针对prrs和胞内劳森氏菌的猪疫苗的制作方法【专利摘要】本发明涉及一种猪疫苗，具体地一种包含活的减毒PRRS病毒和灭活的胞内劳森氏菌的组合的疫苗，其用于保护猪免于PRRS病毒和胞内劳森氏菌的感染。本发明还涉及使用该疫苗保护猪免于PRRS病毒和胞内劳森氏菌的感染的方法。【专利说明】针对PRRS和胞内劳森氏菌的猪疫苗[0001]-般
技术领域：
[0002]本发明一般地涉及猪的健康领域。猪易于受到很多病原微生物。通常通过对猪圈和饲料进行管理，使用药物如抗病毒药和抗生素进行治疗，或者使用疫苗进行预防性治疗，来控制感染。[0003]发明目的[0004]对于猪的健康管理，持续需要方便、安全且有效的方法。[0005]发明概述[0006]为了达到本发明的目的，设计了一种使猪针对各种致病微生物感染进行联合保护的新疫苗，该疫苗包含活的减毒PRRS(猪繁殖与呼吸综合征)病毒以及灭活的胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellularis)抗原的组合。由于它们对猪健康的负面影响，PRRS病毒和胞内劳森氏菌均造成了巨大的经济损失。尽管针对这两种类型的微生物的药物以及疫苗是已知的且可以商购获得，但是还得不到适合为针对这些病原体的感染或临床疾病提供联合保护的联合疫苗，所述疫苗有效、质量高(例如稳定，没有抗原干扰)不是同时可安全用于年幼动物。如通常所知，并非所有预期或建议的抗原组合都可以得到安全有效的联合疫苗。事实上，关于联合疫苗的稳定性、安全性和有效性，有高水平的不确定性，即使单个(单价)疫苗安全且有效时。[0007]要指出的是，术语"联合"并不排除抗原仅在施用于受试动物(例如通过在一个注射部位注射两个单独的疫苗)之后，以活的PRRS病毒和死的全细胞胞内劳森氏菌的组合形式被提供。[0008]欧洲药品评价局（EuropeanAgencyfortheEvaluationofMedicinalProducts)(EMEA)的兽药产品委员会在其出版物"Noteforguidance:requirementsforcombinedveterinaryproducts"（EMEA，2000，CVMP/IWP/52/97_终版）中陈述（第2页/6页），"联合疫苗的开发不是简单直接的。每种组合都应当分别在质量、安全性和功效方面被开发和研究"。该委员会进一步指出寻找好的联合疫苗通常包括联合疫苗中单独组分之间的稳定性和相容性，包括例如防腐剂、赋形剂和稳定剂、灭活剂以及佐剂。在第3页的第一段中，其陈述，"在联合疫苗中，多于一种组分的存在经常引起相互作用，导致与一个或多个特定组分单独施用相比，对单个组分的应答的减弱或增强......本质上此类相互作用通常是免疫学的，但也可能是由其它对免疫系统直接影响较小的因素所引起的"，并且"当使用佐剂来增加对联合疫苗的免疫反应时，可能出现特殊问题。"[0009]美国卫生和公众服务部（U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)、食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration)，生物制品审评和研究中心（CenterforBiologiesEvaluationandResearch)，于1997年4月公布的"GuidanceforIndustry,fortheevaluationofcombinationvaccinesforpreventablediseases：Production，TestingandClinicalStudies"，该指南陈述（第3页，在"组分的相容性"下），"经验已经表明，联合单价疫苗所产生的新联合可能不如理想中安全或有效。有时，灭活疫苗的组分可以对一种或多种活性组分起到不利的作用"，这表明尤其是灭活的疫苗可能对活疫苗的功效产生负面的影响，如例如将活百日咳疫苗和灭活脊髓灰质炎病毒疫苗进行组合时发生的，其导致疫苗的百日咳效价降低。这表示疫苗中任何附加组分都可能会使最终产品的安全和效价与单独的疫苗相比更复杂。[0010]世界卫生组织(WorldHealthOrganization)(WHO)已经公布了称为"疫苗安全性基础(VaccineSafetyBasics)"的电子学习教程，其在模块2(M0DULE2)中关注联合疫苗。