新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的制备及应用
【专利摘要】本发明涉及一种新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的制备及应用，所述制备方法包括：抗原制备步骤：将病毒NDRV?TH11株接种永生化的鸭胚成纤维细胞，收获细胞病变达80％的细胞毒，?20℃冻存；疫苗制备步骤：将收获的细胞毒灭活后与自制纳米佐剂混合，搅拌均匀，即得新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗。本发明制备的新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗免疫鸭后能有效抵抗新型鸭呼肠孤病毒强毒株的攻击。
【专利说明】
新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的制备及应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的制备及应用，具体涉及一种新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗及其在预防新发鸭呼肠孤病毒病上的应用，属于预防兽医学领域。
【背景技术】
[0002]禽呼肠孤病毒感染水禽的报道最初仅见于番鸭，称为番鸭呼肠孤病毒病，其致病因子称为番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)。研究表明MDRV对我国的北京鸭以及其它地方品种鸭不具有感染性。随着养鸭业的不断发展，呼肠孤病毒病感染多品种鸭也见报道，但是由于流行区域、发病种群和发病时间的不同，呼肠孤病毒感染鸭表现出不同程度的差异。程安春等报道了 1998年四川、云南等地的“鸭病毒性肿头出血症”疫情，后续研究表明是由鸭呼肠孤病毒所致。2008年，刘红等对广东省某鸭场一种以肿头、软脚、流泪，拉黄绿色稀便，肝出血和坏死及食道泄殖腔溃疡和结痂为主要特征的疫情进行病因调查时，分离到多株病毒，其中包括I株鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus，DRV-GZ株)。2009年，陈少莺等报道了福建省一种以肝脏出血和坏死为主要病变特征的半番鸭和麻鸭呼肠孤病毒病，之后通过对该毒株的感染性和免疫原特性研究，发现这是一株与番鸭呼肠孤病毒存在明显差异的新型呼肠孤病毒。
[0003]2011年，Liu等从北京鸭体内也分离到了一株呼肠孤病毒(HC株)，其动物回归实验表明，DRV-HC株在15d内引起未能引起鸭的死亡，但能引起SPF鸡的死亡，说明该毒株的致病力并不太强。
[0004]同年，我国华东地区的一些养鸭场陆续发生了一种以软脚和肝脏、脾脏坏死为主要特征的传染病，发病率约20%?50%，病死率在80%以上，给养鸭业造成了较为严重的经济损失。中国农业科学院上海兽医研究所从病原生物学、动物回归试验、基因组特性及分子水平上首次证实该病原是一种有别于以往分离的鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒，试验证明此次疫情是由呼肠孤病毒引起，所分离到的病原称为DRV-THll株。值得指出的是，与以往报道的鸭呼肠孤病毒如NDRV-JM85株、番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒相比，新发鸭呼肠孤病毒的宿主谱更广，致病性更强，它可感染包括麻鸭、北京鸭、樱桃谷鸭等在内的多个品种的鸭，而且感染鸭的病死率为50-80%，提示THll株是一株致病力发生变异了的新发鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)。至今为止，该病尚无有效的防治方法。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的制备及应用，为防治新发鸭呼肠孤病毒病提供了一种安全有效的方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0007]第一方面，本发明提供了一种新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤:
[0008]抗原制备步骤:将病毒NDRV-THlI株接种永生化的鸭胚成纤维细胞，收获细胞病变达80 %的细胞毒，-20 0C冻存；
[0009]疫苗制备步骤:将收获的细胞毒灭活后与自制纳米佐剂混合，搅拌均匀，即得新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗。
