞系RWPE-1毒性很低
[0035]不同浓度的CONPs处理培养于96孔板的肾癌细胞48和72小时之后，采用CCK8法检测⑶NPs对细胞增殖的影响。检测结果显示，48h时间节点，CONPs对前列腺癌细胞系PC-3、LNCaP ?6(:、01]145、1?1-1细胞的半效抑制浓度1050依次为6.604yg/ml、0.913yg/ml、3.813μg/ml、8.82yg/ml，正常人前列腺上皮细胞RWPE-1的IC50为45.997yg/ml，t检验结果显示PC-3^LNCaP 卩6(:、01]145、咖-1细胞的？值依次为0.0412、0.0062、0.0342、0.0393，均小于0.05。72h时间节点，⑶NPs对前列腺癌细胞系PC-3、LNCaP FGC、DU145、RM_1细胞的半效抑制浓度IC50依次为3.793yg/ml、0.44yg/ml、4.781yg/ml、I.045yg/ml，正常人前列腺上皮细胞RffPE-1 的48h的 IC50远大于45.997yg/ml，t检验结果显示PC_3、LNCaP FGC、DU145、RM_1 细胞的P值依次为0.0279、0.0135、0.0290、0.0170，均小于0.05。(图1)结果显示，CONPs可以显著抑制前列腺癌细胞系的增殖，而正常人前列腺上皮细胞RWPE-1对CONPs的杀伤作用耐受，因此CONPs表现出选择性的前列腺癌杀伤作用，具有潜在的前列腺癌临床治疗价值。
[0036]3.2 CONPs可显著诱导前列腺癌细胞发生凋亡
[0037]本研究采用Annexin V/PI双染法检测了CONPs对PC-3和DU145细胞凋亡的影响。分别用2.5yg/mK5yg/ml、10yg/ml的⑶NPs对两株细胞处理48小时和72小时。CONPs作用于DU145细胞48小时，早期凋亡比率分别为2.42%、4.05%、7.43%，晚期凋亡比率分别为
5.28%、5.26%、25.2%，药物作用72小时之后，早期凋亡比率分别为1.86%、3.19%、10.6%，晚期凋亡比率分别为3.01%、9.24%、47.7%。
[0038]同样浓度梯度的⑶NPs作用于PC-3细胞48小时，早期凋亡比率分别为34.5%、27.5%、32.4%，晚期凋亡比率分别为5.72%、45.9%、37.4%。药物作用?(:-3细胞72小时，早期凋亡比率分别为62.3%、40.6%、22.6%，晚期凋亡比率分别为0.06%、18.2%、64.4%。(图2)。
[0039]3.3 CONPs可显著抑制前列腺癌细胞迀移
[0040]细胞迀移试验中，⑶NPs作用48小时，PC-3细胞中，对照组每高倍视野(207 ± 16)，、2.5yg/ml 组(173±7)、5yg/ml 组(113±ll)、10yg/ml 组(76±3)(Ρ〈0.005)(图3Α)<^υ?45 细胞中，对照组每高倍视野(96±10),2.5yg/ml组(75±7)、5yg/ml组(39±3)、10yg/ml组(27±5)，且每组与对照组之间(P〈0.005)(图3B)。
[0041 ] 3.4 CONPs可诱导自噬
[0042]应用WesternBlot检测，LC3A、LC3B均发生活化，LC3A 1、LC3B I向LC3A Π、LC3BΠ形式转化，结果表明CONPs可诱导前列腺癌细胞凋亡发生，参与肿瘤细胞凋亡诱导(图4)。
[0043]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.氧化亚铜纳米粒在制备治疗前列腺癌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的氧化亚铜纳米粒在制备治疗前列腺癌药物中的应用，其特征在于，所述氧化亚铜纳米粒的粒径为50-1 OOnm之间。3.—种治疗前列腺癌的药物，其特征在于，所述药物由氧化亚铜纳米粒和药学上可接受的载体或赋形剂组成。4.根据权利要求3所述的一种治疗前列腺癌的药物，其特征在于，所述氧化亚铜纳米粒的粒径为50-100nm之间。
【文档编号】A61K9/14GK105832674SQ201610308780
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】孙颖浩, 王野, 訾晓渊, 杨启维, 吕建敏
【申请人】上海长海医院