化合物pacma3在制备抗丙肝病毒感染药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种化合物PACMA31在制备抗丙肝病毒感染药物中的应用。所述抗丙肝病毒感染药物为PACMA31作为唯一活性成分或包含PACMA31的药物组合物。本发明通过实验证实，PACMA31可在RNA水平和蛋白水平抑制丙型肝炎病毒的感染，能够显著抑制HCV入侵靶细胞。本发明为PACMA31提供一种制备抗丙型肝炎病毒感染药物的用途。本发明为寻找抗丙型肝炎病毒药物提供了新的来源。
【专利说明】
化合物PACMA3在制备抗丙肝病毒感染药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种化合物的用途，具体地说，是化合物PACMA31在制备抗丙肝病毒感 染药物中的应用。
【背景技术】
[0002] HCV(Hepatitis C virus，HCV)是单正链RNA病毒，属于黄病毒科丙型肝炎病毒属， 主要经血液传播，是引起病毒性肝炎的重要病原体。HCV感染的慢性率超过80%，HCV慢性感 染可引起肝硬化和肝细胞癌，据报道病史20年以上的慢性丙型肝炎患者，肝硬化的年发生 率为10-15%，而每年约有1-7%的肝硬化患者发展为肝癌。干扰素联合利巴韦林是治疗丙型 肝炎的主要措施，然而该药物组合仅对50-70%的HCV感染者有效，而且还存在费用高、副作 用大、病人依从性差的缺点。虽然近年来一些药物公司相继研发出直接抗病毒药物 (direct-acting antiviral agents，DAAs)，在一定程度上促进了抗HCV治疗，然而这些药 物定价普遍较高，进一步加重了病人经济负担。因而仍需探寻不同的治疗药物和手段。
[0003] PACMA31，全称propynoic acid carbamoyl methyl amide，又称为N-(2,4_ Dimethoxypheny1)-N-(l-〇x〇-2-propyn-1-yl)-2-(2-thienyl)glycy1-glycine ethyl ester，化学式C21H22N206S，CAS登陆号1401089-31-3,化学结构式如下：
PACMA31是一种酰胺类化合物，来自南加州大学的研究者发现PACMA31是一种细胞毒 剂，对卵巢癌细胞有非常明显的毒性。其作用机制是PACMA31能够选择性地抑制二硫键异构 酶(Protein disulfide isomerase，Ρ?Ι)的活性。PDI在卵巢癌中高度表达，PACMA31 以]^1 为靶点，干预蛋白质的折叠，当癌细胞中出现许多错误折叠的蛋白后，就会引发细胞压力， 最终导致癌细胞死亡。
[0004] 研究人员还发现PDI参与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus， HIV)入侵靶细胞的膜融合过程，PDI能够促进病毒入侵靶细胞。HIV通过膜蛋白gpl20与细胞 膜的CD4结合，膜蛋白gpl20和gp41的构象在Η)Ι的作用下发生改变，进而病毒内吞进入细胞 并通过膜融合释放病毒基因组。抑制PDI活性的小分子化合物或roi抗体能够抑制HIV病毒 的入侵和传播，显著抑制病毒的感染水平。
[0005] HCV作为有包膜的单正链RNA病毒，其入侵肝细胞时也经过受体结合和膜融合，这 一特点与HIV感染细胞时非常相似。并且HCV的包膜蛋白E1E2上也存在二硫键，已有报道指 出E2的二硫键对于病毒的入侵是非常重要的。因此蛋白质二硫键异构酶(PDI)在HCV入侵细 胞的过程中也可能参与重要作用，然而目前尚未见PDI与HCV相互作用的研究，也没有关于 PDI抑制剂PACMA31与丙型肝炎病毒相关的文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供PACMA31在制备抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用。本发 明所述PACMA31为酰胺类化合物，化学式C21H22N206S，CAS号为1401089-31-3,化学结构式 如下
[0007] 本发明中PACMA31在制备抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用体现为:所述抗丙肝 病毒感染药物为PACMA31作为唯一活性成分或包含PACMA31的药物组合物。
[0008] 上述药物组合物中包括PACMA31和其他药学上可接受的辅料。其中，所述药物制剂 可以是注射制剂或口服制剂，所述注射制剂可以是冻干粉针剂，所述口服制剂可以为散片 剂、胶囊剂或颗粒剂。
[0009] 本发明通过实验证实，PACMA31可在RNA水平和蛋白水平抑制丙型肝炎病毒的感 染，能够显著抑制HCV入侵靶细胞。
