用于核酸和药物递送的新型plga-修饰的聚乙烯亚胺自组装纳米技术的制作方法
【专利摘要】本发明的实施方式涉及共聚物和纳米颗粒，其用于作为一种或多种试剂的递送试剂，用于治疗人和动物的医学状况。本发明的一些实施方式提供用于在例如细胞培养物、动物模型和植物中进行生物医药研究的新试剂。所述共聚物包含PLGA和PEI，并且，在一些实施方式中，还包含1?(3?氨基丙基)?4?甲基哌嗪(APMP)、Fc结合肽和/或抗体。在某些实施方式中，将包含一种或多种治疗剂的APMP?PLGA?PEI、Fc结合肽/抗体?PLGA?PEI或Fc结合肽/抗体?APMP?PLGA?PEI纳米颗粒递送至需要其的个体，或用于细胞培养物、动物模型和植物中的生物医学研究。
【专利说明】用于核酸和药物递送的新型PLGA-修饰的聚乙烯亚胺自组装 纳米技术
[0001 ]本发明要求2013年8月13日提交的美国临时专利申请系列第61/865，189号的优先 权，其通过引用全文纳入本文。
技术领域
[0002]本发明至少涉及医药、纳米技术、生物学、细胞生物学和/或分子生物学领域。
[0003] 背景
[0004] 基因和药物递送系统是非常活跃的科研与发明领域，这是因为对于诊断治疗和体 外与体内科研的大量需求，以及其目前现有技术的限制。例如，聚（交酯_共聚-乙交酯） (PLGA)型的纳米颗粒已被开发用于药物递送;然而，其对于核酸(例如DNA和RNA)的荷载和 递送效率极低，这归因于其化学性质。脂质体和聚乙烯亚胺(PEI)已被开发用于体外和体内 核酸(例如DNA和RNA)递送。然而，这些递送系统的效率是受限的；并且仍具有高毒性;且制 备过程复杂。目前，在临床应用领域中，尚未出现同时具备高效率和低毒性的递送系统。本 发明满足了本领域对于递送至少一种试剂至个体的高效、低毒性系统的长期需求。
[0005] 概述
[0006] 本发明的实施方式涉及用于向个体递送至少一种任何类型的试剂（包括至少核 酸、蛋白质、小分子和/或任何种类的药物）的有用的递送系统。本发明的一些实施方式涉及 采用PLGA-修饰的聚乙烯亚胺纳米技术的组合物和方法。在某些方面，本发明涉及PLGA-PEI 偶联物及其使用与制备方法。实施方式涵盖PEI和PLGA的化学偶联，在至少一些情况中，以 特定的PLGA/PEI比率偶联。所述实施方式能够使形成的该自组装纳米颗粒具有一种或多种 试剂。在特定实施方式中，试剂是DNA和/或RNA，并且上述复合物具有高DNA和/或RNA荷载 率、高DNA和/或RNA转染效率和低细胞毒性。
[0007] 某些实施方式涉及PLGA和PEI之间的化学反应，和由此所得的组合物。本文提供多 种条件的示例，包括例如，载有DNA的PLGA-修饰的PEI自组装纳米颗粒制剂的示例性的条 件。本发明的实施方式提供高效DNA递送而不具体外和体内毒性。
[0008] 在本发明的【具体实施方式】中，所述组合物包含APMP(APMP:l-(3-氨基丙基)-4_甲 基哌嗪)-PLGA-PEI作为新材料，该新材料具有新的应用。一些实施方式包括其中具有定量 伯胺的PLGA-PEI纳米颗粒，允许用于针对具体DNA(作为示例)荷载和颗粒尺寸设计控制连 接至PE I的PLGA片段尺寸和含量的新方法。
[0009] 本发明的实施方式包括PLGA-PEI/核酸纳米颗粒的制剂:采用某些制备步骤的、不 含有机溶剂或特殊介质的，由PLGA-PEI和核酸(DNA)进行的纳米颗粒制剂的自组装更为有 效，和/或毒性更低。
[0010] 本发明的实施方式提供具有不同反应时间与条件、新结构、新组成、新性质和/或 新功能/应用的新PLGA-PEI材料。
[0011] 本发明的实施方式提供PLGA-PEI/DNA纳米颗粒制剂的新机理，包括化学组合物、 DNA相互作用、颗粒形成和纳米颗粒成像等方面。PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI能够荷载宽范 围的DNA含量用于细胞递送，并以低于其它递送试剂(包括，例如，Lipofectamine 2000和 PEI)的毒性更高效地转染细胞。
[0012] 本发明的实施方式提供基因治疗和化疗的有用联合。PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI 有利于，例如，一起递送治疗基因和化疗药物。在一些情况中，可将一种或多种特异性抗体 连接至PEG-PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI，用于靶向特定细胞类型。该技术特别有用于对于癌 症或其它疾病的靶向治疗。例如，可通过偶联将抗体连接至本发明的复合物。
[0013]在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒和与所述纳米颗粒分开的另一种治疗化合 物使用，以治疗所述个体中的相同适应症。在具体情况中，所述纳米颗粒和所述治疗化合物 分开或一起递送。一起递送时，它们可以或可以不处于相同制剂中，并且它们可以或可以不 通过相同途径递送。
[0014]在实施方式，共聚物组合物包含聚（乳酸-共聚-乙醇酸）（PLGA)和聚乙烯亚胺 (卩￡1)，其中卩11^与?￡1的￥/^比是0.5:1、1:1、2:1或5:1。
[0015] 在实施方式，共聚物组合物包含PLGA和PEI，其中PLGA与PEI的w/w比是0.5:1，并且 其中，PLGA的约70-130个交酯-共聚-乙交酯单元通过酰胺键偶联至PEI分子。
[0016]在一个实施方式中，共聚物组合物包含PLGA和TOI，其中伯胺浓度是约40 % -约 55%。伯胺浓度可以是约45%-约55%、约45%-约52%，或约46%-约52%。伯胺浓度可以是 45%-55%、45%-52%，或46%-52%。
[0017]在某个实施方式中，共聚物组合物包含PLGA、PEI和选自下组的另一化合物：1_(3_ 氨基丙基)-4_甲基哌嗪(APMP)、2_(3_氨基丙基氨基）乙醇、2-甲基_1，5-二氨基戊烧、1_(3_ 氨基丙基)吡咯烷、4-氨基苯基二硫化物和胱胺。
[0018] 在一个实施方式中，共聚物组合物包含PLGA、PEI、APMP和接头，例如聚乙二醇 (PEG)接头，例如包括马来酰亚胺-PEG-NHS。在一些情况中，所述接头是化学偶联至PLGA-PEI 或APMP-PLGA-PEI 聚合物的PEG生物接头(Ma 1-PEG-NHS)，以分别产生Ma 1 -PEG-PLGA-PEI 或 Ma 1 -PEG-APMP-PLGA-PEI。在一些情况中，Ma 1 -PEG-PLGA-PEI 或 Ma 1 -PEG-APMP-PLGA-PEI 化学偶联至Fc结合肽或抗体，用于特异性递送。
[0019] 在一些实施方式中，某些组合物还包含至少一种治疗和/或诊断剂，并且所述共聚 物包含纳米颗粒中的试剂。在特定实施方式中，配制治疗和/或诊断剂以使其适用于动物疾 病、作为研究试剂，或同时满足这两种需求。所述治疗剂可稳定配制用于人类癌症、AIDS、心 脏病、中风、糖尿病、呼吸道疾病、肾病、细菌感染，和/或病毒感染。在特定实施方式中，所述 试剂是核酸、蛋白质、肽、小分子、抗原、疫苗或其混合物。在其中所述核酸是DNA的情况中， 所述DNA可以是双链、单链或其混合物;所述DNA可以是寡核苷酸。在其中所述核酸是RNA的 情况中，所述RNA可以是双链、单链或其混合物。所述RNA可以是siRNA、shRNA、miRNA或其混 合物。在特定情况中，所述诊断剂是带标记的，包括有色和/或荧光标记。在特定实施方式 中，当PLGA与PEI的比率是0.5: lw/w时，所述纳米颗粒处于100和130nm之间。
[0020] 在一些实施方式中，制备本发明的组合物的方法包括如下步骤:将APMP-共聚-1， 4-丁二醇二丙烯酸酯与PEr混合以产生APMP-PEI聚合物;并将该APMP-PEI聚合物与PLGA混 合以形成APMP-PLGA-PEI共聚物组合物。1,4-丁二醇二丙烯酸酯-共聚-1-(3-氨基丙基)-4_ 甲基哌嗪。在特定情况中，APMP-共聚-1,4-丁二醇二丙烯酸酯和PEr混合至少24小时。APMP-PEI聚合物和PLGA可混合至少12、18或24小时。在特定实施方式中，所述方法还包括如下步 骤:将该共聚物组合物与至少一种治疗和/或诊断剂混合。
[0021] 在一个实施方式中，用于治疗个体的医学状况的方法包括如下步骤：向所述个体 递送治疗有效量的本发明的组合物。在特定实施方式中，所述组合物被递送多于一次。所述 组合物可通过注射递送。所述组合物可通过腹膜内或静脉内途径被递送。在一些情况中，所 述方法还包括，向所述个体递送治疗有效量的另一种化合物用于治疗所述医学状况。在某 些方面，方法还包括如下步骤:鉴定所述个体是否需要对其医学状况进行治疗。所述医学状 况可以是癌。
[0022] 在本发明的实施方式中，所述方法和/或组合物以体外、离体或体内方式使用。在 特定实施方式中，体外设定使用所述方法和/或组合物以向特定位置递送具体组合物。例 如，所述组合物可用于清除组合物以影响特定位置(例如医院、学校等的一个或多个表面 上)的细菌、病毒、原生动物等的存在。
【附图说明】
[0023]为了更完整地理解本发明，下面结合附图提供以下说明。
[0024]图 1说明PLGA-PEI (示例0 ? 5 : lw/w)(图 1A)、APMP-PLGA-PEI (图 1B)和Fc结合肽-PEG-PLGA-PEI或Fc结合肽-PEG-APMP-PLGA-PEI (图1C)的形成机理的实施方式。
[0025] 图2显示采用25yg PLGA-PEI/10yg质粒DNA(双链)的多峰尺寸分布结果。
[0026]图3A显示PLGA/PEI/DNA引物（10yg，23个核苷酸，单链）的尺寸分布。图3B显示采用 25yg PLGA-PEI和15yg引物(23个核苷酸，单链)制备的纳米颗粒的粒径分布。
[0027] 图4A显示PLGA-PEI的DNA荷载率，且图4B说明该纳米颗粒的DNA余留。图4C通过DNA 余留试验显示APMP-PLGA-PEI纳米颗粒的DNA荷载率。
[0028] 图5说明示例性的纳米颗粒尺寸。图5A显示，当DNA与氮/磷比率(N/P)7.4的PLGA-PEI凝缩时，产生约150-230nm的颗粒。图5B显示采用更多PLGA-PEI的纳米颗粒尺寸，并且随 着N/P提高至12.2，所得尺寸是100-150腹。图5(：显示当1^^提高至17.2时，尺寸减小至约 50nm。PLGA-PEI是与DNA有效凝缩并且控制了颗粒尺寸的聚合物。
[0029] 图6显示相较于等同PEI量的PEI，PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的细胞毒性。因此，PLGA-PEI /DNA纳米颗粒的毒性低于PE I /DNA递送系统。
