苯扎托品及其药学上可接受的盐的新应用

苯扎托品及其药学上可接受的盐的新应用
【专利摘要】本发明涉及苯扎托品及其药学上可接受的盐的新应用，苯扎托品及其药学上可接受的盐对乳腺癌细胞系MCF?7，4T1?luc2，MDA?MB?231，SKBR3有很强的抑制作用，而且整体动物实验也有明显效果，以证明苯扎托品及其药学上可接受的盐可应用于制备抗乳腺肿瘤、抑制乳腺肿瘤转移的疾病或肿瘤的药物。
【专利说明】
苯扎托品及其药学上可接受的盐的新应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药物的新应用，特别是涉及苯扎托品及其药学上可接受的盐的新应 用。
【背景技术】
[0002] 1998年Wessler提出非神经元性胆碱能系统的概念，非神经元性Ach，从细胞中分 泌出来，通过自分泌或旁分泌机制，作用于自身或邻近细胞上的nAChR和mAChR，调节细胞的 基本功能，如基因表达、扩增、分化、细胞骨架的形成、细胞间接触等，近年研究发现非神经 元胆碱能系统与多种肿瘤的形成和发展密切相关。
[0003] 目前文献报道支配乳腺的神经主要是感觉神经和交感神经，副交感神经或者是迷 走神经对乳腺的支配还不清楚。交感神经影响乳腺癌的转移，在小鼠乳腺癌模型中，不同的 压力应激如游泳应激、手术应激、社交冲突和低温均能够促进肿瘤向肺转移，注射肾上腺 素能够促进乳腺癌的转移;更为重要的是，非留体抗炎药吲哚美辛，和肾上腺素拮抗剂纳 多洛尔(nadolol )，能够阻止癌细胞向其他器官转移，因此癌细胞向其他器官转移这种效应 能够被肾上腺素能信号所调节。
[0004] 胆碱能信号是否调节乳腺生理还不清楚，但影响乳腺癌生长和转移确有文献报 道，如胆碱能信号通过a9_nAChR影响细胞Ca 2+机制激活蛋白激酶A(protein kinase A， PKA)，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide_3kinases， PI3K)/Akt，和丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)等信号 通路促进肿瘤发生和生长。
[0005] 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，痛苦的生活经历增加了妇女患乳腺癌的几 率，多种肿瘤低生存率和高死亡率与慢性抑郁相关联，精神压力兴奋交感神经系统从而影 响乳腺功能是清楚的。
[0006] 苯扎托品也是多巴胺转运体抑制剂，可应用于可卡因成瘾。最近研究还揭示了苯 扎托品的新用途，其对继发型多发性硬化症有较好的治疗效果，其作用机制不是通过抑制 烟碱型乙酰胆碱受体和组胺的释放，也不是通过抑制多巴胺的再摄取，而是作为一种毒蕈 碱型受体抑制剂，促进少突前体细胞(oligodendrocyte precursor cells)的分化成熟而 发挥药理作用。
[0007] 甲横酸苯扎托品[End0-3_(diphenylmethoxy )-8-methyl-8_azabicyclo[3，2，1 ] octane methanesulfonate，benztropine mesylate]，结构式为：
*. ?是苯扎托品（benztropine)的甲磺酸盐，为 阿托品类衍生物，可以穿过血脑屏障，具有中枢性抗胆碱、抗组胺及轻度局麻等药理作用， 用于治疗帕金森综合症。
[0009] 目前，由于肿瘤生长和治疗的复杂性，尚未有关于苯扎托品及其药学上可接受的 盐可用于制备抗乳腺肿瘤、抑制乳腺肿瘤转移等的药物。

【发明内容】

[0010] 基于此，有必要针对上述问题，提供一种苯扎托品及其药学上可接受的盐的新应 用。
[0011] 具体技术方案如下：
[0012] 本发明提供了苯扎托品及其药学上可接受的盐在制备抗乳腺肿瘤的药物中的应 用。
[0013] 在其中一些实施例中，所述苯扎托品药学上可接受的盐为甲磺酸苯扎托品。
[0014] 在其中一些实施例中，所述乳腺肿瘤为乳腺癌。
[0015] 本发明还提供了苯扎托品及其药学上可接受的盐在制备抑制乳腺肿瘤转移的疾 病或肿瘤药物中的应用。
[0016] 在其中一些实施例中，所述苯扎托品药学上可接受的盐为甲磺酸苯扎托品。
[0017] 在其中一些实施例中，所述乳腺肿瘤转移的疾病或肿瘤为乳腺肿瘤向腹股沟淋巴 结转移的疾病或肿瘤。
[0018] 在其中一些实施例中，所述乳腺肿瘤转移的疾病或肿瘤为乳腺肿瘤向肝脏转移的 疾病或肿瘤。
[0019] 本发明还提供一种防治乳腺肿瘤的药物，其活性成分为苯扎托品或其药学上可接 受的盐。
[0020] 在其中一些实施例中，所述苯扎托品药学上可接受的盐为甲磺酸苯扎托品。
[0021] 本发明相较现有技术的优点以及有益效果为：
[0022] 发明人发现苯扎托品及其药学上可接受的盐对乳腺癌细胞系MCF-7,4Tl-luc2， MDA-MB-231，SKBR3有很强的抑制作用，而且整体动物实验也有明显效果，以证明苯扎托品 及其药学上可接受的盐可应用于制备抗乳腺肿瘤、抑制乳腺肿瘤转移的疾病或肿瘤的药 物；由于肿瘤生长和治疗的复杂性，苯扎托品及其药学上可接受的盐可应用制备的抑制乳 腺肿瘤转移的疾病或肿瘤的药物为抑制乳腺肿瘤向腹股沟淋巴结以及肝脏转移的药物。
[0023] 苯扎托品药学上可接受的盐，如甲磺酸苯扎托品，其发挥药效的为主结构苯扎托 品，但其相较苯扎托品具有水溶性大，可增加药物在人体内的吸收的优点。
【附图说明】
[0024] 图1为苯扎托品对细胞增殖的影响示意图；