[0010] 本发明的优点在于:本发明为PACMA31提供一种制备抗丙型肝炎病毒感染药物的 用途。本发明为寻找抗丙型肝炎病毒药物提供了新的来源。
【附图说明】
[0011] 附图1为P A C M A 31剂量依赖性抑制丙型肝炎病毒复制的实验结果图，其中A为 PACMA31对Huh7细胞的细胞毒作用（CC50=200nM);B为PACMA31抑制HCV复制，半数有效浓度 为70 nM。
[0012]附图2为PACMA31剂量时间依赖性抑制持续HCV感染的实验结果图。
【具体实施方式】
[0013] 下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0014] 实施例1 本实施例为PACMA31抑制丙肝假病毒(HCVpp)感染的试验。采用假病毒模式有助于更安 全地实验，降低危害性。
[0015] 试验药物、试剂及材料如下： 1. 化合物:PACMA31 2. 细胞系Huh7:人肝癌细胞株(具体参照以下文章 ：Liu Y，Zou Z，Zhu B，et al. CXCL10 Decreases GP73 Expression in Hepatoma Cells at the Early Stage of Hepatitis C Virus (HCV) Infection. Int J Mol Sci. 2013 Dec 13;14(12):24230- 41.) 3. 细胞系293T:人胚肾细胞系（具体参照以下文章 ：Liu Y，Zou Z，Zhu B，et al. CXCL10 Decreases GP73 Expression in Hepatoma Cells at the Early Stage of Hepatitis C Virus (HCV) Infection. Int J Mol Sci. 2013 Dec 13;14(12):24230-41.) 4. 细胞培养液:配制，其含10%胎牛血清、0.03%谷氨酰胺、非必需氨基酸、氨苄青霉素和 链霉素 l〇〇U/ml，调pH至7.4。
[0016] 5.细胞消化液:配制，其含0.25%胰蛋白酶，用磷酸盐缓冲液配制。
[0017] 7. HCVpp:HCV假病毒（具体参照以下文章 ：Wang W, Guan M, Liu Y, et al. Alanine scanning mutagenesis of hepatitis C virus E2 cysteine residues: Insights into E2 biogenesis and antigenicity. Virology. 2014 Jan 5;448:229-37.) 实验方法包括如下步骤： (一)HCVpp的制备及感染实验 1.将处于对数生长期的HEK293T细胞传达接种于24孔板内，置于37 °C 5%C02孵箱内培 养过夜。
[0018] 2.观察细胞生长状况，待细胞生长至70%汇合时，进行质粒转染。将脂质体2ul以 及小鼠白血病病毒gag质粒、报告基因 GFP表达质粒以及HCV包膜蛋白E1E2表达质粒置于 100ul opti-MEM培养液中，混匀，室温放置20min。
[0019] 3.吸除HEK293T细胞培养上清，加入400ul opti-MEM培养液，再加入脂质体-质粒 混合液，将细胞培养板置于孵箱内培养。
[0020] 4. 6h后吸除细胞培养上清，加入500ul含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于孵箱内 培养48h，收集细胞培养上清，高速离心去除细胞碎片。
[0021] 5.将Huh7细胞接种于96孔板内，贴壁后每孔加入50ul含HCVpp的培养上清，6h后 换新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养72h，于荧光显微镜下计数绿色荧光阳性细 胞个数。
[0022](二)PACMA31对HCVpp感染的抑制实验 取对数生长期的Huh7细胞，接种96孔板，接种密度1 X 104个/孔，培养24h后加入化合物 及HCVpp，化合物按10、25、50、100 nM的浓度稀释，培养6h后去除化合物及HCVpp混合液，更 换培养基继续培养，72h后在免疫荧光显微镜下读取各孔绿色荧光阳性细胞数。
[0023]抑制实验的结果如下表所示： 表1 PACMA31对丙肝假病毒(HCVpp)的抑制活性
实施例2 本实施例为不同剂量PACMA31抑制丙肝病毒(HCVcc)感染的试验 本实施例的试验药物、试剂及材料同实施例1 实验方法如下： (一)HCVcc的制备 1.病毒扩增 J6JFH1嵌合型HCVcc(105ffu/ml)，取50ul感染接种于24孔板的huh7.5.1细胞，次日换 液，随后根据细胞生长密度传代培养，观察细胞生长状态，待病毒快速增殖导致的细胞病变 效应(CPE)出现后，收集培养上清，12000rpm离心5min，弃去细胞碎片，0.45μπι滤膜过滤，取 适量用于病毒滴度测定，其余分装后冻存于_80°C冰箱备用。
