AT-101在制备Hedgehog信号通路的选择性抑制剂中的用图
【专利摘要】本发明属于肿瘤药理学及Hedgehog信号通路研究领域，涉及AT-101在制备Hedgehog信号通路的选择性抑制剂中的用途；具体涉及AT-101在体外NIH3T3细胞中对Hedgehog信号通路的特异性抑制，以及对Hedgehog活性异常升高的实体瘤(如髓母细胞瘤)的生长抑制中的用途。本发明提供了证明AT-101对Hedgehog信号通路特异性抑制的实验方法和证据，和AT-101体内体外抗瘤效应的评价体系，同时证实了AT-101Hedgehog信号通路的作用靶点及其体内的抗瘤效应。本发明可进一步用于制备新的抗肿瘤药。
【专利说明】
AT-101在制备Hedgehog信号通路的选择性抑制剂中的用 途
技术领域
[0001] 本发明属于肿瘤药理学及Hedgehog信号通路研究领域，涉及AT-101在制备 Hedgehog信号通路的选择性抑制剂中的用途；具体涉及AT-101在体外NIH3T3细胞中对 Hedgehog信号通路的特异性抑制，以及对Hedgehog活性异常升高的实体瘤（如髓母细胞 瘤）的生长抑制中的用途。
【背景技术】
[0002] 据报道显不，Hedgehog信号通路最早于1980年在果绳中发现，它在许多的生理过 程中发挥着关键性的作用，如，组织形成，形态的发生，细胞分化，胚胎发育，骨形成等。研究 显示，除了在胚胎发育过程中发挥作用，Hedgehog信号通路还在出生后的发育及维持组织 /器官的稳态和功能中起着重要作用。有研究证明，Hedgehog信号的异常活化与许多肿瘤 的发生密切相关，如髓母细胞瘤、基底细胞癌、急性粒细胞白血病以及前列腺癌、乳腺癌、直 肠癌和肺癌等。阻断肿瘤细胞中Hh信号传导通路将为人类肿瘤的治疗提供一个新的有效 手段。
[0003] 现有技术公开了 Hedgehog(Hh)信号通路主要由分泌型糖蛋白配体Hedgehog、 跨膜蛋白受体Ptched(Ptch)、跨膜蛋白Smoothened(Smo)、核转录因子Gli蛋白及下游革巴 基因组成。人类和鼠中存在三个Hedgehog的同源基因：Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog (IHH)和 Desert Hedgehog (DHH)，分别编码 Shh、Ihh 和 Dhh 蛋白；两种 patched 基 因（PTCH1和PTCH2)，3种CLi相关基因（GLi 1，GLi2, Gli3)。正常情况下Hedgehog信号 通路调控着胚胎期组织细胞的生长分化，胚胎发育成熟后，进入失活状态，此时，Smo蛋白的 活性被抑制。Shh、Ihh和Dhh蛋白这三种配体都有相同的受体Ptchl。Ptchl是一种具有 12次跨膜结构的膜蛋白，在没有配体激活的情况下，这种膜蛋白抑制它下游的Smo的活性。 Smo是一种具有7次跨膜结构的膜蛋白，同时也是G蛋白偶联受体样蛋白。当Hedgehog配 体与Ptchl受体结合之后，Ptchl对Smo的抑制作用解除，Smo激活。活化的Smo将信号传 递到通路最后的一环，即核转录因子Gli，下游的Gli转录因子被激活，以全长形式转入核 内引起革巴基因的转录。
[0004] 已知AT-101是棉酚的左旋异构体，棉酚是从棉花的种子中提取分离出来的一种 化合物，具有杀精作用，其最初是用做避孕药。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供AT-101在制备Hedgehog信号通路的选择性抑制剂中的新 的用途；具体涉及AT-101在体外NIH3T3细胞中对Hedgehog信号通路的特异性抑制，以及 对Hedgehog活性异常升高的实体瘤（如髓母细胞瘤）的生长抑制中的用途。
[0006] 本发明采用棉籽中提取分离的AT-101，经AT-101对Hedgehog信号通路特异性抑 制的实验以及AT-101体内体外抗瘤效应的评价体系研究，结果证实，AT-101是Hedgehog信 号通路的特异性抑制剂以及它的体内抗瘤作用。
[0007] 本发明所述的的化合物是棉酚的左旋异构体（(_) enantiomer，简称AT-101)具有 如下结构：
[0008]
[0009] 本发明进行了 AT-101对体外NIH3T3细胞中Hedgehog信号通路的特异性抑制 作用实验，结果显示，AT-101能显著抑制NIH3T3细胞中Hedgehog信号活性，能显著抑制 C3H10T1/2中碱性磷酸酶的活性，也即是对Hh信号通路有抑制作用；
[0010] 本发明进行了 AT-101对Hedgehog信号通路作用靶点的探索实验，结果显 示，AT-101能剂量依赖性的抑制转染Smoothened激活的Gli luciferase活性，而对 Smoothened突变体SmoM2(W535L)所激活的Gli luciferase活性无抑制作用，表明AT-101 是Smoothened的诘抗剂；
[0011] 本发明进行了 AT-101对Hh依赖的髓母细胞瘤的体内抗瘤效应，结果显示，AT-101 能显著抑制髓母瘤细胞中Hedgehog信号活性。