该模块开头说"获得许可的联合疫苗在国家当局批准之前要进行广泛的测试，以确保产品安全、有效以及拥有可接受的质量。"该文还陈述到，"对于所有的组合，生产商因而必须评估每种抗原组分的效价，当组合以诱导免疫时疫苗组分的有效性，可能恢复毒性的风险，以及与其他疫苗组分的反应。"[0011]本发明，在疫苗本身之后，还涉及用于保护猪免于感染PRRS病毒和胞内劳森氏菌的方法，其包括施用所述疫苗。[0012]定义[0013]疫苗是防止接种疫苗后感染病原微生物的组成物，即预防或减少微生物感染，或预防或减少感染导致的临床疾病的组成物，通常是通过干扰微生物本身，例如通过抗体，在接种疫苗的宿主中。因此接种疫苗可以预防，或至少减少，感染的水平和/或预防，或至少减少，感染所导致的临床疾病的水平。[0014]野生型细菌的灭活抗原为除活细菌本身外的任意物质或化合物，针对其的免疫应答会被激发，作为该免疫应答的结果，使得相应的毒性细菌或一种或多种其毒性因子将会被宿主的免疫系统识别，并且最终至少被部分中和。野生型细菌的灭活抗原的通常例子是死的全细菌(术语"全"不排除在杀死的过程中细菌细胞至少部分的破裂，或者在"死的全细胞细菌"疫苗中实际上提供死的全细胞细菌的提取物或匀浆作为抗原），细菌的亚单位如表面表达蛋白，以及毒素。后两者可以或者可以不被重组表达。对于胞内劳森氏菌，几种类型的灭活抗原在本领域是已知的，且例如从W02009/144088(死的全细胞细菌，实施例1和2)、W02005/070958(亚单位）和W097/20050(死的全细胞）已知。[0015]活的减毒病毒是能够自我复制，但不能引起通常与其毒性(通常是野生型)病原对应物相关的疾病的全套症状的病毒。通常，活病毒不在目标宿主内进行复制，或复制速度不会对宿主细胞显著有害，或不引起有害的宿主应答。对于PRRS病毒，几种疫苗在本领域是已知的，其包含衍生自野生型病毒的减毒活病毒，其毒性经过在体外培养的宿主细胞系中多次传代被减弱，如例如P〇rcilis?PRRS(MSDAnimalHealth)、IngelvaC?PRRSMLV(BoehringerIngelheim)、Amervac_PRRS(HipraLaboratories)、Pyrsvac-183?(HipraLaboratories)以及F〇stem?PRRS(Zoetis)。在本领域中其它活的减毒PRRS病毒已例如在VeterinaryMicrobiology，volume138，issues1_2,2July2009，，第34-40页；VeterinaryImmunologyandImmunopathology,volume106,issues3_4，15July2005，第309-319页以及Vaccine，volume26，issues29-30,4July2008,第3594-3600页中描述。[0016]本发明的实施方案[0017]在一个实施方案中疫苗用于在单次施用后保护猪免于PRRS病毒和胞内劳森氏菌的感染。有利的发现，该疫苗甚至仅在单次施用后即可保护猪免受两种病原体的感染。该实施方案不排除给予后续疫苗接种，例如第一次接种疫苗后6到12个月以延续保护的水平。该后续疫苗接种不同于初免-加强接种方案中的加强接种，后者仅在加强接种后才能获得保护。在初免-加强方案中，两次疫苗接种通常间隔2-3周。[0018]在一个实施方案中疫苗包含佐剂。发现通常用于改善灭活抗原的免疫应答的佐剂不会负面干扰活的减毒PRRS病毒，也不会过分增加对其它抗原的反应性，尽管WHO在其疫苗安全性基础课程(参见上文)的第1页最后两行（"联合疫苗"章节）中明确警告了这类干扰和反应性。在一个进一步的实施方案中佐剂包括矿物油，例如饱和烃油，其可从ExxonMobil?购得(Marcol?52)。[0019]在还另一个实施方案中，灭活的胞内劳森氏菌抗原包括死的全细胞胞内劳森氏菌，优选负载量使得每剂量该疫苗包含相当于lxio7胞内劳森氏菌的胞内劳森氏菌抗原。此实施方案不排除更高的抗原负载，其可正向影响保护的水平和免疫力的持续时间。[0020]关于疫苗的PRRSv负载，在一个实施方案中每剂量疫苗包含4.01ogl0(4单位的101〇g)TCID5Q的减毒PRRS病毒。此实施方案不排除更高的抗原负载，其可正向影响保护的水平和免疫力的持续时间。