[0030] 图7A显示相较于PEI和Lipofectamine 2000递送系统，评价PLGA-PEI/绿色荧光蛋 白（GFP)DNA复合物在PANC-1细胞（胰腺癌细胞系）中的转染效率。图7B显示相较于PLGA-PEI、PEI和Lipofectamine 2000递送系统，测试APMP-PLGA-PEI/GFP DNA纳米颗粒在PANC-1 细胞中的转染效率。在相同条件下，APMP-PLGA-PEI的递送效率优于PLGA-PEI、PEI和 Lipofectamine 2000递送系统。图7C显示在人脐静脉内皮细胞(HUVEV)中，PLGA-PEI纳米颗 粒的转染率比Lipofectamine 2000高得多。不同类型的细胞响应不同转染试剂具有不同转 染率。HUVEC被视作难以转染的细胞。因此，PLGA-PEI递送系统显著优于其它递送系统，例如 Lipofectamine 2000〇
[0031] 图8显示PLGA-PEI /红色荧光蛋白（RFP) DNA-处理的小鼠和用PE I /DNA对照处理的 那些，尤其对于肝、脾和胰腺。PLGA-PEI纳米颗粒递送系统的体内效率高于基于PEI的递送 系统。
[0032] 图9显示PLGA-PEI递送10yg RFP DNA，并分析3天后的肿瘤。在该小鼠模型中， PLGA-PEI纳米颗粒有效于递送DNA进入肿瘤。
[0033]图10显示静脉内给予PLGA-PEI/miR-198纳米颗粒用于治疗小鼠模型中胰腺癌的 治疗应用。通过荧光成像分析（图10A)和直接测量切除的肿瘤（图10B)可见，静脉内（IV)递 送载有miR-198的PLGA-PEI纳米颗粒降低了小鼠模型中的肿瘤荷载和转移扩散。
[0034]图11显示腹膜内（IP)给予PLGA-PEI/miR-198纳米颗粒联合化疗剂吉西他滨用于 治疗小鼠模型中胰腺癌的治疗应用。图11A显示在用PLGA-PEI /mi R-198和吉西他滨处理的 小鼠中，原发和转移的肿瘤的减小(通过荧光成像分析）。图11B显示对于用PLGA-PEI/miR-198和吉西他滨处理的小鼠中的肿瘤尺寸的减小的确认(通过直接测量切除的肿瘤）。
[0035] 图12.对PLGA-PEI共聚物和质粒DNA的化学结构建模和纳米颗粒形成。A. PLGA-PEI 共聚物。各支化的PEI分子(25kDa)具有约214个伯胺、159个仲胺和212个叔胺。而各PLGA分 子（12~16kDa)平均具有215(184-246)个酯键。当PLGA和PEI以1:1的摩尔比率(w/w为0.5: 1)在有机溶剂THF中反应时；形成新产物PLGA-PEI共聚物。PLGA-PEI共聚物中所得的PEI重 量含量是64%;并且PEI的51 %的伯胺在该PLGA-PEI共聚物中被利用，指示PEI的伯胺与 PLGA的酯键发生了反应。PEI保持完整，因为PLGA对PEI的链没有破坏力。估计各PEI分子中 利用了约109个伯胺。基于酯键、PEI含量和伯胺百分数，经总结，PLGA分子被PEI片段化成交 酯 -共聚-乙交酯(LGA)单一单元；因此形成多个LGA单元。因此，1个PEI分子与109个LGA单一 单元偶联。B.PLGA-PEI/DNA小颗粒。PLGA-PEI共聚物的分子量约为37kDa;而5kbp质粒DNA是 约3300kDa。对于35yg PLGA-PEI/10yg DNA NP，10yg DNA具有 1.82X1012个DNA分子；而35yg PLGA-PEI具有5.69 X1014个分子。因此，PLGA-PEI与DNA的分子比是313。如果1个DNA分子和 313个PLGA-PEI分子形成NP，其重量是2.468X10- 17g。假设NP的密度是lg/cm3,其体积则是 2.468 X l(T17cm3(或24680nm3)，对应于36nm的颗粒直径。因此，对于尺寸为约36nm的NP，其可 包含 1 个质粒DNA分子。C.PLGA-PEI/DNA的大颗粒。对于25yg PLGA-PEI/10yg DNA NP，PLGA-PEI共聚物与DNA的分子比是223。通过相同方法，估计1个DNA分子和223个PLGA-PEI共聚物 的体积是1.918父10- 17〇113(或19180111113)。这些即的尺寸是约10011111，对应于29452411111 3的体 积。该颗粒可包含约15个DNA分子和3345个PLGA-PEI共聚物。
[0036]图13显示XIST在女性胰腺癌组织和细胞系中的表达，基于实时PCR分析。A.XIST在 来自8名女性患者的手术胰腺癌组织及其周围非癌组织中的表达。B. XIST在5名女性的胰腺 癌细胞系以5?(：-1、81?(：-3、？311(3〇3.27、即4(：和31]86.86)和3名女性的对照细胞(包括即0￡永 生人胰腺管上皮细胞）、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)和AoSMC(人主动脉平滑肌细胞）中的表 达。
[0037]图14显示XIST(2.6kb)的强行表达对ASPC-1细胞的细胞增殖、细胞周期和肿瘤生 长的影响。A .XIST通过充足腺病毒基因递送在ASPC-1细胞中的强行表达(实时PCR) 3.细胞 增殖的MTS试验。C.细胞周期分析(流式细胞术）』.裸小鼠中的皮下肿瘤异种移植。
[0038]图15显示系列XIST截短突变克隆和功能分析（MTT)。原始XIST同种型克隆 (AK054860，2.659kb，克隆1)被亚克隆进入临床批准的质粒载体pUVMC3中的三个截短的区 段（克隆2、3和4)。采用PLGA-PEI纳米颗粒，各克隆被转染进入ASPC-1 (女性）（图15A)和 PANC-1 (男性）（图15B)细胞系。在0、1、2、3和4天检测MTLXIST克隆3(XIST486)是最短的功 能结构域。
[0039]前述内容相当宽泛地描述了本
【发明内容】
的特征和技术优点，使得能够更好地理解 以下的详细说明。以下描述的本发明的其他特征和优点构成本发明要求保护的主题。本领 域的技术人员应理解，所揭示的观念和【具体实施方式】可以方便地被用作改进或设计实现本 发明的同样目的的其他结构的基础。本领域的技术人员还应认识到这种等价结构没有偏离 所附权利要求书中提出的本发明的精神和范围。被认为是本发明的特征的新特征，对于其 构建和方法的操作，还有其他对象和优点等，可以结合以下详细的说明和附图一起，得到更 好的理解。但应理解，各附图仅仅是为了示意和说明，并不旨在对本发明进行限定。
[0040] 发明详述
[0041]本文说明书中所用的"一个"或"一种"可指一个/种或多个/种。如本文中权利要求 中所用，当于词语"包含"联用时，该词"一种"或"一个"可指一种/个或多于一种/个。本文中 所用的"另一种/个"可指至少第二种/个或更多种/个。在特定实施方式中，本发明的方面可 "基本由"或"由"例如本发明的一种或多种要素或步骤"组成"。本发明的一些实施方式可能 由一个或多个本发明的要素、方法步骤和/或方法组成或基本由其组成。考虑到本文所述的 任意方法或组合物可相对于本文所述的任意其他方法或组合物实施。
[0042] 一般实施方式
[0043]本发明对至少医疗领域中的技术提供改善，所述领域包括一种或多种治疗和/或 诊断组合物的递送。在特定实施方式中，该系统利用聚(交酯_共聚-乙交酯）(PLGA)、聚乙烯 亚胺(PEI)、APMP(l-(3_氨基丙基)_4_甲基哌嗪），并且，可包括另一种组分。该其它组分，并 且，在至少一些情况中，该组分是抗体。在【具体实施方式】中，该组分是是Fc-结合肽。
[0044]本领域中，基于聚(交酯_共聚-乙交酯）（PLGA)的纳米颗粒荷载和递送核酸(例如 DNA和RNA)的效率极低，这是因为PLGA的化学性质。脂质体和聚乙烯亚胺(PEI)可用于体外 和体内递送核酸(例如DNA和RNA)。然而，该递送系统的效率有限，毒性高;且制备过程复杂。 本发明的实施方式采用至少PLGA和PE I来实现有效和有用的系统。PLGA修饰的PE I包括如下 具体优势：1)体外和体内高效率荷载和递送核酸;2)宽范围的荷载和递送试剂;3)低毒性； 4)自组装和容易的制备过程;5)结合至特异性抗体用于特异性递送;和6)广泛体外和体内 应用(动物和人应用）。
[0045]用于公开的纳米技术的方法经优化和表征，包括PLGA和PEI之间的化学反应和机 理，质粒DNA和修饰的PLGA-PEI之间的相互作用，以及纳米颗粒的尺寸和形貌。该纳米技术 的DNA荷载、转染效率和细胞毒性经表征并与现有技术(包括lipofectamine 2000和PEI)在 细胞培养物中做了仔细比较。该纳米技术作为DNA递送系统在所有这些关键检测中均显示 较好结果。此外，在小鼠模型中研究了该技术的DNA递送和毒性，并与PEI递送系统做比较。 相较于PEI递送系统，本文公开的纳米技术显示在主要器官包括至少肝、脾和胰腺中的较高 的递送效率，并且其在小鼠中具有低得多的毒性。更重要地，发明人已总结了采用该技术在 人胰腺癌的裸小鼠模型递送示例性的治疗miRNA构建体的研究。该纳米技术与治疗性miR-198的腹膜内和尾静脉递送途径均显著地抑制小鼠中肿瘤生长。
[0046]在特定实施方式中，本发明的主题提供PLGA-PEI聚合物的一步法制备，例如，包括 易于工业生产的那些。在具体情况中，示例性的PLGA-PEI聚合物来自例如，w/w比为0.5:1、 1:1、2:1和5:1的PLGA和PEI。在【具体实施方式】中，PLGA含量越高，毒性越低，但DNA转染越低 (尽管这样可能适于递送除DNA外的其它试剂）。特定比率允许高DNA转染和材料低毒性之间 的合适平衡。
[0047]在某些实施方式中，存在低PLGA浓度，从而PLGA-PEI (0.5:1的w/w)是水溶性材料， 而这显著降低了 PEI的细胞毒性。然而，在一些情况中低PLGA浓度可能是合适的。
[0048] 在具体情况中，提供PLGA-PEI的PEI和伯胺浓度，从而提供对于具体的PLGA-PEI聚 合物的结构的计算。
[0049] 本发明的实施方式允许容易地一步法制备PLGA-PEI/DNA纳米颗粒，自组装，不采 用有机溶剂或特殊介质，和/或不采用除了水或介质中的PLGA-PEI和DNA以外的其它添加 剂。所述制备允许简易的大规模生产。
