一种载抗IL-1β抗体的药物微球制备方法及其治疗过敏性鼻炎的应用
【专利摘要】本发明公开了一种载抗IL?1β抗体的药物微球制备方法及其治疗过敏性鼻炎的应用。该方法包括以下步骤：(1)取单体甲基丙烯酸MAA溶于乙腈中，再加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯以及引发剂AIBN充分溶解并混合均匀；(2)通保护气密封，再置加热油浴中，梯度升温至100℃，旋转下继续聚合反应；(3)高速离心收集沉淀，去除未反应物，离心收集沉淀冷冻干燥得白色粉末状产物。该药物微球发明具有操作简单、条件温和，不涉及化学交联反应以及有机溶剂的使用，所载蛋白量较高、良好的生物相容性和明显的喷鼻治疗过敏性鼻炎效果等优势，有望在临床领域得到广泛的应用。
【专利说明】一种载抗IL-1 β抗体的药物微球制备方法及其治疗过敏性鼻 炎的应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种载抗IL-Ιβ抗体的局部治疗过 敏性鼻炎的药物微球及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0003] 变应性鼻炎的典型症状主要是阵发性喷嚏、清水样鼻涕、鼻塞和鼻痒等，严重影响 了患者的生活质量。目前临床上经鼻用激素喷剂是治疗过敏性鼻炎的首选药物，但长期使 用，会有一些局部副作用，如:鼻干，鼻出血，且对青少儿，甚至可能引起激素的全身副作用， 限制了其在临床上的长期使用。构建一种可以长期使用且治疗效应好的鼻用喷剂在临床上 具有重要的作用。
[0004] 研究表明，过敏性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)是由IgE[1]介导的、Thl/Th2细胞 免疫反应失衡、Th2细胞因子11^-4、11^-5 [2]、11^-9、11^-13等所致的鼻黏膜1型嗜酸性粒细胞浸 润为主的变态反应性炎症疾病，且许多患者伴随支气管哮喘发生 [3,4]。虽然Th2细胞因子在 上下呼吸道过敏性炎症病理反应中起作用，但原炎症因子(proinflammatory cytokines) 白介素1 beta (IL_li3)[5,6,7]不仅是AR的炎症因子，同时也刺激免疫活性细胞、气道上皮、 平滑肌等产生Th2细胞因子及IL-6、IL-8、GM-CSF炎症因子，IgE抗体和粘蛋白（MUC5AC)，以 及促进嗜酸性粒细胞浸润，在AR的发生发展的病理过程中起着重要的作用。动物实验显示 阻断IL-Ιβ可以明显抑制0VA诱导的过敏性鼻炎及支气管哮喘的病理改变及过敏症状。
[0005] 参考文献 1. Thakare VN, Osama MM， Naik SR. Therapeutic potential of curcumin in experimentally induced allergic rhinitis in guinea p i gs[J]. Int Immunopharmacol., 2013;17(1):18-25. 2. Kitamura Y， Mizuguchi H， Ogishi H et al. Preseasonal prophylactic treatment with antihistamines suppresses IL-5 but not IL-33 mRNA expression in the nasal mucosa of patients with seasonal allergic rhinitis caused by Japanese cedar pollen[J]. Acta Otolaryngol., 2012;132(4):434-438. 3. McCusker CT. Use of mouse models of allergic rhinitis to study the upper and lower airway link[J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol., 2004;4(1): 11-16. 4. Brown JL，Behndig AF，Sekerel BE et al. Lower airways inflammation in allergic rhinitics: a comparison with asthmatics and normal controls[J]. Clin Exp Allergy, 2007;37(5):688-695. 5.Sim TC, Grant JA， Hilsmeier KA et al. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge[J]. Am J Respir Crit Care Med., 1994;149(2 Pt 1):339-344. 