[0024] 2.病毒滴定 Huh7细胞接种24孔板，密度5X104个/孔，培养12h后，弃去培养上清，每孔加入100ul 10倍梯度稀释的HCVcc，共孵育6h，更换为新鲜的培养基，继续培养72h，通过免疫荧光法检 测HCV阳性细胞，一抗用1:100稀释的HCV抗体阳性病人血清，二抗用1:200稀释的FITC标记 的羊抗人IgG。在荧光显微镜下观察发光细胞，并记录最后一个可观察到绿色荧光阳性细胞 的孔内焚光阳性细胞数及相应的稀释梯度，计算出focus forming unit/ml(ffu/ml)数值， 以此代表HCVcc滴度。
[0025] 3. PACMA31对Huh7细胞的细胞毒作用 为了评价PACMA31对Huh7细胞的细胞毒作用，将Huh7细胞接种96孔板，接种密度5 X 104 个/孔，培养6小时后加入不同剂量的?401^31(0、10、25、50、100 1^)，共孵育6小时后，应用 CCK8细胞活力检测试剂盒检测细胞活力，计算半数细胞毒性的药物剂量（med ian cytotoxic concentration，CC50)〇
[0026] 4. PACMA31抑制HCV感染的实验 取处于对数生长期的Huh7细胞，调整细胞浓度为1 X 105个/ml，取100μ1接种96孔板，培 养24h后加入化合物和HCVcc，化合物按0、10、25、50、100 ηΜ浓度稀释，37度培养6小时后去 除化合物和HCVcc混合液，换培养液继续培养;48小时后进行实时定量PCR和western blot 法检测Huh7细胞内丙肝病毒RNA和蛋白水平，计算出半数有效浓度（concentration for 50% of maximal effect，EC50)〇
[0027] 通过细胞毒实验和HCV感染实验，我们发现化合物PACMA31剂量依赖性抑制HCVcc 的复制（如附图1所示），EC50为70 nM，CC50约为200 ηΜ。
[0028] 实施例3 本实施例为PACMA31剂量时间依赖性抑制持续HCV感染的实验 本实施例的试验药物、试剂及材料同实施例1。
[0029]实验方法如下 1、HCVcc持续感染Huh7细胞构建 Huh7细胞接种10cm培养皿，接种密度5X106个/孔，培养12小时后，以HCVcc感染(Μ0Ι = 2)，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养至细胞铺满平皿，以1比3传代，继续同条件培 养。连续培养14天，即建立HCV持续感染的Huh7细胞株。
[0030] 2、PACMA31对持续性HCVcc感染细胞的病毒抑制实验 将HCVcc持续感染的Huh7细胞接种96孔板，密度5 X 104个/孔，于C02孵箱内培养6小时 后，加入化合物PACMA31(70 nM、100 nM)，继续培养6小时，用100μ1完全培养基洗涤细胞3 次，加入新鲜培养基，继续培养，并于化合物加入后不同时间点（1天、2天、3天、5天、9天），收 集细胞，抽提细胞总RNA，以实时定量PCR方法检测细胞内HCV的RNA水平。
[0031] 三、实验结果 如附图2所示，PACMA31对持续性HCVcc感染呈现时间剂量依赖性抑制作用。在药物作用 第9天时，细胞内HCV的RNA水平降低60%以上。
[0032] 上述实验结果表明，化合物PACMA31能够显著的抗丙型肝炎病毒活性，因此可用于制备 抗丙型肝炎病毒的药物。本发明为寻找抗丙型肝炎病毒药物提供了新的来源。
[0033] 以上实施例仅仅是本发明的优选实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施 例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于 本发明保护的范围。同时，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思 想，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有 改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【主权项】
1.化合物PACMA31在制备抗丙肝病毒感染药物中的应用，所述PACMA31为酷胺类化合 物，化学式C21肥2N206S，CAS号为1401089-31-3,化学结构式如下其特征在于:所述抗丙肝病毒感染药物为PACMA31作为唯一活性成分或包含PACMA31的 药物组合物。
【文档编号】A61K31/381GK105832722SQ201610245898
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】刘媛
【申请人】刘媛