[0050] 本发明的纳米颗粒在水或介质中稳定，从而在至少具体的实施方式中，许多天仍 无聚集物。所述DNA分子(作为试剂的示例)在所述纳米颗粒中是稳定的。在一些情况中，该 试剂完全包被在纳米颗粒中，而在其它情况中，该试剂不完全包被在纳米颗粒中。该试剂可 部分包被在所述纳米颗粒中。在特定实施方式中，纳米颗粒允许缓慢释放长达2周供于细胞 转染。在本发明的方面中，PLGA-PEI/DNA是在体外和体内具有低毒性和高转染的高效系统。 [00511本发明的PLGA-PEI实施方式优于PEI且具有较低毒性和较好转染。本发明的示例 性实施方式采用PLGA-PEI以向小鼠递送GFP质粒(仅举例而言），导致GFP在肝、脾和胰腺中 的表达。相较于标准PEI/DNA递送系统，PLGA-PEI系统得到改善。其它示例性的实施方式证 明，向肿瘤递送RFP DNA，导致肿瘤中的RFP表达。在其它示例性的实施方式中，发明人递送 了示例性的治疗基因至胰腺癌，其抑制了肿瘤生长，甚至缩小了已生长肿瘤的尺寸。
[0052]本文所述的纳米技术具有许多创新方面，包括与PLGA和PEI之间的化学反应相关 的方法和组合物;对于带有DNA荷载的PLGA修饰的PEI自组装纳米颗粒形成的有用的条件和 确认；以及体外和体内DNA递送效率和低毒性。本发明纳米技术可用于科学研究和临床实践 应用，作为高效且安全的递送系统，供于一种或多种基因或药物或其它治疗剂。
[0053] 本文所述的纳米技术包括1-(3_氨基丙基)-4_甲基哌嗪(APMP)修饰的PLGA-PEI， APMP-PLGA-PEI的合成。APMP是已被用于共价修饰其它聚合物材料用于增强聚合物材料的 生物相容性和生物降解性质的小分子。在具体的方面中，APMP与PLGA-PEI共聚物的偶联增 强了其转染效率。
[0054]抗体偶联物的PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI的合成也涵盖在本发明中，包括所得的 偶联物组合物。抗体可直接偶联至PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI，例如通过双功能聚乙二醇 (马来酰亚胺-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺），Mal-PEG-NHS。抗体-PLGA-PEI或抗体-APMP-PLGA-PEI可用于特异性递送。另一方面，源自蛋白G或蛋白A的Fc结合肽可首先通过Mal-PEG-NHS 偶联至PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI，以制备通用抗体衔接子。Fc结合肽-PLGA-PEI或Fc结合 肽-APMP-PLGA-PEI可结合至任何特异性抗体，供于特异性递送。可采用HS-PEG-NHS，将抗体 通过S-S键偶联至分子。
[0055] 表1 .FDA批准的基于抗体的治疗**
[0059] *被赞助商撤回
[0060] **http://www?免疫 logylink.com/FDA-APP_Abs.html(访问日期2013年8月9 日； 参见免疫学链接网站）
[0061 ] 表2 ?嵌合单克隆抗体(〃-xi_〃)**
[0065] **http://www?免疫 logylink.com/FDA-APP_Abs.html(访问日期2013年8月9 日； 参见免疫学连接网站）
[0066]治疗剂或其它试剂
[0067]在本发明的实施方式中，所述纳米技术递送系统允许递送一种或多种治疗剂或其 它试剂(包括，例如，诊断剂)至对该试剂有需要的个体。在具体情况中，所述系统允许递送 多于一种试剂，并且所述多种试剂可以是或不是相同类型的试剂（例如，核酸或药物）。因 此，在许多纳米颗粒中，可以存在带有多于一种试剂的纳米颗粒的混合物，但其中各分开的 纳米颗粒仅具有一种试剂;可向所述个体给予治疗有效量的该试剂。在一些实施方式中，存 在带有多于一种试剂的纳米颗粒的混合物，但其中特定纳米颗粒具有多于一种试剂。在任 何情况中，可向所述个体提供治疗有效量的该试剂。
[0068] 该试剂可以是任何种类，只要PLGA-PEI纳米颗粒能稳定包含该试剂即可。在特定 实施方式中，该试剂可与DNA相互作用。在特定情况中，该试剂是核酸、小分子、蛋白质、肽或 其混合物中的一种或多种。该试剂可以是药物。具体的核酸示例包括寡核苷酸、miRNA、 8111?祖、811?祖、0嫩、1?嫩、1111?祖、〇0嫩、双链核酸、单链核酸等。核酸的尺寸可以如大质粒一般 大，或如小寡核苷酸一般小，此处仅作示例。在一些情况中，所述DNA是包含表达构建体的载 体，所述表达构建体用于表达一种或多种治疗性多核苷酸或编码治疗基因产物的一种或多 种多核苷酸。
[0069] 在一些实施方式中，所述治疗基因产物是实体，其降低至少部分(若非全部)癌基 因的表达。癌基因的示例包括Trop2、ZIP4、间皮素、亲环素六、11111?-1963、11111?-363，并且该试 剂可部分或全部地降低这些基因中一种或多种的表达。该试剂的示例可以是反义RNA、 miRNA寡聚物或shRNA，用于沉默基因。在其它情况中，该试剂靶向肿瘤抑制基因，并且该试 剂增加肿瘤抑制基因的表达。肿瘤抑制剂的示例包括XIST、Jade-2或miR-198。
[0070] 具体的小分子可包括用作医学病症的药物的那些。关于小分子药物递送，可采用 PLGA-PEI/DNA纳米颗粒来递送用于小分子(例如药物）的载剂，用于化疗和其它目的。可采 用亲水性药物和/或疏水性小分子药物，并且所述小分子药物可与纳米颗粒的DNA和/或PEI 部分直接相互作用，用于药物递送。结构中包含氨基基团的药物通常是带正电的，其可与带 负电的DNA分子相互作用。其结构中包含-C00H、-POf或其它酸性基团的药物可与所述纳米 颗粒的PEI部分中的氨基基团相互作用。核苷类似物药物也可用PLGA-PEI/DNA纳米颗粒荷 载。基于化学结构，PLGA-PEI/DNA纳米颗粒对于许多药物而言是高效的递送系统，至少包括 吉西他滨、AraC、PALA、长春新碱、甲氨蝶呤、长春花碱、紫杉醇、长春瑞滨、拓扑替康、顺铂、 阿霉素、正定霉素等。
[0071] 最重要地，可采用PLGA-PEI、APMP-PLGA-PEI或抗体-PEG-PLGA-PEI (作为示例）以 递送基因和化疗药物，用于基因治疗和化疗的联合。PLGA-PEI易于与DNA形成纳米颗粒，并 且许多小分子药物可与PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的DNA或PEI部分相互作用，以形成复合物。 因此，DNA和药物可同时被递送至同一位置，供于联合治疗。简言之，可将PLGA-PEI、小分子 药物和待递送的基因以所需比率混合在一起，以制备纳米颗粒。
[0072]在某些实施方式中，所述试剂是蛋白质或肽。所述蛋白质或肽可以是治疗和/或诊 断性的。在一些情况中，蛋白质是对于该蛋白质的递送目标个体而言天然内源性的蛋白质， 但内源性水平是缺乏的或天然不足的，或其高于天然水平的存在或丰度是有益的。蛋白质 或肽可通过衔接子肽-PEG-PLGA-PEI递送（图1C)。衔接子肽的序列可以是 CGGG⑶CAWHLGELVWCTGGGGC(SEQ ID NO: 1)，两侧均以胱氨酸结束。一侧偶联至PEG-PLGA-PEI，而另一侧用于与递送蛋白或肽中的胱氨酸通过S-S键偶联，该S-S键由胱氨酸的硫氢基 (-SH)基团的氧化形成。氧化剂，例如过氧化氢、碘，在碱或若干金属（包括铜（II)和铁 (III))复合物的存在下，可用于制备。一旦所述蛋白质或肽通过二硫键偶联至PLGA-PEI，所 述纳米颗粒可被制备以带有功能性或非功能性DNA。当所述纳米颗粒通过内吞被递送进入 细胞时，溶酶体酶能切断二硫键从而释放所述蛋白质或肽至胞液或核，供于其功能 ((]〇11;[118等，1991;厶1'1111&。11&1&1]1等，2000)。
[0073] 在其它实施方式中，任何氨基酸可通过酰胺键偶联至分子一PLGA-PEI，尽管该反 应将需要活化。例如，在特定情况中，如果所述肽的C-末端被酯化，那么所述肽能够通过酰 胺键直接偶联至PEI (带有游离-NH2)。
[0074] 所述纳米颗粒中所用的该试剂可能有利于任何种类的医学病症。在特定实施方式 中，该医学病症是癌，例如脑、肺、乳腺、前列腺、胰腺、肾、结肠直肠、血液、骨、胃、脾、胆囊、 睾丸、卵巢、宫颈、垂体、甲状腺、皮肤等的癌。在一些实施方式中，待治疗的医学病症是由病 原体(包括细菌、病毒、真菌等)所致的感染。所述医学病症可以是损伤或创伤。其它治疗剂， 包括镇痛剂、利尿剂、糖尿病药物、酸回流药物、高血压药物、甲状腺素、高胆固醇药物等。所 述医学病症可以是心脏病、肾病、中风、呼吸道疾病、败血症等。
[0075] 也可采用非治疗性的其它试剂。在一些情况中，可采用所述纳米技术来递送一种 或多种诊断剂。所述试剂可带有标记物，例如，允许其在个体身体中被追踪到的标记物。在 特定实施方式中，可用荧光微球和纳米颗粒来成像。示例性的标记物和颜色包括蓝色、绿 色、橙色、红色和近红外。
[0076] 在一些实施方式中，贯穿全身系统性地使用所述试剂，尽管在特定情况中，所述试 剂待施于身体的局部。
[0077] 除人疾病以外，所述纳米颗粒递送系统也可用于，例如，治疗动物疾病，和微生物 研究、细胞培养和动物模型。
[0078] PLGA-PEI复合物的递送
[0079]本发明的纳米技术PLGA-PEI复合物的实施方式可以多种合适的方式递送至需要 其的个体。在特定实施方式中，所述复合物可通过如下方式递送:静脉内、皮内、透皮、鞘内、 动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肌内、皮下、粘膜、经口、局部(topically)、局 部性（local ly )、吸入(例如，气溶胶吸入）、注射、输注、连续输注、局部灌注直接冲洗靶细 胞，通过导管，通过灌洗，以乳膏、以脂质组合物形式(例如，脂质体)或通过本领域普通技术 人员已知的其它方法或前述方式的任何组合。
[0080]在至少具体的情况中，包括微生物和特异性抗原的疫苗可通过所述PLGA-PEI纳米 技术递送。疫苗的示例包括用于癌或感染(例如微生物感染）的那些。疫苗的示例包括活疫 苗、减毒疫苗;失活疫苗;亚基疫苗;类毒素疫苗;偶联疫苗;DNA疫苗;和重组载体疫苗。疫苗 的示例包括针对任何种类的肝炎、轮状病毒、DTaP、HIB、脊髓灰质炎、MMR等的疫苗。
[0081]给予动物或患者的本发明的组合物的实际剂量可根据物理和生理因素确定，例如 体重、病症严重程度、待治疗的疾病类型、先前或同期治疗干预、患者的特发病和给予途径。 取决于剂量和给予途径，优选剂量和/或有效量的给予次数可根据对象的响应而不同。在任 何事件中，负责给予的医师将确定组合物中活性成分的浓度，以及对于个体对象合适的剂 量。
[0082] 组合治疗
[0083] 在本发明的某些实施方式中，除了其本身包含治疗试剂的PLGA-PEI纳米颗粒以 外，还可向个体提供一种或多种医药治疗。所述一种或多种其它医药治疗可适于癌症治疗、 细菌或病毒感染、遗传疾病或任何其它种类的医学状况。