[0010]优选地，所述的鸭呼肠孤病毒NDRV-TH11株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microb1logical Culture Collect1n Center，简称CGMCC)，保藏单位CGMCC。地址在中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日2013年11月28 日，保藏编号:CGMCC NO:8554 ο
[0011]优选地，所述永生化的鸭胚成纤维细胞为本实验室制备，(其制备参见YuzhiFu,Zongyan Chen,Chuanfeng Li,Guangqing Liu.Establishment of a duck cell linesusceptible to duck hepatitis virus type 1.J Virol Methods.2012Sep；184(1-2):41-5.do1: 10.1016/j.jviromet.2012.05.004.Epub 2012May 23.)与以往原代细胞不能连续传代或SPF鸭胚成本高导致病毒培养困难相比较，本高效细胞灭活疫苗研制所用的细胞是本实验室永生化的细胞，细胞可连续传代，也可悬浮培养，生长状态好，且病毒适应该DEF细胞，并能引起细胞病变，利于病毒的繁殖及疫苗生产。
[0012]优选地，所述自制纳米佐剂包括以下质量百分含量的各组分:纳米壳聚糖25%、乳化剂25%、矿物油50%。与现有的白油佐剂相比，副反应更小。
[0013]优选地，抗原制备步骤中，所述病毒NDRV-TH11株接种鸭胚成纤维细胞单层。
[0014]优选地，疫苗制备步骤中，所述灭活具体采用以下步骤:将收获的细胞毒，按总体积的0.001%加入β-丙内酯(BPL)，37°C灭活24h。本发明采用BPL灭活，可高效灭活病毒。与以往灭活疫苗的灭活方式相比较，灭活更彻底，且安全高效。且避免了因加入甲醛灭活病毒时，甲醛量过多而导致免疫副反应。
[0015]优选地，疫苗制备步骤中，所述灭活后的细胞毒与自制纳米佐剂的体积比为I: I。
[0016]第二方面，本发明提供了一种基于所述方法制备的新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的应用，所述应用包括用于预防新型鸭呼肠孤病毒病。
[0017]优选地，所述预防新发鸭呼肠孤病毒病的方法具体包括:取灭活疫苗免疫种鸭一次，Iml/羽;4周后加强免疫一次，Iml/羽。
[0018]现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
[0019]1.本发明通过免疫种鸭提高子代母源抗体水平，使雏鸭在易感日龄能抵抗新型鸭呼肠孤病毒感染。
[0020]2.用上述高效细胞灭活疫苗免疫产蛋前的种鸭，Iml/羽，间隔28天加强免疫，使免疫种鸭的子代含有较高的母源抗体，免疫种鸭所产的子代雏鸭在15日龄内能够抵抗新型鸭呼肠孤病毒的感染。
[0021]3.本发明简便可行、实用性强，为防治新发鸭呼肠孤病毒病提供了一种安全有效的方法。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0023]实施例1
[0024]本实施例应用鸭呼肠孤病毒NDRV-TH11株接种本实验室永生化的鸭胚成纤维细胞单层，当细胞病变达80%时收获细胞毒;将上述病毒适当浓缩并经β-丙内酯(BPL)灭活后，按适当比例与自制纳米佐剂混匀，制成新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗，然后将上述灭活疫苗应用于预防新型鸭呼肠孤病毒病;种鸭免疫及中和抗体:取灭活疫苗免疫种鸭一次，1ml/羽;4周后加强免疫一次，1ml/羽。所述的鸭呼肠孤病毒NDRV-TH11株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microb1logicalCulture Collect1n Center，简称CGMCC)，保藏单位CGMCC。地址在中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日2013年11月28日，保藏编号:CGMCC NO:85540
[0025]所述的疫苗制备方法具体步骤如下:
[0026](丨)抗原制备:将病毒NDRV-THlI株接种本实验室永生化的鸭胚成纤维细胞，收获细胞病变达80%的细胞毒，-20 °C冻存。当细胞毒对鸭胚成纤维细胞的TCID5q^ 10—67.5/
0.1ml时，可用于病毒灭活。将收获的细胞毒，按总体积的0.001%加入β-丙内酯(BPL)，4°C灭活4h。取灭活后的病毒液接种9日龄SPF鸡胚或11日龄鸭胚，鸡胚及鸭胚应全部存活。
[0027](2)疫苗制备:按1:1的比例加入自制纳米佐剂和灭活的病毒液，搅拌均匀制成油包水型乳剂疫苗。该疫苗无菌检验结果为无菌生长。