6. Kobayashi T， Iijima K， Checkel JL， et al. IL-1 family cytokines drive Th2 and Thl7 cells to innocuous airborne antigens[J]. Am J Respir Cell Mol Biol., 2013;49(6):989-998. 7. Fujisawa T， Velichko S， Thai P et al. Regulation of airway MUC5AC expression by IL-lbeta and IL-17A; the NF-kappaB paradigm[J]. J Immunol., 2009;183(10):6236 - 6243. 聚甲基丙烯酸(PMAA)具有良好的生物相容性和无毒性，是理想的蛋白质药物缓释载 体，可以用于载抗IL-Ιβ抗体来治疗过敏性鼻炎。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有鼻用激素喷剂缺点，通过制备一种PMAA载抗IL-Ιβ I gY抗体的药物微球，将其滴鼻用于局部治疗过敏性鼻炎。本发明以PMAA微球为载体，将抗 IL-Ιβ抗体蛋白载于微球载体上进而制成;该药物微球制备条件温和、对温度和浓度要求较 低;操作方便，可作为一类新型的局部治疗过敏性鼻炎的药物。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种聚甲基丙稀酸载抗IL-Ιβ IgY抗体的药物微球的制备方法，其制备步骤如下： (1) 取单体甲基丙烯酸MAA溶于乙腈中，再加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯以及引 发剂AIBN充分溶解并混合均匀； (2) 通保护气密封，再置加热油浴中，梯度升温至100°C，旋转下继续聚合反应； (3) 高速离心收集沉淀，去除未反应物，离心收集沉淀冷冻干燥得白色粉末状产物。
[0008] 上述的制备方法，优选地，第（1)步:单体甲基丙烯酸MAA和交联剂二甲基丙烯酸乙 二醇酯用量比按重量计为10:〇. 5-2;引发剂是AIBN。
[0009] 上述的制备方法，优选地，第（1)步中取250 mg，2.904 mmol的单体聚甲基丙稀酸 MAA，溶于20 mL乙腈中，再加入27.78 mg，0.107 mmol的交联剂二甲基丙稀酸乙二醇酯以及 8.33 mg，0.051 mmol的引发剂AIBN充分溶解并混合均匀。
[0010] 所述的制备方法，第(2)步中是通氮气。
[0011] 所述的制备方法，优选地，第⑵步中是置60Γ油浴中，半小时内梯度升温至100 °C;第(2)步中旋转是650-900 rpm转速，并继续聚合反应1 h。
[0012] 所述的制备方法，第(3)步中高速离心收集沉淀，用乙醇洗去未反应物，洗涤三次， 离心收集沉淀冷冻干燥得白色粉末状产物即得。
[0013] 本发明一个较为具体的技术方案如下： 一种聚甲基丙烯酸载抗IL-Ιβ IgY抗体的药物微球的制备方法:先采用沉淀聚合法制 备PMAA纳米微球载体:取单体MAA(250 mg，2.904 mmol)溶于20 mL乙腈中，再加入交联剂二 甲基丙烯酸乙二醇酯（27.78 mg，0.107 mmol)以及引发剂AIBN(8.33 mg，0.051 mmol)充分 溶解并混合均匀后，通氮气10 min密封，再置60°C油浴中，半小时内梯度升温至100°C，在 750 rpm转速下继续聚合反应1 h，高速(5000~10000 rpm)离心收集沉淀，用乙醇洗去未反 应物，洗涤三次，离心收集沉淀冷冻干燥得白色粉末状产物。
[0014]本发明微球形貌及粒径表征:取适量PMAA产物微球通过超声均匀分散在乙醇溶液 中，滴加适量溶液于盖玻片上，室温下干燥成膜，再用台式溅射镀膜仪对薄膜进行喷金镀膜 处理(30 mA，90 s)，用SEM观察微球形貌。并将微球干燥，与溴化钾共研磨并压片，利用傅 立叶红外仪对其结构进行表征。
[0015] 本发明载药实验:称取PMAA微球约40.0 mg，浸泡在10.0 mL含有约1 mg/mL抗IL-1β抗体的溶液中，置于室温摇床中震荡24 h。离心分离，取上清液，用UV-VIS检测上清液中 抗IL-Ιβ抗体浓度，由此计算微球的载药量。
[0016] 本发明体外释药实验:称取10 mg载有抗IL-Ιβ抗体的药物微球，分散在10 mL pH= 7.4的PBS溶液中。分别在预先设定时间点（0.5 h，l h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h)取出 0.1 mL释放液，用UV-VIS检测取出的上清液中抗IL-Ιβ抗体的浓度，计算抗IL-Ιβ抗体的累 积释放百分数。