[0084] 在特定实施方式中，该联合治疗包含一种或多种抗癌试剂。"抗癌"试剂能对对象 的癌症产生不利影响，例如通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低 转移的发生率或数量、降低肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供给、促 进对癌细胞或肿瘤的免疫应答、阻止或抑制癌症发展、或延长患癌对象的寿命。更一般地， 这些其他组合物会以有效杀死或抑制细胞增殖的组合量提供。该方法可涉及使所述细胞与 所述纳米颗粒和所述试剂或多种因子同时接触。这可通过使所述细胞与包括两种试剂的单 一组合物或药物制剂接触，或通过使所述细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实 现，其中一种组合物包含所述纳米颗粒且另一种包含第二试剂。
[0085] 在本
【发明内容】
中，设想所述纳米颗粒治疗可类似地与，例如，化疗、放疗或免疫治 疗介入联用。或者，所述纳米颗粒治疗可以数分钟至数周的间隔先于或晚于其它试剂使用。 在其中其它试剂与纳米颗粒分开施予细胞的实施方式中，一般会确保在每次递送的期间不 会显著超时，从而所述试剂和表达构建体仍能够有利地对细胞发挥联合作用。在这类情况 中，考虑可将细胞与两种方式接触，互相间隔在约12-24小时内，并且更优选互相间隔在约 6-12小时内。然而在一些情况中，可能需要显著延长治疗时间，其中各给药之间间隔数天 (2、3、4、5、6或 7)到数周（1、2、3、4、5、6、7或 8)。
[0086] 可采用多种联合方式，例如其中纳米颗粒治疗是"A"且第二试剂，例如放疗或化疗 剂，是"B"：
[0087] A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[0088] 在一些情况中，本发明的治疗性纳米颗粒对患者的给予将在给予化疗剂的一般方 案之后进行。预期所述治疗循环在需要时重复。还预期各种标准治疗法以及外科手术介入 可与所述的过度增殖性纳米颗粒疗法联用。本发明具有对于动物疾病的类似临床应用。
[0089] 化疗
[0090] 癌症疗法可包括多种同时有基于化学物和放射的治疗的组合疗法。组合化疗包括 例如，顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮 芥、白消安、亚硝基脲(nitrosurea)、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝 裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合试剂、紫杉醇、吉西他滨、诺 维本、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反钼（transplatinum)、5-氟尿啼啶、长春新碱、长春碱和 甲氨蝶呤、或上述任何类似物或衍生变体。
[0091] 放疗
[0092]造成DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常称为y射线、X射线和/或将放射 性同位素直接递送给肿瘤细胞。也考虑其它形式的DNA破坏因素，如微波和紫外辐射。所有 这些因素很有可能会对DNA、DNA前体、DNA复制和修复、染色体装配和维持造成较宽范围的 损伤。X-射线的剂量范围从延长期间（3至4周）50至200伦琴的每天剂量到2000至6000伦琴 的单次剂量。放射性同位素的剂量范围差异很大，取决于所述同位素的半衰期、发射辐射的 强度和类型、以及肿瘤细胞的摄入。
[0093]本文所用术语"接触"和"暴露"用于细胞时，描述治疗构建体和化疗或放疗试剂递 送给靶细胞或放置成与所述靶细胞直接并置所用的方法。为了实现细胞杀死或静止，以有 效杀死所述细胞或阻止其分裂的结合量将两种试剂递送给细胞。
[0094] 免疫治疗
[0095] -般免疫治疗法依赖于使用免疫效应细胞和分子靶向并破坏癌细胞。免疫效应物 可为例如对肿瘤细胞表面的一些标记特异的抗体。抗体本身可用作治疗效应物或其可招募 其他细胞以实际影响细胞杀死。抗体也可与药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A 链、霍乱毒素、百日咳毒素等)偶联并且仅用作靶向剂。替代地，所述效应物可为携带表面分 子的淋巴细胞，所述分子直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用。各种效应细胞包括细胞毒 性T细胞和NK细胞。
[0096]因此，免疫治疗可用作组合治疗的部分，与Ad_mda7基因治疗联用。组合疗法的一 般方法如下所述。一般而言，肿瘤细胞必须携带一些易于靶向的标记物，即，不存在于大多 数其它细胞上。存在许多肿瘤标记物并且这些标记物中的任一种适用于在本发明的内容中 靶向。常见的肿瘤标记物包括癌胚抗原、前列腺特异抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪 氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化Lewi s抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘 连蛋白受体、048和口155。
[0097] 基因疗法
[0098] 在另一个实施方式中，第二治疗是第二基因治疗，其中第二治疗性多核苷酸在编 码治疗性多肽的部分或全部的第一治疗性多核苷酸给予之前、之后或同时给予，或其中所 述多核苷酸本身具有治疗性(例如1^1?嫩、811?嫩、8111?^)。编码全长或截短的治疗性多肽或 治疗性多核苷酸的载体与本发明纳米颗粒的递送将对目标组织具有联合的抗过度增殖作 用。
[0099] 外科手术
[0100] 约60%的癌症患者会经历一些类型的外科手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈 性和缓解性外科手术。治愈性外科手术是可与其他治疗法联用的癌症治疗，所述治疗法如 本发明的治疗、化疗、放疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或其他治疗。
[0101] 治愈性外科手术包括切除术，其中所有或部分癌组织被物理移除、切割和/或破 坏。肿瘤切除是指物理去除至少部分肿瘤。除了肿瘤切除术，外科手术治疗包括激光手术、 冷冻手术、电外科手术和显微镜控制手术(莫氏(Mohs)手术）。还预期本发明可与浅表性癌、 初癌或附带量的正常组织移除联用。
[0102] 所有癌细胞、组织或肿瘤的部分切割后，可在体内形成空腔。治疗可通过灌注、直 接注射或局部区域应用其他抗癌治疗来实现。该治疗可例如每1、2、3、4、5、6或7天或每1、2、 3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复。这些治疗也可用不同的剂量。 [0103]其他试剂
[0104]设想其它试剂可与本发明联用以提高治疗的治疗效率。这些其他试剂包括免疫调 节剂、影响细胞表面受体和GAP连接上调的试剂、细胞抑制和分化试剂、细胞粘附抑制剂、或 增加所述过度增殖性细胞对凋亡诱导物的敏感性的试剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子； 干扰素a、f3和y ;IL-2和其他细胞因子;F42K和其他细胞因子类似物;或MIP-l、MIP-lf3、MCP-l 、 RANTES 和其他趋化因子 。还考虑细胞表面受体或其配体如 Fas/Fas 配体、 DR4 或 DR5/TRAIL 的上调将通过对过度增殖细胞建立自分泌或旁分泌作用来增强本发明的凋亡诱导能力。通 过提高GAP接头的数量将提高对相邻过度增殖细胞群的抗-过度增殖作用。在其他实施方式 中，细胞抑制或分化试剂可与本发明联用以改进所述治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞粘 附抑制剂来改善本发明的效力。细胞粘附抑制剂的例子为粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐 他汀。还可考虑增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其它药剂(如抗体c225)与本发明联用 以提尚治疗效力。
[0105] 激素治疗也可与本发明联用，或与先前所述的任何其癌症治疗联用。所述激素的 应用可在某些癌症如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌的治疗中采用以降低某些激素如 睾丸激素或雌激素的水平或阻碍其效应。该治疗通常与至少一种其它癌治疗联用作为治疗 选项或用于降低转移风险。
[0106] 本发明的试剂盒
[0107] 本文所述的任意组合物可包含于试剂盒中。在一个非限制性示例中，试剂盒中可 包含?1^^、？￡1^?10\?(：结合肽和/或一种或多种治疗剂或其它试剂。也可包括用于将该纳 米颗粒偶联至另一种化合物的任何接头。所述试剂盒将在合适的容器器具中包含其组分。 所述组分可被合适地分装。所述试剂盒的组分可在水性介质中或以冻干形式包装。这些试 剂盒的容器用具通常包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器用具，其中该组 分可放置，并优选适当分装于其中。在试剂盒中存在超过一种组分的情况中，该试剂盒通常 还含有第二、第三或其他容器，其中可分开放置其他组分。然而，可在容器中包含组分的各 种组合。本发明的试剂盒通常还包含用于市售的封闭约束形式含有该组分容器的器具。此 类容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其中保留所需小瓶。
[0108] 当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液可以是水性溶液， 无菌水性溶液是特别优选的。可将所述组合物配制成可注射的组合物。在该情况中，容器用 具本身可以是注射器、移液器和/或其他这类设备，从中可将制剂施用于身体的受感染区 域、注射到动物中和/或甚至用于和/或与试剂盒的其他组分混合。
[0109] 然而，试剂盒的组分可以干粉形式提供。当以干粉提供试剂和/或组分时，可通过 加入合适的溶剂来重建粉末。设想也可用另一种容器用具提供溶剂。
[0110] 不论容器的数量和/或类型，本发明的试剂盒还可包含，和/或包装有，用于协助注 射/给予和/或将最终组合物置于动物身体中的器具。所述器具可以是注射器、移液管、钳 子，和/或任何此类医疗上批准的递送载体。