[0025] 图2为苯扎托品对在体肿瘤生长和转移的作用示意图，其中A为重量大小变化示意 图，B为肿瘤重量变化示意图，C为小鼠体重变化示意图。
【具体实施方式】
[0026] 以下通过实施例进一步说明本发明。
[0027] 以下实施例中所用原料均为市售普通原料。
[0028] 实施例
[0029](一)苯扎托品对乳腺癌细胞增殖的影响
[0030] 1 材料
[0031] 1.1实验细胞系 4Tl-luc2cells，MDA-MB-231cells，SKBR3cells，MCF_7cells，均来 源于ATCC公司。
[0032] 1 ? 2试剂CCK-8试剂盒、DMEM。
[0033] 1.3仪器15mL离心管、1.5mL EP管、lmL和200yL枪头、排槽，在实验前准备好，121°C 30min灭菌后置于超净台中；
[0034] 96孔培养板为一次性塑料制品；
[0035]超净台、C02培养箱、倒置显微镜、离心机、单道及八道移液枪、冻存管、细胞计数 板，酶联免疫检测仪等。
[0036] 1.4药品甲磺酸苯扎托品。
[0037] 1.5实验方法
[0038] 细胞培养
[0039] 一、复苏
[0040] 1、把装有 4Tl-luc2cells，MDA-MB-231cells，SKBR3cells，MCF_7cells 四个细胞系 的冻存管分别从液氮中取出来，立即投入37°C水浴锅中，轻微摇动;液体都融化后(大概1~ 1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里；
[0041] 2、把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一 遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟；
[0042] 3、把上清液倒掉，加lml培养基把细胞悬浮起来，吸到装有10ml培养基的10cm培养 皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布；
[0043] 4、标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到C02培养箱中培养，细胞贴壁后换培 养基；
[0044] 5、3天换一次培养基。
[0045] 二、传代
[0046] 1、培养皿中的细胞覆盖率达到80 %~90 %时传代；
[0047] 2、把原有培养基吸掉；
[0048] 3、加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行），消化1~2分钟；
[0049] 4、细胞都变圆后加入等体积的含10%牛胎儿血清卬85，11^1让(^611)的培养基 (Gibco)终止消化；
[0050] 5、用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来；
[0051 ] 6、把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟；
[0052] 7、倒掉上清液，加1~2ml培养基，把细胞都吹起来；
[0053] 8、把细胞传到五个培养皿中继续培养。
[0054] 三、冻存
[0055]把细胞消化下来并离心（离心条件同上）；用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装 到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期;4 °C 30min，-20 °C 30min，-80 °C过 夜，然后放到液氮灌中保存。
[0056] 冻存液的配制：70%的完全培养基（Gibco)+20%FBS+10%DMS0;DMS0(二甲基亚 砜)要慢慢滴加，边滴边摇。
[0057] CCK8法实验步骤
[0058](一)按常规CCK8法来进行细胞活性检测实验，步骤如下：
[0059] 1、在96孔板中加入100yl细胞悬液，将培养板放入细胞培养箱中培养(在37°C，5% C02的条件下）；
[0060] 2、向每孔中加入1 Oyl CCK-8溶液(比例是10 :1)，同时设置空白对照孔；（注意，不 要在孔中生成在气泡，它们会影响0D值的读数）
[0061 ] 3、将培养板放在培养箱内孵育4h，在酶联免疫检测仪0D450nm处测量各孔的吸光 值。
[0062](二)按常规CCK8法来进行细胞增值-毒性检测实验，步骤如下：
[0063] 1、在96孔板中加入100yl细胞悬液，将培养板放入细胞培养箱中培养(在37°C，5% C02的条件下）；
[0064] 2、向培养板加入不同浓度梯度的甲磺酸苯扎托品，每孔lOOiil，设5个复孔；
[0065] 3、5%C02,37°C孵育6天，倒置显微镜下观察；
[0066] 4、每孔加入10yl CCK溶液；（注意，不要在孔中生成在气泡，它们会影响0D值的读 数）
[0067] 6、将培养板放在培养箱内孵育4h，在酶联免疫检测仪0D450nm处测量各孔的吸光 值。
[0068]活力计算：
[0069] 细胞活力*( % ) = [A(加药)_A(空白）]x100
[0070] A(加药）：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度
[0071 ] A(空白）：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度