[0021]将使用以下实施例和附图进一步解释本发明。[0022]实施例1描述了对PRRS病毒和胞内劳森氏菌联合疫苗的一项研究[0023]图1显示激发后体温[0024]图2显示激发后平均日增重(ADWG)[0025]图3显示激发后PPRS病毒血清学[0026]图4显示激发后胞内劳森氏菌血清学[0027]图5显示激发后PRRS病毒病毒血症[0028]实施例2描述了对PRRS病毒和胞内劳森氏菌联合疫苗的另一项研究[0029]实施例1[0030]研究设计[0031]五只母猪的后代（23只仔猪）用于该试验。当仔猪约两周龄时对它们接种疫苗如下：[0032]-第一组（组I，8只动物）接种（頂)使用DiluvacF〇rte?(MSDAnimalHealth)溶解的冷冻干燥的P〇rcilis?PRRS疫苗（购自MSDAnimalHealth，Boxmeer，TheNetherlands)。单剂量为2ml(注射剂量）中包含计算量为41og10TCID5Q的病毒，颈部右侧给药。[0033]-第二组（组2,9只动物）接种溶解于即用型胞内劳森氏菌疫苗[参见W02009/127684，抗原的实施例2:死的全细胞，在本实验中配制成水包油乳液，包含12.5%v/v(=油的体积比上疫苗的总体积）的矿物油Marco〗?52(ExxonMobi1)，0.75%w/v的维生素E醋酸酯和0.80%的聚山梨酯80(吐温80;SigmaAldrich)以及注射用水]的相同的PRRS疫苗。该疫苗在室温下混合，施用前放置长达30分钟。单剂量为2ml(注射剂量）中包含计算量为41〇g1QTCID5Q的病毒和2xl07细菌细胞，颈部右侧给药。[0034]_第三组(组3,6只动物）中的仔猪未接受疫苗接种而是作为未接种的激发对照。激发感染在疫苗接种后4周使用毒性PRRS激发病毒通过鼻内途径完成。[0035]接种和激发后，每天观察所有仔猪的临床体征。在感染前一天和当天以及之后10天的每天测量体温。在激发前一天，激发后10天以及实验结束前一天(激发后27天)确定体重。激发时及3、5、7、10、14、21和28天后收集血样。[0036]实验程序[0037]兽医检查[0038]在接种疫苗的前一天，对仔猪进行一般健康检查。[0039]观察临床体征[0040]所有猪在到达当天即开始每天观察临床体征。激发当天开始记录个体的可能的全身性反应例如食欲不振、不愿移动、倾向于躺下、倦怠或瞌睡、发抖、毛发竖立以及可能的水月中(尤其在眼部周围）、呕吐和腹泻或呼吸急促和腹式呼吸。[0041]测量体温[0042]在激发前一天和当天以及之后10天的每天(每天的相同时刻），记录所有动物的体温。[0043]测量体重[0044]激发前一天，激发后10和27天，测量仔猪的体重。[0045]血液采样[0046]在疫苗接种前一天采集所有母猪的血液样品以确认阴性状态。激发时及激发后3、5、7、10、14、21和28天采集仔猪血样。血清样品被用于检测?1?1?病毒的可能存在以及?1?1?￥特异性抗体和胞内劳森氏菌特异性抗体的可能存在。[0047]结果[0048]临床体征[0049]在实验过程中，疫苗接种或激发后未观察到临床反应。除了矿物油是非常刺激的佐剂，尤其是对于猪，其可能导致严重的局部反应，看起来将该佐剂用于新的联合疫苗是安全的。因此对于任何更温和的佐剂，安全性可理解为完全没有问题。[0050]体温[0051]计算每组激发前一天和当天所测量的平均激发前体温。图1显示与激发前平均体温相比直到10天平均体温的升高。未接种疫苗的对照仔猪组中只有激发后第2天平均体温升高了rc。其它所有激发后时间点在接种疫苗组和对照组仔猪中均未检测到升高。[0052]体重和体重增加[0053]实验开始时将仔猪随机分组，不考虑起始体重和性别。如图2所示，趋势是组2的联合疫苗提供的ADWG(平均日增重)与单独的PRRSV疫苗相同，高于对照组。[0054]PRRSV血清学[0055]只有接受PRRS疫苗的猪受到激发时为阳性。如图3所示(结果表示为"样品比阳性或S/P"比例，使用IDEXXPRRSX3ELISA)，抗PRRS抗体效价似乎未受到劳森氏菌抗原的负面影响。相反，对PRRS抗体效价似乎还有意料之外的正面影响，因为在每个时间点接受了联合疫苗的动物的PRRS效价都更高。