[0111] 药物制剂
[0112] 本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种组合物，其在一些实施方式中被溶 解或分散于药学上可接受的载体中。本发明的实施方式包括将药物(或任何治疗和/或诊断 剂）封装进入微球和纳米颗粒、微乳液（例如，以递送不溶性活性药物成分(API)或油性 API)、纳米颗粒(表面修饰，例如，被覆和偶联），及其给予(例如，经口、舌下、可注射、皮下、 吸入和/或局部）。在特定实施方式中，药物制剂包括药物(或任何治疗和/或诊断剂)的控释 和缓释。
[0113] 词组"药学或药理学上可接受的"指分子实体和组合物在恰当地给予动物，例如人 时不产生不利、过敏性或其它不良反应。根据本发明，含有至少一种组合物或其他活性成分 的药物组合物的制备为本领域技术人员已知，如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿药物科学与实践》），第21版，LWW出版社(Lippincott Williams and Wilkins)，2005所例示，其通过引用纳入本文。另外，就动物(如人)给药而言，理解制备应该 满足由FDA官方生物学标准要求的无菌性、致热原性、常规安全和纯度标准。
[0114] 本文使用的"药学上可接受载体"包含任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性 剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂）、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物 稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、诸如此类的物质和其 组合，此应为本领域普通技术人员已知（参见，例如，Remington ' s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》），马克出版公司（Mack Printing Company)，1990,第1289-1329页，通过引用纳入本文）。除非任何常规载体都与活性成分不相容，否则应考虑在药物 组合物中使用这些载体。
[0115] 所述组合物可以包含不同类型载体，这取决于其是否以固体、液体或气溶胶形式 给药和是否需要无菌用于所述给药途径如注射。本发明可通过如下方式递送:静脉内、皮 内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肌内、皮下、粘膜、经□、局部 (topica 11 y)、局部性(1 oca 11 y)、吸入(例如，气溶胶吸入）、注射、输注、连续输注、局部灌注 直接冲洗靶细胞，通过导管，通过灌洗，以乳膏、以脂质组合物形式(例如，脂质体)或通过本 领域普通技术人员已知的其它方法或前述方式的任何组合(参见，例如，《雷明顿药物科学》 (Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版?马克出版公司，1990,其通过引用纳入 本文）。
[0116] 所述组合物可以配制在游离碱、中性或盐形式的组合物中。药学上可接受的盐包 括例如酸加成盐（用蛋白质组合物的游离氨基基团形成的那些），或其用无机酸(例如盐酸 或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸)形成。用游离羧基形成的盐还可源自无 机碱例如钠、钾、铵、钙、或铁的氢氧化物;或有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因。 配置后，溶液可以能够与剂量配方相容的方式和有效的量给予。所述制剂易于在多种剂型 中给予，例如配制用于胃肠外给予，例如可注射溶液或用于递送至肺的气溶胶，或配制用于 经消化道给予，例如药物释放胶囊等。
[0117] 进一步根据本发明，适于给予的本发明组合物在药学上可接受的载体中提供，采 用或不采用惰性稀释剂。所述载体应可被同化，并且包括液体、半固体，即糊状或固体载体。 除非任何传统介质、试剂、稀释剂或载体均对受者或对其中包含的组合物的治疗效果有害， 否则其适用于可给予的组合物中供于本发明方法的实践。载体或稀释剂的示例包括脂肪、 油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填料等或其组合。所述组合物还可包含多种 抗氧化剂以延迟一种或多种组分的氧化。此外，可采用防腐剂来防止微生物作用，所述防腐 剂例如多种抗细菌和抗真菌试剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲 酯、对羟基苯甲酸丙酯）、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
[0118] 根据本发明，所述组合物以任何方便且实用的方式与载体联用，即，通过溶液、悬 液、乳化、掺混物、包封、吸收等。此类方法对本领域技术人员而言是常规的。
[0119] 在本发明的特定实施方式中，所述组合物与半固体或固体载体完全合并或混合。 所述混合可以任何方便的方式(例如研磨）进行。还可向混合过程添加稳定剂，以保护所述 组合物不在胃中损失治疗活性，即，变性。用于所述组合物的稳定剂的示例包括:缓冲剂、氨 基酸例如甘氨酸和赖氨酸、碳水化合物例如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽 糖、山梨醇、甘露醇等。
[0120] 在其它实施方式中，本发明可涉及采用包含所述组合物、一种或多种脂质以及水 性溶剂的药物脂质载体组合物。本文中所用的术语"脂质"定义为包括特点为水不溶性和可 由有机溶剂萃取的任何宽范围的物质。该宽范围的化合物是本领域技术人员熟知的，并且 本文中所用的术语"脂质"不限于任何具体结构。示例包括含有长链脂族烃的化合物及其衍 生物。脂质可天然产生或是合成的（即，经人工设计或生成）。然而，脂质通常是生物物质。生 物脂质是本领域熟知的，并且包括例如，中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、固醇、萜、溶血脂质、 鞘糖脂、糖脂、硫酯、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合的脂质，及其组合。当然，除 了本文具体描述的那些以外的，被本领域技术人员视作脂质的化合物也涵盖在本发明的组 合物和方法中。
[0121] 本领域普通技术人员熟悉可用于将组合物分散于脂质载体中的技术范围。例如， 所述组合物可分散于包含脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质合 并，共价结合至脂质，以悬液形式包含在脂质中，与胶束或脂质体包含或复合，或在其它情 况下通过本领域普通技术人员已知的任何方式与脂质或脂质结构相关联。所述分散体可导 致或可不导致脂质体的形成。
[0122] 给予动物患者的本发明的组合物的实际剂量可根据物理和生理因素确定，例如体 重、病症严重程度、待治疗的疾病类型、先前或同期治疗干预、患者的特发病和给予途径。取 决于剂量和给予途径，优选剂量和/或有效量的给予次数可根据对象的响应而不同。在任何 事件中，负责给予的医师将确定组合物中活性成分的浓度，以及对于个体对象合适的剂量。
[0123] 在某些实施方式中，药物组合物可包含，例如，至少约0.1 %的活性化合物。在其它 实施方式中，所述活性化合物可包含约2 % -约75 %的单元重量或例如，约25 % -约60 %，以 及从中衍生的任何范围。自然地，各治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以这样的方 式制备:在任何给定单位剂量的化合物中将获得合适的剂量。多种因素，例如溶解性、生物 利用度、生物半衰期、给药途径、产品保质期，以及其它药学上的考量将油制备所述药物制 剂的本领域技术人员考虑，并且由此，优选有多种剂量和治疗方案。
[0124] 在其它非限制性示例中，每次给予的剂量还可包含约1微克/kg/体重，约5微克/ kg/体重，约10微克/kg/体重，约50微克/kg/体重，约100微克/kg/体重，约200微克/kg/体 重，约350微克/kg/体重，约500微克/kg/体重，约1毫克/kg/体重，约5毫克/kg/体重，约10毫 克/kg/体重，约50毫克/kg/体重，约100毫克/kg/体重，约200毫克/kg/体重，约350毫克/kg/ 体重，约500毫克/kg/体重，至约1000毫克/kg/体重或更多，以及从中衍生的任何范围。在从 本文所列的数值衍生的范围的非限制示例中，基于上文所述的数字，可给予约5mg/kg/体 重-约100mg/kg/体重，约5微克/kg/体重-约500微克/kg/体重等。
[0125] A.营养组合物和制剂
[0126] 在本发明的优选实施方式中，配制所述组合物以通过消化道途径给予。营养途径 包括其中所述组合物直接接触消化道的所有可能的给予途径。具体地，本文公开的药物组 合物可经口、口腔、直肠或舌下给药。由此，这些组合物可与惰性稀释剂或可同化的食用型 载体配制，或其可包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或其可被压制成片剂，或其可与食物直接 纳入饮食。