[0017] 本发明动物实验:应用卵清白蛋白（0VA)建立豚鼠过敏性鼻炎模型，将制备的载 0.1%抗IL-Ιβ抗体药物微球经鼻腔滴入，观察豚鼠的过敏症状改善情况及治疗结束后2、4、 8h收集鼻灌洗液(NLF)观察炎症细胞变化，以及鼻粘膜组织HE染色和免疫组化IL-Ιβ表达来 分析该药物微球局部滴药治疗过敏性鼻炎的疗效。
[0018] 本发明的原理是:先采用沉淀聚合法制备PMAA微球载体，再采用静电吸附作用制 备载抗IL-Ιβ抗体的药物微球。
[0019] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果： (1) 微球载体制备方便快捷，可在室温下成型，条件温和，对浓度及温度要求较低； (2) 载抗IL-Ιβ抗体的药物微球的形成过程简单，不存在化学反应，有效地避免了化学 反应及反应副产物对物质活性的影响； (3) 本发明药物微球成分简单，生物兼容性好，所载蛋白量较高，应用方便快捷，有望作 为外用局部鼻喷剂广泛应用于临床领域。
[0020]
【附图说明】
[0021]图1 PMAA核磁氢谱。
[0022]图2本发明药物微球粒径大小及电镜图。
[0023] 图3体外释药实验。
[0024] 图4各组豚鼠过敏性鼻炎症状评分柱状图。
[0025] 图5各组豚鼠 NLF中嗜酸性粒细胞分类柱状图。
[0026] 图6各组豚鼠鼻粘膜组织嗜酸性细胞百分比柱状图。
[0027] 图7鼻粘膜组织HE染色，200X，A.正常对照组(N组）；B.模型组(M组）；C. 0.1% 抗IL-Ιβ治疗组(^组）；D.载0.1%抗IL-Ιβ微球药物治疗组(^组）。
[0028] 图8鼻粘膜组织IL-Ιβ免疫组化，200X，A.正常对照组(N组）；B.模型组(M组）； C. 0.1%抗IL-Ιβ治疗组⑶组）；D.载0.1%抗IL-Ιβ微球药物治疗组(T2组）。
[0029]
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0031] (1)微球载体的制备:先采用沉淀聚合法制备PMAA纳米微球载体:取单体MAA(250 11^，2.904 1]11]1〇1)溶于20 1]11^乙腈中，再加入交联剂二甲基丙稀酸乙二醇酯(27.78 11^，0.107 mmol)以及引发剂AIBN(8.33 mg，0.051 mmol)充分溶解并混合均勾后，通氮气10 min密封， 再置60°C油浴中，半小时内梯度升温至100°C，在750 rpm转速下继续聚合反应1 h。高速 (8000 rpm)离心收集沉淀，用乙醇洗去未反应物，洗涤三次，离心收集沉淀冷冻干燥得白色 粉末状产物。
[0032] (2)表征：微球形貌及粒径表征：取适量产物微球通过超声均匀分散在乙醇溶液 中，滴加适量溶液于盖玻片上，室温下干燥成膜，再用台式溅射镀膜仪对薄膜进行喷金镀膜 处理(30 mA，90 s)，用SEM观察微球形貌，透射电镜下药物微球外貌，显示单一分散对称的 球状结构，粒径大约100 nm(请参见图2)。将微球干燥，与溴化钾共研磨并压片，利用傅立叶 红外仪对其结构进行表征。请参见图1，1700 cnf1附近出现的峰是羧基的震动吸收峰，3500 cnf1附近出现的峰是羧基(羟基)的振动吸收峰。通过与文献比较，证实PMAA微球合成成功。 [0033] (3)载药实验:称取微球约40.0 mg，浸泡在10.0 mL含有约1 mg/mL抗IL-Ιβ抗体 的溶液中，置于室温摇床中震荡24 h。离心分离，取上清液，用UV-VIS检测上清液中抗IL-Ιβ 抗体浓度，由此计算得出微球的载药量为12% (w/w)。
[0034] (4)体外释药实验:称取10 mg载有抗IL-Ιβ抗体的药物微球，分散在10 mL ρΗ=7·4 的PBS溶液中。分别在预先设定时间点（0.5 h，l h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h)取出0.1 mL释放液，用UV-VIS检测取出的上清液中抗IL-Ιβ抗体的浓度，计算抗IL-Ιβ抗体的累积释 放百分数。起初载体迅速释放抗IL-Ιβ抗体，但在12h后释放缓慢，在48h后，大约只有50%的 抗IL-Ιβ抗体释放。显示载体良好的缓释药物特点（参见图3)。
[0035] (5)动物实验:应用卵清白蛋白（0VA)建立豚鼠过敏性鼻炎模型；随机分阴性对照 组(N组），模型组(M组），0.1%抗IL-Ιβ抗体治疗组(^组)及载0.1%抗IL-Ιβ抗体药物微球治 疗组(T2组）；观察豚鼠的过敏症状改善情况及治疗结束后2、4、8h收集鼻灌洗液(NLF)观察 炎症细胞变化，以及鼻粘膜组织HE染色和免疫组化IL-Ιβ表达来分析药物微球局部滴药治 疗过敏性鼻炎的疗效。结果请见表1、表2、表3，图4至图7。
[0036]表1各组豚鼠过敏性鼻炎症状评分(X土SD)