这暗示由于某些还未理解的原因，劳森氏菌抗原增强了对活PRRS病毒的免疫反应。[0056]胞内劳森氏菌血清学[0057]图4给出了劳森氏菌血清学的结果。如图所示，组1中的动物在整个实验过程中均保持阴性。组2中动物的80-90%得到了良好的血清抗体阳转率，与动物被保护免于毒性劳森氏菌激发的阳转率相当。[0058]激发后PRRSV病毒血症[0059]如通常所知，病毒血症是保护免于PRRS病毒感染及其导致的临床疾病的主要读出方式。结果在图5中给出。组1和2在病毒血症方面均有非常高且相当的减少。[0060]实施例2[0061]研究设计[0062]设计该研究以确定该联合疫苗不依赖于佐剂的类型和活PRRS毒株的类型。为此，使用了替代佐剂DiluvacForte(可购自MDSMDSAnimalHealth，Boxmeer，TheNetherlands)以及卡波普(可以是卡波普974P，购自Lubrizol，Cleveland，Ohio，USA)。替代PRRSv毒株为2型毒株（而不是在实施例1中使用的1型毒株），存在于市售疫苗PrimePacPRRS(可购自MerckAnimalHealth，Millsboro，Delaware，USA)2*。[0063]几只母猪的后代被用于分配15只仔猪于3个5只仔猪的治疗组。在大约1周龄时，组1和2的仔猪被接种重构于DiluvacForte(DF)或卡波普(0.8%w/v)中的冻干灭活劳森氏菌疫苗(与实施例1中使用的抗原相同，但现在是冻干的因而与冻干稳定剂结合），如下文表1中所列。疫苗于颈部左侧肌肉内（IM)施用。在约5周龄时，仔猪被(再次)接种两种不同的活PRRSV毒株和劳森氏菌抗原，通过重构抗原于DF或卡波普（0.8%w/v)组合成一个疫苗。PRRSV2型疫苗PrimePacPRRS被溶解为2ml中含有104'5TCID5Q的病毒而PRRSV1型疫苗PorcilisPRRS被溶解为2ml中含有IO^TCIDm的病毒。对于第二次疫苗接种，疫苗于颈部右侧肌肉内（頂)施用。组3的仔猪不接种疫苗且作为未接种对照。[0064]表1疫苗接种方案[0066]初次疫苗接种后每天观察仔猪的临床体征。初次疫苗接种之前，二次疫苗接种之前，以及二次疫苗接种之后的二、四和六周采集所有仔猪的血液样品。检测血清样品中针对PRRS病毒和胞内劳森氏菌的抗体。[0067]结果[0068]在实验过程中未观察到临床反应。二次疫苗接种当天所有动物的胞内劳森氏菌和PRRS抗体均为阴性。二次疫苗接种后六周，除了对照，所有动物的劳森氏菌和PRRSv特异性抗体均为阳性。这证明该联合疫苗是安全的并引起了针对胞内劳森氏菌和PRRS病毒的主动免疫。【主权项】1.一种疫苗，其包含活的减毒PRRS病毒和灭活的胞内劳森氏菌抗原的组合。2.-种疫苗，其包含活的减毒PRRS病毒和灭活的胞内劳森氏菌抗原的疫苗的组合，用于保护猪免于PRRS病毒和胞内劳森氏菌的感染。3.-种疫苗，其包含活的减毒PRRS病毒和灭活的胞内劳森氏菌抗原的疫苗的组合，用于保护猪免于PRRS病毒和胞内劳森氏菌的感染所导致的临床疾病。4.上述权利要求中任一项的疫苗，其特征在于所述疫苗用于在单次施用后保护猪免于PRRS病毒和胞内劳森氏菌的感染。5.上述权利要求中任一项的疫苗，其特征在于所述疫苗包含佐剂。6.权利要求5所述的疫苗，其特征在于所述佐剂包含矿物油。7.上述权利要求中任一项的疫苗，其特征在于所述灭活的胞内劳森氏菌抗原包括死的全细胞胞内劳森氏菌。8.权利要求7的疫苗，其特征在于所述疫苗每剂量包含相当于IX107胞内劳森氏菌的胞内5?森氏囷抗原。9.上述权利要求中任一项的疫苗，其特征在于所述疫苗每剂量包含4.Olog10TCID50的减毒PRRS病毒。10.保护猪免于PRRS病毒和胞内劳森氏菌感染的方法，其包括给动物施用包含活的减毒PRRS病毒和灭活的胞内劳森氏菌抗原的组合的疫苗。11.保护猪免于PRRS病毒和胞内劳森氏菌感染的方法，其包括给动物施用包含活的减毒PRRS病毒和灭活的胞内劳森氏菌抗原的组合的疫苗。12.权利要求10或11的方法，其特征在于所述方法在单次疫苗注射后带来保护。【文档编号】A61K39/02GK105873604SQ201480066510【公开日】2016年8月17日【申请日】2014年12月2日【发明人】C·德雷克斯勒,A·A·C·贾科布斯【申请人】英特维特国际股份有限公司