[0127] 在某些实施方式中，所述活性化合物可纳入赋形剂，并以可消化的片剂、含片、药 片、胶囊、酏剂、悬液、糖衆、晶片等形式使用(Mathiowitz等，1997; Hwang等，1998;美国专利 号5,641，515;5,580,579和5,792,451，各自具体通过引用其全文纳入本文）。所述片剂、药 片、丸剂、胶囊等可包含如下组分:粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组 合;赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组 合;崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合;润滑剂，例如硬脂酸镁;甜味剂， 例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合;调味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂、橙调味剂等。当所 述剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料以外，它可以包含液体载体。可以存在各种 各样的其它材料作为包衣或者来改变所述剂型的外形。例如，片剂，丸剂或胶囊可用紫胶、 糖或两者同时被覆。当所述剂型是胶囊时，除了上述类型的材料以外，它可以包含载体如液 体载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可以经肠溶型被覆。肠溶性包衣防止组合物在pH为酸性的胃 或上肠道处变性。参见例如，美国专利号5，629，001。在到达小肠后，其中的碱性pH将包衣溶 解，并允许所述组合物被释放，并由特化细胞(例如，肠上皮细胞和派氏结(Peyer ' s patch) M细胞)吸收。酏剂糖浆可包含活性化合物蔗糖作为甜味剂，甲基和对羟基苯甲酸丙酯作为 防腐剂，染料和调味剂，例如樱桃或橘子风味。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应 是药学上纯的，且基于所用的量基本无毒性。此外，可将活性化合物纳入缓释制备物和制 剂。
[0128] 对于口服给予，本发明的组合物可替代性地纳入一种或多种赋形剂，其可具有漱 口液、牙膏、含片、□服糖浆或舌下□服给予的制剂的形式。例如，可制备漱□液以将所需量 的活性成分纳入合适的溶剂，例如硼酸钠溶液(朵贝尔氏溶液）。或者，可将活性成分纳入口 服溶液，例如包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的口服溶液，或分散于牙膏，或以治疗有效量添 加至可包含水、粘合剂、研磨剂、调味剂、发泡剂和致湿剂的组合物。或者，所述组合物可制 成置于舌下或在其它情况中溶解于口中的片剂或溶液形式。
[0129] 适于其它模式的消化道给予的其它制剂包括栓剂。栓剂是具有多种重量和外形的 固体剂型，通常为插入直肠用药。插入后，栓剂在腔液中变软、熔化或溶解。一般而言，对于 栓剂，传统载体可包括，例如，聚二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方式中，栓剂可以从 混合物形成，包含例如活性成分范围约0.5 % -约10 %，且优选约1 % -约2 %的。
[0130] 胃肠外组合物和制剂
[0131] 在其它实施方式中，所述组合物可通过胃肠外途径给予。本文中所用的术语"胃肠 外"包括绕过消化道的途径。具体地，本文公开的药物组合物可如下给予，例如但不限于，静 脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内，美国专利号6,613,308,5,466,468,5,543， 158; 5，641，515;和5，399，363(其各自具体通过引用其全文纳入本文）。
[0132] 活性化合物作为游离碱或药学上可接受的盐的溶液可在适于与表面活性剂(例如 羟丙基纤维素)混合的水中制备。分散体也可用甘油、液体聚乙二醇和它们在油中的混合物 制备。在常见的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。适于注射用途 的药品形式包括无菌水性溶液或者分散剂和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无 菌粉末(美国专利5,466,468，具体通过引用其全文纳入本文）。在所有情况下，剂型都必须 无菌，并应必须是易被注射的流体。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须在保存过程 中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含水、乙醇、多元醇（即甘油、丙 二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物以及植物油的溶剂和/或分散介质。例如可通过 使用涂层如卵磷脂、保持所需粒度(在分散液的情况中）以及使用表面活性剂，来维持合适 的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨 酸、硫柳汞等带来对微生物作用的阻碍。在很多情况中，优选包括等张剂，例如糖类或氯化 钠。可通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶用于组合物中来延长可注射组合物的 吸收。
[0133] 例如为了在溶液中胃肠外给药，若需要则所述溶液应经适当缓冲，并且用充分的 盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些具体水溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内 给药。就此而言，可用的无菌水性介质是本领域技术人员根据本公开内容已知的。例如，一 个剂量可溶于等渗溶液中，并加入皮下灌输液体中，或在输注的计划位置注射(参见例如 《雷明顿药物科学》第15版1035-1038和1570-1580页）。基于治疗患者的病症会需要对剂量 进行变化。负责给药的人在任何情况中均可确定个体对象的合适药量。此外，就人的给药而 言，制品应当满足FDA生物制品标准部(Office of Biologies standards)要求的无菌性、 致热原性、常规安全和纯度标准。
[0134] 通过将合适溶剂中所需量的活性化合物掺入不同的其它上述组分后过滤灭菌制 得无菌注射液。通常，将不同的无菌活性成分纳入含有碱性分散介质和上述其它所需成分 的无菌载体中制备分散液。当制备无菌注射液制备所需的无菌粉末时，优选的制备方法是 真空干燥和冷冻干燥技术，由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉 末。将粉末状的组合物与液体载体(例如，水或盐水溶液)合并，采用或不采用稳定剂。
[0135] 其它各种药物组合物和制剂
[0136] 在本发明的其它实施方式中，所述活性化合物可经配制用于通过多种其它途径给 予，例如，局部(即，透皮)给予、粘膜给予(鼻内、阴道内等)和/或吸入。
[0137] 用于局部给予的药物组合物可包括配制用于加药施用方式(例如，药膏、糊乳膏或 粉末)的活性化合物。药膏包括所有基于油质的、吸附、乳液和水溶性的组合物，用于局部应 用，而乳膏和洗液是仅包含乳液基的那些组合物。局部给予的药物可包含穿透增强剂，以促 进活性成分通过皮肤的吸附。合适的穿透增强剂包括甘油、醇、烷基甲基亚砜、啦咯烷酮和 月桂氮酮（luarocapram)。对于局部应用的组合物而言，可能的基底包括聚乙二醇、羊毛脂、 冷膏和矿脂，以及任何其它合适的吸收物、乳液或水溶性软膏基底。局部制剂还可包括保护 活性成分并提供均质混合物所必需的乳化剂、凝胶剂，和抗微生物防腐剂。本发明的透皮给 予还可包括"贴片"的应用。例如，所述贴片可在一段固定长度的时间内以连续方式和预定 速率给予一种或多种活性物质。
[0138] 在某些实施方式中，所述药物组合物可通过滴眼液、鼻内喷雾、吸入物，和/或其它 气溶胶递送载剂被递送。用于将组合物通过鼻部气溶胶喷雾直接递送至肺的方法已描述 于，例如，美国专利号5,756,353和5,804,212(其各自具体通过引用其全文纳入本文）。同样 地，使用鼻内微颗粒树脂(Takenaga等，1998)和溶血磷脂酰胆碱-甘油化合物(美国专利号 5,725,871，具体通过引用其全文纳入本文)的药物递送也是药学领域中熟知的。同样地，聚 四氟乙烯支持基质形式的经粘膜药物递送见述于美国专利号5,780,045(具体通过引用其 全文纳入本文）。
[0139] 术语气溶胶指的是，分散在液化或压气推进剂中的细分的液体颗粒的固体的胶体 系统。本发明的用于吸入的典型气溶胶将由活性成分在液体推进剂或液体推进剂和合适的 溶剂的混合物中的悬液组成。合适的推进剂包括烃类和烃醚。合适的容器将视推进剂的压 强需要而变化。气溶胶的给予将视患者年龄、体重和症状的严重程度和响应而变化。 实施例
[0140] 纳入下列实施例以显示本发明的优选实施方式。本领域的普通技术人员应理解， 根据代表本发明人所发现技术的实施例中公开的技术能很好地实施本发明，从而可将其视 为实施本发明的优选模式。但是，本领域技术人员根据本公开应理解，在不偏离本发明精神 和范围的前提下，可对所公开的【具体实施方式】进行许多变化，同时仍能获得相同或类似的 结果。
[0141] 实施例1
[0142] PLGA-PEI共聚物的制备
[0143] 聚（乳酸-共聚-乙醇酸）（PLGA)是食品和药物管理局(FDA)批准的材料，其用于治 疗装置和递送系统，因为其具有生物可降解性、生物相容性、低毒性和优越的药代动力学参 数。例如，PLGA作为药物递送纳米颗粒可避免被网状内皮系统消除，并在循环中长时间停 留。然而，PLGA荷载核酸的效率较低，归因于其化学性质。聚乙烯亚胺(PEI)可带负电的核酸 磷酸酯基团和带正电的PEI胺基团之间的静电相互作用有效地结合并凝缩核酸，并通过形 成纳米颗粒。PEI可通过胞吞将DNA递送进入细胞，并以pH依赖性的方式释放DNA(Utsuno和 1]111(^，2010;31111等，2011 ;31111等，2012)。支化的？￡1(251(0&)是最常用的转染试剂之一。然 而，PEI缺乏生物可降解部分，并且可造成高细胞毒性(Akinc等，2005;Moghimi等，2005)。 PEI的转染率也在不同类型的细胞中有所不同。PE I作为体内核酸递送系统的药代动力学参 数并不喜人。
[0144] 因此，将PLGA与PEI相结合能够产生新共聚物，其具有更好的利于核酸递送的性 质，包括高DNA荷载容量、有效DNA递送和释放至广泛的细胞类型、改善的药代动力学和低毒 性。相较于非可降解形式，PEI可降解形式具有显著改善转染效率和更低的细胞毒性(Green 等，2007;Forrest等，2003)。出于该目的，本文中描述一种用于产生新PLGA-PEI共聚物的新 方法，所述新PLGA-PEI共聚物具有用于递送试剂(例如核酸)的独特化学结构和性质。