[0012] 本发明经实验证实。所述的AT-101不同于传统的细胞毒性化疗药物，具有对 Hedgehog信号通路的特异性抑制作用，即具有分子靶向性，因此对肿瘤细胞的选择性更好， 进一步，所述的AT-101可用于制备Hedgehog信号通路的选择性抑制剂，或治疗肿瘤的药 物，尤其是治疗Hedgehog信号异常活化的肿瘤（如髓母细胞瘤）的药物。
[0013] 本发明还提供了一整套Hedgehog信号通路抑制剂体内外抗肿瘤药效评价的体 系。
[0014] 本发明的有益效果是：
[0015] 1，公开了 AT-101是Hedgehog信号通路的特异性抑制剂以及它的体内抗瘤效应。
[0016] 2,探索获得了 AT-101对Hedgehog信号通路的作用靶点，AT-101是Smoothened的 拮抗剂。
[0017] 3、AT-101对Hedgehog信号通路的作用具有特异性，且能在转录水平阻断 Hedgehog信号的传递。
[0018] 5、提供了将AT-101制成靶向Hedgehog信号通路的抗肿瘤药物的理论基础，能明 显扩大AT-101的应用领域；
[0019] 6、可进一步将AT-101制备成新的抗肿瘤药。
[0020] 以下通过附图并结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，但并不限制本发明的 保护范围。
【附图说明】
[0021] 图1为不同浓度下，AT-101作用于NIH3T3细胞36h后，Gli luciferase活性抑制 的量效曲线，结果表明其对SHH刺激的Gli luciferase活性抑制的的IC50为1. 84uM，对 SAG激活的Gli luciferase活性抑制的IC50为2. 72uM。
[0022] 图2为不同浓度下，AT-101作用于NIH3T3细胞24h后GlilmRNA表达的柱形图， 呈现良好的量效关系。
[0023] 图3为不同浓度下，AT-101作用于C3H10T1/2细胞72h后碱性磷酸酶活性抑制的 柱形图，结果表明其对C3H10T1/2的分化有抑制作用，呈现良好的剂量关系。
[0024] 图 4 为转染 Smoothened 质粒与 Smoothened M2 (W535L)质粒激活 Hedgehog 信号 后，用不同浓度的AT-101作用NIH3T3细胞36h后，抑制Smoothened激活的G1 i lucif erase 活性；然而对SmoothenedM2(W535L)激活的Gli luciferase活性没有抑制作用，呈现良好 量效曲线，说明AT-101是Smoothened的诘抗剂。
[0025] 图5为AT-101与Bodipy-cyclopamine的相互作用的情况，结果表明AT-101和 cyclopamine存在竞争性结合Smoothened的作用，进一步说明了 AT-101是Smoothened的 拮抗剂。
[0026] 图6为从裸小鼠身上的髓母细胞瘤组织分离得到的髓母瘤细胞，用AT-101处理 24h后Gli ImRNA表达的柱形图。
[0027] 图7为AT-101 (20mg/kg，或40mg/kg灌胃给药，每天一次）给药21天对裸小鼠接 种的髓母细胞瘤的生长抑制效应。
【具体实施方式】
[0028] 下列实施例举例说明了本发明的标准实验室实践，用于示范本发明的模式，而不 应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。
[0029] 应特别指出的是在下列实施例中，使用的分子生物学技术和动物实验技术是本领 域普通技术人员所熟知的，并可在诸如Rudin，C.M.et al. Treatment of medulloblastoma with hedgehog pathway inhibitor GDC-0449.N. Engl. J. Med. 361，1173 - 1178 (2009) 及 Kim J, Tang JY. et al.Itraconazole, a commonly used antifungal that inhibits Hedgehog pathway activity and cancer growth. Cancer Cell.2010Aprl3 ；17 (4):388-99 等参考文献中获得。
[0030] 实施例1AT-101对体外NIH3T3细胞中Hedgehog信号通路的特异性抑制作用实验
[0031] 1. 1双荧光素酶报告基因测试
[0032] NIH3T3 (American Type Culture Collecton)细胞用含 10 % (v/v)新生牛血 清（GIBC0)的 Dulbecco' s modified Eagle' s medium(DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 链霉素 (Hyclone)，37°C，5% C02恒温培养，以3X104个/孔种在48孔板中，24h后用转染试剂 lipo2000 (Invitrogen)车专染Gli-dependent firefly luciferase reporter和 TK-Renilla luciferase reporter vectors。转染后36h，换成含1 %新生牛血清（GIBC0)的培养基， SAG(50nM)或 SHHN conditioned medium(SHHN-CM)及配制成不同浓度的 AT-101 (Selleck) 对细胞进行处理，同时设置空白对照组和阳性对照组，37°C，5% C02恒温孵育36h后，细胞 用1XPBS洗2次，按照双焚光素酶报告系统（Promega)的说明书进行Gli 1-luciferase相 对活性的检测，本实验每个浓度设三个复孔，至少重复三次；