[0028]实验证明:3日龄健康易感鸭，每羽颈部皮下注射1.0ml的疫苗后，接种鸭应全部存活，采食、饮水、生长发育等均正常;随机剖杀鸭，心、肝、脾等内脏未见异常。
[0029]于二免后不同时间(S卩PI 7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天、77天、84天、91天)连同对照鸭采血，测定中和抗体效价。结果表明，种鸭在第二次免疫后7天就有一定的抗体，二免后14天抗体效价上升明显，于二免后28-49天时达到2'直到91天时抗体水平为2425。
[0030]雏鸭(免疫种鸭子代)被动保护:取二免后种鸭在60天内所产的种蛋，挑选同一时间孵化出壳的一日龄含NDRV母源抗体的鸭20羽为母源抗体组(A组)；同时设非免疫种鸭子代(无NDRV母源抗体)的I日龄鸭20羽为非母源抗体组(B组)；将A组和B组雏鸭经腿肌注射NDRV强毒05ml/羽，观察21天。并在攻毒后第7天，随机剖杀5羽，观察各器官病变情况。结果:A组雏鸭注射强毒后全部存活，采食、饮水、精神等方面正常，随机剖杀5羽鸭的肝、脾等脏器均正常，未见出血坏死等变化。而B组雏鸭注射强毒后，采食、饮水减少，精神沉郁，整个观察期对照鸭体重比母源抗体组轻且差异明显，随机剖杀5羽鸭肝、脾均观察到严重的出血坏死斑。结果表明种鸭经两次免疫NDRV高效细胞灭活苗后，其子代雏鸭能有效抵抗NDRV强毒感染。
[0031]雏鸭(免疫种鸭的子代)母源抗体消长规律:取种鸭二免后60天内所产种蛋，孵化出壳后采血测定雏鸭NDRV母源抗体消长情况。I日龄雏鸭NDRV母源抗体较高，中和抗体效价达23;之后逐渐下降，在15日龄时还有一定的母源抗体，中和抗体效价为215，在21日龄时母源抗体基本消失。
[0032]临床应用效果评价:在NDRV流行疫区挑选3个种鸭养殖场进行该方法的防制试验。种鸭在开产前两次免疫NDRV灭活苗，所孵化的小鸭跟踪观察30天，试验种鸭及雏鸭都没有出现NDRV感染。而周边未采取以上措施养鸭场不同程度出现雏鸭因发生该病而死亡。进一步证明该方法安全、有效，可用于临床上预防新发鸭呼肠孤病毒病。
[0033]疫苗安全试验:以最小免疫剂量的100倍，肌肉或颈部皮下接种10只I日龄试验雏鸭，观察接种雏鸭的反应，观察期15d。结果I日龄番鸭免疫疫苗后无发病和死亡，剖检未见肉眼可见的大体病变。
[0034]保存期试验:取保存于2-8 °C条件下6、12、15、18、24、28、30个月的灭活疫苗，按确定的最佳免疫剂量免疫I日龄雏鸭，同时设定非免疫对照组，14日龄攻毒。结果显示2-8°C保存6、12、15个月后的疫苗均能完全保护雏鸭抵抗同源强毒的攻击;保存24个月后的疫苗保护率仅为80 %，保存28、30个月的疫苗保护率分别为25 %、20 %。该疫苗最长有效保存期为24个月。
[0035]本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 抗原制备步骤:将病毒NDRV-TH11株接种永生化的鸭胚成纤维细胞或11日龄的鸭胚，收获细胞病变达80 %的细胞毒，-20 0C冻存； 疫苗制备步骤:将收获的细胞毒灭活后与自制纳米佐剂混合，搅拌均匀，即得新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗。2.如权利要求1所述的新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述自制纳米佐剂包括以下质量百分含量的各组分:纳米壳聚糖25%、乳化剂25%、矿物油50 %。3.如权利要求1所述的新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的制备方法，其特征在于，疫苗制备步骤中，所述灭活具体采用以下步骤:将收获的细胞毒，按总体积的0.001%加入丙内酯，37°C灭活24h。4.如权利要求1所述的新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的制备方法，其特征在于，疫苗制备步骤中，所述灭活后的细胞毒与自制纳米佐剂的体积比为I: I。5.—种基于权利要求1所述方法制备的新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的应用，其特征在于，所述应用包括用于预防新发鸭呼肠孤病毒病。6.如权利要求5所述的新发鸭呼肠孤病毒病高效细胞灭活疫苗的应用，其特征在于，所述预防新发鸭呼肠孤病毒病的方法具体包括:取灭活疫苗免疫种鸭一次，Iml/羽;4周后加强免疫一次，Iml/羽。
【文档编号】A61K39/15GK105854011SQ201610265577
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】陈宗艳, 刘光清, 李传峰
【申请人】中国农业科学院上海兽医研究所