[0145] PLGA-PEI共聚物通过在如下示例性条件下，将PLGA和PEr混合于有机溶剂而直接 制备。PLGA(12-16kDa，交酯：乙交酯50:50m 〇l/m〇l，固有粘度0.50-0.65)获自皮力赛斯公司 (Polysciences，Inc.)(宾夕法尼亚州沃灵顿）JEI，支化的，平均MW为约25kDa，和四氢咲喃 (THF)获自西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯）。通常地，将分别溶 解于10ml THF的250mg PEI和120mg PLGA在室温（23°C)温和搅拌下混合48小时。从THF溶液 分离软沉淀物并用THF溶剂清洗两次。然后，该固体在真空下室温干燥过夜。这制成共聚物 PLGA-PEI (w/w 0 ? 5/1)。分别以PLGA/PEI重量比0 ? 5:1、1:1、2 ? 5:1和5:1，对应摩尔比 1:1、2: 1、5:1和10:1，制备四种类型的PLGA-PEI共聚物。所述比率越高，共聚物在THF中的溶解性越 好，而在水中的溶解性越差。以重量比0.5:1采用PLGA和PEI的方案产生了含有平均约1个 PLGA分子/PEI分子的共聚物偶联物。对于共聚物PLGA-PEI( W/W 0.5/l)，PLGA-PEI共聚物偶 联物中的PEI浓度测定为64.7± 1.6% (通过硫酸铜试验(von Harpe等，2000)测定），且伯胺 浓度检测为49 ± 3 % (通过TNBS试验（Bui lock等，1997)检测）。对于PLGA-PEI (w/w 1:1)， PLGA-PEI共聚物偶联物中的PEI浓度测定为48.0±0.8%，而伯胺浓度检测为9.5 ± 2.1 %。 对于PLGA-PEI (w/w 2:1)和PLGA-PEI (w/w 5:1)，伯胺浓度分别测定为 11 ? 3 % 和8 ? 2 % (表 3)〇
[0147] 表3.不同PLGA-PEI制剂中的PEI浓度和伯胺百分数。PLGA和PEI的重量比为0.5:1 的方案产生含有平均约1个PLGA/PEI分子的偶联物。PLGA-PEI偶联物中的PE I浓度测定为 64.7±1.6% (采用硫酸铜试验），而伯胺浓度检测为49±3% (通过TNBS试验）。
[0148] 基于对PLGA-PEI新共聚物的重量比和伯胺的分析，能够确定其化学结构。各支化 的PEI分子(25kDa)具有约214个伯胺、159个仲胺和212个叔胺。而各PLGA分子（12~16kDa) 平均具有215(184-246)个酯键。基于PLGA和PEI的分子量和PLGA-PEI(0.5: lw/w)中的PEI浓 度(64.7±1.6%)，该?11^^^1(0.5:1￥/￥)聚合物中？￡1分子包含约1个起始?11^。其伯胺浓 度经检测为49±3%，表明一半的伯胺与PLGA通过进攻其酯键而发生反应，并导致酰胺的形 成（图1A)。起始PLGA分子通过PEI被片段化成为交酯-共聚-乙交酯单一单元，而PEI是完整 的；因此，约109个交酯-共聚-乙交酯单一单元通过酰胺键偶联至一个PEI分子。PLGA-PEI共 聚物的这一化学结构是先前未被确定的新材料。
[0149] 实施例2
[0150] APMP修饰的PLGA-PE I共聚物的制备
[0151] 1_(3_氨基丙基)_4_甲基哌嗪(APMP，阿法埃莎公司(Alfa Aesar)，马萨诸塞州沃 德希尔市)是小分子，其已被用于共价修饰其它聚合物材料用于增强聚合物材料的生物相 容性和生物降解性质（Bhise等，2010; Sunshine等，2012; Sunshine等，2012 ;Eltoukhy等， 2012; Sunshine等，2009;Lee等，2009)。然而，其尚未用于修饰PLGA或PEI以用于提高递送效 率。在本发明的方面中，APMP与PLGA-PEI共聚物的偶联增强了其转染效率。
[0152] APMP能通过接头直接偶联至PEI，并通过修饰其生物利用度、生物降解且降低其毒 性来增强PEI的转染。为了将APMP偶联至PEI，APMP首先与1，4-丁二醇二丙烯酸酯在DMS0中 反应2小时以制备1，4_丁二醇二丙烯酸酯-共聚-1-(3-氨基丙基)-4_甲基哌嗪，（Sunshine 等，2012)，其具有供于与PEI的伯胺在THF中反应24小时的酯键。因此，APMP通过短接头偶联 至PEI，形成新共聚物材料APMP-CH2CH2-共聚-PEKAPMP的含量基于最终偶联物中的所需的 摩尔比。在该材料中，APMP-CH2CH2-共聚-占据了小量的PE I的伯胺，因此，APMP - CH2 CH2-共 聚-PEI能够进一步以所需比率与PLGA在THF中反应48小时，以制备APMP-PLGA-PEI (图1B)。 从THF溶液分离软沉淀物并用THF溶剂清洗两次。然后，该固体在真空下室温干燥过夜。基于 Cu(II)法分析(von Harpe等，2000)测定PEI浓度，并且，通过TNBS试验(Bullock等，1997)检 测该修饰的PLGA-PEI中的伯胺。功能上，APMP-PLGA-PEI能够有效地荷载DNA并在水性溶液 中形成纳米颗粒。更重要地，APMP-PLGA-PEI更加有效地递送DNA进入细胞。基于该原理，可 采用若干其它化合物来修饰PLGA-PEI，包括2-(3-氨基丙基氨基）乙醇、2-甲基-1，5-二氨基 戊烷、1_(3_氨基丙基）吡咯烷、4-氨基苯基二硫化物和胱胺(Bhise等，2010; Sunshine等， 2012)。
[0153] 或者，还以如下顺序制备APMP修饰的PLGA-PEI共聚物(APMP-PLGA-PEI):先使APMP 和PLGA混合一天，然后与PEI在THF溶液中混合另两天。APMP具有伯胺，其可使PLGA氨基化 (aminolyze)，因此偶联至PLGA。当该APMP修饰的PLGA(聚酯）与PEI混合时，PEI中的伯胺将 进攻PLGA的酯键，因此，形成APMP修饰的PLGA-PEI。通常地，将分别溶解于5ml THF的20mg APMP和120mg PLGA在室温下以温和速率搅拌混合20小时。将该混合物添加至5ml THF中的 250mg支化的PEI，并室温搅拌48小时。从THF溶液分离软沉淀物并用THF溶剂清洗两次。然 后，该固体在真空下室温干燥过夜。基于Cu(II)法分析(von Harpe等，2000)测定PEI浓度为 约60%，并且，检测该修饰的PLGA-PEI中的伯胺是51.5±0.8% (Bullock等，1997)。因此，基 于该数据，约4%的4?]\^纳入?11^^^1。
[0154] 实施例3
[0155] 抗体-结合的PLGA-PEI共聚物的制备
[0156] 归因于其对靶标的高选择性、亲和性和变异性，抗体完全利用靶向部分用于特异 性药物递送(Arruebo等，2009 ;Bae等，2012;Kang等，2012)。抗体通常直接偶联至递送平台 的表面。然而，化学偶联通常会影响抗体的结合能力，这归因于其抗原结合位点的变化，变 性或抗体的随机取向。因此，开发了更有效方法以使抗体偶联至递送平台，且不改变抗体性 质。蛋白A/G广泛用于抗体纯化，通过特异性结合至抗体的片段可结晶区(Fc)来非共价捕获 抗体，因此抗体的结构和功能保持完全完整(Bae等，2012 ;Kang等，2012)。蛋白G或蛋白A的 小结合肽拟Fc结合肽可用于设计该递送系统，其可提供用于结合任何抗体的衔接子，供于 特异性递送。
[0157] 示例性的小结合肽，源自蛋白6的00六1见1^1^1(：1'(5￡〇10勵:2)，对抗体具有高亲 和性，并且已被插入蛋白质笼状物以结合抗体(Kang等，2012)。向结合肽的两侧添加其它甘 氨酸残基，以增强其构象柔性并提供完全可及性以接近抗体。可以1或多于1个拷贝合成该 Fc结合肽，以增强结合力。可在所述结合肽的两侧添加额外的甘氨酸残基并以胱氨酸结束， 例如，1 个拷贝：CGGGGDCAWHLGELVWCTGGGGC ( SEQ ID N0:l);2 个拷贝： 过双功能PEG，Ma 1-PEG-NHS偶联至PLGA-PEI (图 1C)。
[0158] 可采用双功能PEG(Mal-PEG-NHS)来将抗体或Fc结合肽片段连接至PLGA-PEI，以制 备特异性递送试剂。在特定实施方式中，Mal-PEG-NHS与PLGA-PEI以所需的摩尔比在0.1M磷 酸盐缓冲液(pH 7.0)中，于室温下，在氮气下反应3小时。Mal-PEG-PEI-PLGA可通过，例如， 凝胶渗透色谱纯化。所述抗体或Fc结合肽片段可以所需的摩尔比添加至Mal-TOG-TOI-PLGA，并在氩气下室温反应过夜。所述抗体-PEG-PEI-PLGA还可通过对0.1M NaCl透析来纯 化。
[0159] 实施例4
[0160] PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的制备
[0161] 使PLGA-PEI (w/w至多 1:1)和APMP 修饰的 PLGA-PEI (w/w = 0.5:1)完全溶解于水中。 这些带大量正电的聚合物适于基因递送。PLGA-PEI/DNA纳米颗粒以聚合物和DNA的不同比 率制备(通常是1.5:1-25:1)，通过将质粒DNA溶液添加至PLGA-PEI聚合物的水溶液，然后涡 旋5秒。通常，将50yl水中的10yg质粒DNA添加至50yl水中的25yg的PLGA-PEI，并涡旋5秒。使 用前，这些纳米颗粒分散体在室温下放置30分钟。这些纳米颗粒分散体无需进一步处理即 可使用。同样地制备APMP-PLGA-PEI/DNA纳米颗粒。类似地，对于基因治疗和化疗联合，待递 送的DNA与PLGA-PEI、APMP-PLGA-PEI或抗体-PEG-PLGA-PEI，以及化疗药物混合在一起以制 备纳米颗粒。PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI可荷载宽范围的DNA，例如，25ug PLGA-PEI能够递 送l_15ug DNA至6孔板的1个孔中的细胞，并以相较于lipofectamine 2000和PEI的低毒性 高效转染。
[0162] 对于用PLGA-PEI (0.5 : lw/w)和DNA形成的纳米颗粒，纳米颗粒的有效直径范围是 100nm-l 30nm，取决于PLGA-PEI和DNA的比率（表4)。
[0164] 表4. PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的表征。PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的尺寸通过动态光散 射，采用ZetaPlus粒径测量(布鲁克海文仪器公司（Brookhaven Instruments Corp ?))测 定。
[0165] 25yg PLGA-PEI/10yg DNA的代表性尺寸分布示于图2。多分散性介于0.1和0.3。 PEI的G电位仅为多至90mV，但如果与DNA复合，则降至60mV。相较于PEI/DNA，PLGA-PEI/DNA 具有低得多的G电位（约20mV)，指示PEI的正电荷被PLGA有效遮蔽。APMP修饰的PLGA-PEI/ DNA的粒径分布和（电位列于表5。
[0166]