[0033] 1. 2 实时荧光定量 PCR (QRT-PCR)
[0034] NIH3T3(ATCC)细胞用含 10% (v/v)新生牛血清（GIBC0)的 Dulbecco's modified Eagle' s medium(DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 链霉素，37°C，5% C02 恒温培养，以 4X105 个 / 孔种在六孔板中，24h后换成含10% SHHN conditioned medium(SHHN_CM)、l%新生牛血清 (GIBC0)的DMEM培养基，细胞以不同浓度梯度的AT-lOl(selleck)(溶于DMSO(sigma)中） 处理，24h后用Trizol (北京鼎国生物）提取总RNA，以内源性的管家基因⑶SB作为参照，用 逆转录试剂盒（Takara)以及:S:YB_R?Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)系统（Takara)进 行处理后，使用Biorad IQ5. 0型实时荧光定量PCR仪，用染料法对Hedgehog的靶基因Gli ImRNA进行定量测定，本实验每个浓度设三个复孔，至少重复三次，实验结果均为以GUSB标 准化后计算出的相对表达水平；
[0035] 1. 3碱性磷酸酶实验
[0036] C3H10T1/2(ATCC)细胞用含 10% (V/V)胎牛血清（GIBC0)的Dulbecco's modifies Eagle's medium (DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 链霉素，37°C，5% C02 恒温培养，以 4X104 个细 胞于48孔板中，24h后加入5% SHHN conditioned medium(SHHN-CM)及配制成不同浓度的 AT-101 (Selleck)对细胞进行处理。37°C，5% C02恒温孵育72h后，细胞用1XPBS洗2次， 用碱性磷酸酶试剂盒测定碱性磷酸酶的活性（碧云天）；
[0037] 结果显示：AT-101能显著抑制NIH3T3细胞中Hedgehog信号活性，表现为抑制 G1 i lucifearse的活性，抑制效果成明显量效关系；其IC50为1. 84uM，对SAG激活的Gli luciferase活性抑制的IC50为2. 72uM(如图1所示）；AT-101能显著抑制NIH3T3细胞中 Hedgehog信号活性，表现为Gli ImRNA的相对表达降低，抑制效果成明显量效关系（如图2 所示）；AT-101能显著抑制C3H10T1/2中碱性磷酸酶的活性，也即是对Hh信号通路有抑制 作用，抑制效果成明显剂量关系（如图3所示）。
[0038] 实施例2AT-101对Hedgehog信号通路作用靶点的实验研究
[0039] 2. 1AT-101 对转染 Smoothened 后激活的 Gli luciferase 活性的抑制
[0040] NIH3T3(ATCC)细胞用含 10% (v/v)新生牛血清（GIBC0)的 Dulbecco's modified Eagle' s medium(DMEM) (GIBC0)，青霉素 / 链霉素，37°C，5% C02 恒温培养，以 3X104 个 /孔种在48孔板中，24h后用转染试剂lipo2000同时转染hSmo (生博）、Gli-dependent firefly luciferase reporter 和 TK-Reni 11a luciferase reporter vectors。车专染后 36h，换成含1%新生牛血清（GIBC0)的DMEM培养基，用不同浓度的AT-lOl(Selleck)对细 胞进行处理，37°C，5% C02恒温孵育36h后，细胞用1XPBS洗2次，用双荧光素酶报告系统 测定Gli-luciferase的相对活性（Promega)，本实验每个浓度设三个复孔，至少重复三次；
[0041] 结果表明AT-101能剂量依赖性的抑制转染Smoothened激活的Gli luciferase 活性（如图4A所示），而对Smoothened突变体SmoM2 (W535L)所激活的Gli luciferase活 性并无抑制作用（如图4B所示），说明AT-101是Smoothened的诘抗剂；
[0042] 2. 2AT-101 与 Bodipy-cyclopamine 的相互作用