[0072] A(0加药）：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
[0073] *细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力
[0074]实验结果
[0075] 采用CCK-8法检测细胞活力和药物对细胞增殖的影响，在MCF-7细胞系，苯扎托品 0 ? 1，1，10，50，100yM 处理6天，测定 IC50是7 ? 2yM。
[0076] 随后在4!'1-1此2，]\0^-]\?-231，501?3三种细胞系（41'1-11^2〇6118，]\0^-]\?-231cells以及SKBR3cells)上进行了同样的实验，结果见图1(图中的纵坐标Cell viability代表细胞活力），分别为在4Tl-luc2，MDA-MB-231，SKBR3三种细胞系的DMS0(未加 药前)对照组与不同浓度的甲磺酸苯扎托品（benztropine mesylate)组的细胞活力对比， 与对照组相比，#P〈〇. 01，*#P〈〇. 001，结果表明苯扎托品处理6天有显著的抑制细胞增殖 作用。
[0077] (二)苯扎托品在体抑制小鼠乳腺癌的生长和转移
[0078] 1 材料
[0079] 1.1实验动物
[0080] BALB/c 小鼠
[0081] 1.2仪器与药品
[0082] PBS，紫杉醇（paclitaxel)，甲横酸苯扎托品（benztropine mesylate)，0.9%生理 盐水(0.9%8&1丨1^)，41'1细胞以了〇：)，光学检测仪器。
[0083] 1.3实验方法
[0084]小鼠活体成像检测
[0085]用0.0 lmol/1的PBS洗涤4T1细胞两次后，用PBS将细胞密度调至丨」1.0 X 106/ml，注射 0.2ml细胞悬浮液至BALB/c小鼠乳腺脂肪垫，定期用活体成像法检测小鼠体内肿瘤的生长 和转移情况。
[0086] 1.4统计学方法实验数据用SPSS 11.0软件和Excel2003进行统计，进行配对t检 验。
[0087] 2、实验结果
[0088] 在BALB/c小鼠接种4T1细胞建立乳腺癌模型（4Tltumor model)，连续腹腔注射紫 杉醇（pacl itaxel) (10mg/kg)，甲横酸苯扎托品（benztropine mesylate)(l. 5mg/kg)， 0 ? 9 %生理盐水(0 ? 9 % sal ine)做对照。
[0089] 结果请见图2,图A(其中横坐标表示给药后的天数，纵坐标表示肿瘤大小）、B(其中 纵坐标表示肿瘤重量）、C(其中纵坐标表示小鼠体重，横坐标表示给药后的天数）分别为 benztropine mesylate( 1 ? 5mg/kg)，paclitaxel(10mg/kg)以及0 ? 9%saline给药后的肿瘤 大小（A)，肿瘤重量(B)和小鼠体重（C)变化，x土SD(n= 10)，甲磺酸苯扎托品与对照组比 较，*?〈0.05，**?〈0.01，***?〈0.001，？&(：1^&叉61组与对照组比较，#牝〈0.01，##牝〈0.001 ; 通过活体成像检测的转移小鼠数量请见表1。
[0090] 表1活体成像检测的转移小鼠数量表
[0092] 上表中与对照组(0 ? 9%生理盐水组)相比，*p〈0 ? 05，林*p〈0 ? 001。
[0093] 由图2以及表1可知，从15天开始，与对照组比，给药组紫杉醇(paclitaxel)和甲磺 酸苯扎托品（benztropine mesylate)显著减少了肿瘤大小和瘤重(p〈0.01)，甲磺酸苯扎托 品组小鼠体重与对照组没有显著性差别；甲磺酸苯扎托品组显著抑制了乳腺肿瘤向腹股沟 淋巴结和肝脏转移，但对肺和腋窝淋巴结的转移抑制作用不显著。
[0094] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0095] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 苯扎托品及其药学上可接受的盐在制备抗乳腺肿瘤的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苯扎托品药学上可接受的盐为甲磺酸 苯扎托品。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述乳腺肿瘤为乳腺癌。4. 苯扎托品及其药学上可接受的盐在制备抑制乳腺肿瘤转移的疾病或肿瘤药物中的 应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述苯扎托品药学上可接受的盐为甲磺酸 苯扎托品。6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述乳腺肿瘤转移的疾病或肿瘤为乳 腺肿瘤向腹股沟淋巴结转移的疾病或肿瘤。7. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述乳腺肿瘤转移的疾病或肿瘤为乳 腺肿瘤向肝脏转移的疾病或肿瘤。8. -种防治乳腺肿瘤的药物，其特征在于，其活性成分为苯扎托品或其药学上可接受 的盐。9. 根据权利要求8所述的防治乳腺肿瘤的药物，其特征在于，所述苯扎托品药学上可接 受的盐为甲磺酸苯扎托品。
【文档编号】A61P35/00GK105853420SQ201610211586
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】崔继红, 项辉, 王瑞霞
【申请人】中山大学