注：1)与N组比较，Ρ〈0·05;2)与Μ组比较，Ρ〈0·05· 结果显示正常对照组仅在滴鼻后轻度抓鼻和打喷嚏，从第4次激发开始h组和Τ2组豚 鼠症状开始减轻，抓鼻和喷嚏次数，以及流涕量明显逐渐减少，显示其较强的抗过敏效应 (参见图4)。
[0037]表2各组豚鼠鼻灌洗液中嗜酸性粒细胞分类比较(X土SD，％)
注：1)与N组比较，Ρ〈0·05;2)与Μ组比较，Ρ〈0·05· 结果显示在h组和^组，嗜酸性细胞所占百分率在2 h、4 h、8 h显著低于Μ组（Ρ〈 0.05)。!^组嗜酸性细胞所占百分率在2 h、4 h是下降的，但在8 h有升高趋势。而Τ2组在2 h、 4 h、8h逐步下降（参见图5)。
[0038]表3各组豚鼠鼻粘膜组织嗜酸性细胞百分比(X土SD，％)
注：1)与N组比较，Ρ〈0·05;2)与Μ组比较，Ρ〈0·05· 结果显示在h组和^组，嗜酸性细胞数量及所占百分率在2 h、4 h、8 h显著低于Μ组 (Ρ〈0.05)。!^组嗜酸性细胞数量及所占百分率在2 h、4 h是下降的，但在8 h有升高趋势。而 T2组在2 h、4 h、8h逐步下降(参见图6)。
[0039] 对鼻粘膜组织HE染色，结果显示在2 h和4 h，!^组和T2组有少量嗜酸性细胞浸润于 上皮固有层和粘膜下层、甚至上皮层，粘膜组织水肿较轻，上皮细胞层较完整;在8 h，嗜酸 性细胞和淋巴细胞减少，粘膜组织水肿消退，上皮细胞较完整(见图1-3C和D)。模型组病理 改变显著重于h组和^组（图7)。
[0040] 对鼻粘膜组织IL-Ιβ免疫组化，结果显示在2 h、4 h、8 h，M组IL-Ιβ的表达量明显 高于Ti组和T2组，Ti组和T2组之间表达量无明显差异(参见图8)。
[0041] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种聚甲基丙稀酸载抗IL-Ιβ IgY抗体的药物微球的制备方法，其特征在于，制备步 骤如下： (1) 取单体甲基丙烯酸MAA溶于乙腈中，再加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯以及引 发剂AIBN充分溶解并混合均匀； (2) 通保护气密封，再置加热油浴中，梯度升温至100°C，旋转下继续聚合反应； (3) 高速离心收集沉淀，去除未反应物，离心收集沉淀冷冻干燥得白色粉末状产物。2. 如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸载抗IL-1 β IgY抗体的药物微球的制备方法，其特 征在于，第（1)步:单体甲基丙烯酸MAA和交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯用量比按重量计为 10:0·5 _2 〇3. 如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸载抗IL-1 β IgY抗体的药物微球的制备方法，其特 征在于，第（1)步中的引发剂是AIBN。4. 如权利要求3所述的聚甲基丙烯酸载抗IL-Ιβ IgY抗体的药物微球的制备方法，其特 征在于，第（1)步中取250 mg，2.904 mmol的单体聚甲基丙稀酸MAA，溶于20 mL乙腈中，再加 入27.78 mg，0.107 mmol的交联剂二甲基丙稀酸乙二醇酯以及8.33 mg，0.051 mmol的引发 剂AIBN充分溶解并混合均匀后。5. 如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸载抗IL-1 β IgY抗体的药物微球的制备方法，其特 征在于，第(2)步中是通氮气。6. 如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸载抗IL-1 β IgY抗体的药物微球的制备方法，其特 征在于，第(2)步中是置60°C油浴中，半小时内梯度升温至100°C。7. 如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸载抗IL-1 β IgY抗体的药物微球的制备方法，其特 征在于，第(2)步中旋转是650-900 rpm转速，并继续聚合反应1 h。8. 如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸载抗IL-1 β IgY抗体的药物微球的制备方法，其特 征在于，第(3)步中高速离心收集沉淀，用乙醇洗去未反应物，洗涤三次，离心收集沉淀冷冻 干燥得白色粉末状产物即得。
【文档编号】A61K47/32GK105832679SQ201610305513
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】刘涛, 李永贺, 江刚, 姜雯频, 朱喜玲, 胡国柱, 张涛
【申请人】南方医科大学珠江医院