[0043] 293T(ATCC)细胞用含 10 % (V/V)胎牛血清（GIBC0)的 Dulbecco' s modifies Eagle's medium(DMEM)(GIBC0)，青霉素 / 链霉素，37 °C，5 % C02 恒温培养， 以1 X 105个细胞接种于24孔板中，24h后用转染试剂lipo2000 (Invitrogen)转染 hsmo(0rigene)500ng，转染后24h，换成含1%新生牛血清（GIBC0)的DMEM培养基，加入 Bodipy-cyclopamine (Biovision) (luM)以及不同浓度的 AT-lOl(Selleck)对细胞进行处 理，37°C，5% C02恒温孵育lOh后，细胞用1XPBS洗2次，4%多聚甲醛固定10mins，lXPBS 洗 2 次，0? 1% Triton 冰上孵育 10mins，0. 5ug/ml DAPI (鼎国昌盛）染色 5mins, 1XPBS 洗 2次，封片；
[0044] 结果表明AT-101与Bodipy-cyclopamine存在竞争性结合（如图5所示），进一步 说明AT-101是Smoothened的诘抗剂。
[0045] 实施例3AT-101对Hh依赖的髓母细胞瘤的体内抗瘤效应
[0046] 3. 1AT-101对髓母细胞瘤细胞中Gli ImRNA表达的影响
[0047] 从生长旺盛的髓母细胞瘤组织分离得到瘤细胞，Neurobasal-A Medium(Gibco)， B-27添加剂（Gibco)，丙酮酸钠（Gibco)，L-谷氨酰胺（Gibco)，青霉素/链霉素（Hyclone)， 37°C，5% C02恒温培养，以5X106个/孔种在六孔板中，24h后细胞以不同浓度的 AT-lOl(selleck)(溶于DMSO(sigma)中）处理，24h后用Trizol(北京鼎国生物）提取总 RNA，以内源性的管家基因⑶SB作为参照，用逆转录试剂盒（Takara)以及SYBR 5 Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)系统（Takara)进行处理后，使用Biorad IQ5. 0型实时荧光定量 PCR仪，用染料法对Hedgehog的靶基因G1 i ImRNA进行定量测定，本实验每个浓度设三个复 孔，至少重复三次，实验结果均为以GUSB标准化后计算出的相对表达水平；
[0048] 结果显示：AT-101能显著抑制髓母瘤细胞中Hedgehog信号活性，表现为GlilmRNA 的相对表达降低，抑制效果成明显量效关系（如图6所示）；
[0049] 3. 2AT-101对Hh依赖的髓母细胞瘤的生长抑制效应
[0050] 取生长旺盛的Ptch+/ P53 / C57B/L小鼠自发长出的髓母细胞瘤组织剪切成1. 5mm3 左右，在无菌条件下，接种于4-6周龄的远交系无胸腺雌性裸鼠（Slac)的左侧腋窝皮下，待 移植瘤平均体积长至~110mm 3,剔除移植瘤过大、过小以及未见生长的裸小鼠，随机分组给 药，每2-3天用游标卡尺测量一次肿瘤体积和裸鼠体重，实验组按照10mg/kg灌胃给药，每 天一次；⑶C-0449阳性对照组按照12. 5mg/kg灌胃给药，每天2次，阴性对照组同时给等量 的溶媒〇. 5% CMC。肿瘤体积（tumor volume, TV)的计算公式为：TV = l/2XaXb2,其中a、 b分别表示长和宽。根据测量的结果计算出相对瘤体积（relative tumor volume，RTV)，计 算公式为：RTV = Vt/V。其中V0为分笼给药时测量所得的肿瘤体积，Vt为每一次测量时的 肿瘤体积，抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(% )，计算公式如下：
[0051] T/C (% ) = Trtv/Crtv X 100其中Trtv表示治疗组RTV，C RTV表示阴性对照组RTV ;
[0052] 结果显示：AT-101对同种异体移植的髓母细胞瘤具有较为明显的抗瘤效应（如图 7所示）。
【主权项】
1. 如下结构的化合物AT-101在制备Hedgehog信号通路的选择性抑制剂中的用途2. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的AT-101抑制NIH3T3细胞中Hedgehog 信号活性，和抑制C3H10T1/2中碱性磷酸酶的活性。3. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的AT-101是Smoothened的诘抗剂， 其中，AT-101抑制转染Smoothened激活的Gli luciferase活性，对Smoothened突变体 SmoM2(W535L)激活的Gli luciferase活性无抑制作用。4. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的AT-101用于制备靶向治疗肿瘤的药 物。5. 按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤是髓母细胞瘤。6. 按权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述的AT-101抑制髓母瘤细胞中 Hedgehog信号活性。
【文档编号】A61P35/00GK105853400SQ201510030980
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月21日
【发明人】谭文福, 彭元求, 王娟, 刘原, 杨君
【申请人】复旦大学