[0167] 表5.APMP-PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的粒径和G电位。PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的尺寸 通过动态光散射，采用ZetaPlus粒径测量(布鲁克海文仪器公司（Brookhaven Instruments Corp.))测定。
[0168] 对于重量比为0.5:1的PLGA与PEI或APMP-PEI的反应时间，发明人观察到，反应在 室温下THF中的混合后立即开始，因为该溶液变得不清澈，即，产物不溶于THF。所有产物在 4 8小时沉淀。可如果在短时间（例如1小时、5小时或2 4小时）停止该反应，则可测试产物性 质。在本发明的特定实施方式中，反应时间是重要的。因为PEI将大PLGA断裂成偶联至PEI的 小交酯-共聚-乙交酯单一单元，来自该反应物(PLGA和PEI)的终产物在THF中具有不同溶解 性。如果该反应在1小时、5小时或24小时中停止，该反应尚未结束，在某些实施方式中，从而 产物可与本文中提供的那些具有不同结构。在大多数文献中，PLGA和PEI在有机溶剂中混合 小于1小时，然后倾倒进入表面活性剂溶液(Bivas-Benita等，2004 ;Nam等，2003; Shau等， 2012; Gargouri等，2011; Bivas-Benita等，2009)。在文献中，没有论文报道PLGA和PEI混合 物的最终结构。在本发明的实施方式中，不同反应时间可能会获得不同产物。在本技术中， PLGA和PEI反应48小时且反应完全，因此，形成均一的产物。
[0169] 对于反应温度，可以较低或较高温度测试反应。对于起始材料PLGA，采用PLGA(50: 50)(12-16kDa，交酯：乙交酯50:50mol/mol，静脉内（i .v. )0.50-0.65)和PLGA(50:50， llOkDa)。生成均一产物。在特定实施方式中，具有不同分子量和交酯：乙交酯比率的其它 PLGA制备类似材料但一些性质可能稍有不同。可采用不同PLGA聚合物合成PLGA-PEI。对于 PEI，在具体的实施方式中，其为具有多个伯胺的支化形式。然而，市售来源的支化的PEI也 具有不同分子量，包括(不限于)800，1200，1800，2500，5000，25000 和60000kDa。
[0170] PLGA与PEI的比率是影响产物性质的另一项因素。支化的PEI是良好的DNA递送载 体，但其毒性过高。PLGA曾被用于修饰PEI，通过将PLGA单一单元偶联至PEI以降低其毒性并 改善递送性质/或过程。如果PLGA与PEI的比率过高，PEI的大多数伯胺将被PLGA片段占据， 由此会降低DNA荷载容量和转染效率。然而，若其过低，PEI无法被PLGA片段良好遮蔽，该共 聚物仍对细胞具有高毒性。PLGA与PEI的比率的具体条件可能是有用的。此外，文献方法采 用少于 15 % 的PEI 以制备PLGA-PEI (Bivas-Benita等，2004; Nam等，2003 ; Shau等，2012 ; Gargouri等，2011;Bivas-Benita等，2009)。用较少PEI含量制备的PLGA-PEI的结构完全不 同于用高PEI含量制备的那些。例如，在现有材料PLGA-PEI (0.5/1 w/w)中，约50 %的PEI的伯 胺通过酰胺键与PLGA交酯-共聚-乙交酯单一单元偶联;其它50%的PEI的伯胺仍然游离。如 果PLGA与PEI的比率增加至1:1或更高(w/w)，90%的PEI的伯胺将被PLGA片段占据。此外，如 果采用更多PLGA含量或更少PEI含量，PLGA片段可变得更大，导致不同结构。
[0171] 合成的APMP修饰的PLGA-PEI的递送性质优于PLGA-PEI和缺乏APMP的那些。APMP已 被偶联至其它聚合物以增加细胞摄取(Sunshine等，2012)。与APMP具有类似性质的其它化 学品也可偶联至PLGA-PEI以递送核酸和其它分子至细胞或动物。可用2-(3_氨基丙基氨基） 乙醇、2-甲基-1，5-二氨基戊烷、3-氨基-1-丙醇、4-氨基-1-丁醇、5-氨基-1-戊醇、1-( 3-氨 基丙基)吡咯烷、4-氨基苯基二硫化物和胱胺来合成修饰的PLGA-PEI(Sunshine等，2012)。
[0172] 实施例5
[0173] PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的合成和尺寸分布
[0174] 提供PLGA-PEI/DNA的制备。PLGA-PEI(w/w至多1:1)是水溶性的。PLGA-PEI与质粒 DNA在普通（plain)培养基或水中的混合导致形成纳米颗粒或复合物。对于用PLGA-PEI (0 ? 5:1 w/w)和DNA形成的纳米颗粒，纳米颗粒的有效直径范围是100nm-l 30nm，取决于PLGA-PEI和DNA的比率(表4)。25yg PLGA-PEI/1 Oyg DNA的代表性尺寸分布示于图2。多分散性介 于0.1和0.3JEI的G电位仅为多至90mV，但如果与DNA复合，则降至60mV。尖峰指示颗粒具有 约llOnm的均一尺寸。
[0175] 除了质粒DNA的递送之外，该PLGA-PEI递送系统还用于递送寡核苷酸DNA或RNA(单 链或双链），用于治疗目的。为表征该用途，形成具有不同量的单链寡聚DNA引物(23个碱基） 和测试的尺寸分布的PLGA-PEI 1LGA-PEI (25yg)和5yg寡聚DNA没有形成纳米颗粒;而PLGA-PEI (25yg)和10yg寡聚DNA形成较大的颗粒（大于250nm，小于900nm)(图3A);且PLGA-PEI (25 yg)和15yg寡聚DNA形成较小颗粒（大于1 OOnm，小于250nm)(图3B)。另一方面，PLGA-PEI (25y g)和20~35yg双链寡聚DNA形成纳米颗粒(约500nm)。
[0176] 1-(3_氨基丙基）-4_甲基哌嗪修饰的PLGA-PEI共聚物(APMP-PLGA-PEI)通过将 APMP经接头直接偶联至PEI然后与PLGA反应来制备。APMP修饰的PLGA-PEI/DNA的粒径分布 和G电位列于表5。例如，荷载10yg质粒DNA的15、20、25、30或35邱六?]\〇 3-?1^^-?￡1可形成粒 径介于118和140nm之间的纳米颗粒。
[0177] 实施例6
[0178] 通过光学检测的PLGA-PEI的DNA荷载率和PLGA-PEI的DNA保留
[0179] 纳米颗粒的DNA荷载率通过分光光度法和凝胶电泳检测。纳米颗粒采用50yl水中 的l〇yg质粒DNA和50yl水中的0-30yg的PLGA-PEI制备，并制成总计lOOyl溶液。这些纳米颗 粒分散体在使用前于室温下保持30分钟。50iU的各分散体经等分并以15krpm离心 (Eppendorf，离心机5424)10分钟。采用安捷伦8453分光光度计，在26〇11111检测上清液的吸光 度。凝胶电泳在包含25nM溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶上进行。各泳道上样与5iU带负电的 染料混合的l〇yl的上述颗粒溶液。凝胶在80mV跑动45分钟，并在VersaDoc成像系统上采用 软件"Quantity 0ne4.6.7"，美国伯乐公司（Bio-RAD)成像。
[0180]光学检测能够测定溶液中悬浮的游离DNA或聚合物/DNA纳米颗粒（图4A)。显示对 于10yg DNA与0-30yg PLGA-PEI而言，随着聚合物增加至15yg，溶液中的DNA从100减少至 零，然后当聚合物浓度增加时增加。这指示带负电的DNA分子被带正电的聚合物中，然后颗 粒形成并离心，然而，采用约多的聚合物，该复合物具有额外电荷，这使颗粒在水性溶液中 可溶。这并不意味指DNA在溶液中是游离的。由于能够从凝胶电泳观察到，在0.5: l(w/w)比 率下，PLGA能够保留大多数DNA，但其在低l:l(w/w)比率下能够保留全部DNA，图4B。因此，在 该比率下，DNA荷载是100%。采用越多的PLGA-PEI，带有越多正电的聚合物将结合DNA并使 其凝缩。因此，采用DNA 10yg+15yg PLGA-PEI或如上所述，所有材料有效地形成具有可变尺 寸和水溶性的纳米颗粒。
[0181] 实施例7
[0182] PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的直接观察
[0183] 颗粒图像用扫描电子显微镜(SEM)检测。采用PLGA-PEI(64%PEI)和绿色荧光蛋白 质粒DNA(4.7kbp)在氮/磷(N/P)比率为7.4、12.3和17.2下制备样品。当0嫩用？11^^^1以~/ P为7.4凝缩时，清楚显示尽管DNA仍成型但DNA被聚合物包裹，获得约150-230nm的颗粒尺寸 (图5A)。然而，采用越多的PLGA-TOI，颗粒看上去越呈固体且刚性，并且随着N/P增加至 12.2，尺寸下降至100~150nm(图5B)。当N/P增加至17.2时，颗粒变成球形，且尺寸减小至约 50nm(图5C)。因此，PLGA-PEI是与DNA有效凝缩并且控制了颗粒尺寸的聚合物。越多的聚合 物产生越小尺寸的纳米颗粒。颗粒尺寸是递送系统的一项重要参数。不同应用需要特定的 纳米颗粒尺寸用于递送。本发明能够容易地控制PLGA-PEI纳米颗粒的尺寸。
[0184] 实施例8
[0185] PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的体外细胞毒性
[0186] 在人胰腺癌细胞系(PANC-1细胞）中研究PLGA-PEI/DNA纳米颗粒和PEI/DNA复合物 的细胞毒性。细胞用纳米颗粒在10%FBS DMEM培养基中处理过夜，然后移除培养基并用MTT (2 % FBS培养基中的lmg/ml)处理细胞两小时，然后添加100y 1 SDS/DMF。板在37C孵育过夜， 并在570nm处通过光学密度测定浓度。MTT试验是比色试验，用于检测细胞酶将四唑染料 (MTT)还原成其不溶性甲腊(formazan)并呈现紫色的能力。该试验检测存在的活细胞的数 量。
[0187] 质粒DNA量固定在lyg/孔，并且不同聚合物和DNA采用相同的PEI与DNA比率（即，相 同的N/P比率），与PLGA-PEI做比较（图6)。研究1:1 -4:1的PE I与DNA的比率。MTT测试结果指 示，相较于未处理的细胞，PEI与DNA比率多至3:1的PLGA-PEI/DNA复合物不具有毒性或具有 较小毒性。然而，采用PEI/DNA复合物，PEI与DNA比率为2:1时，失去了大约一半的细胞活力。 因此，PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的PLGA组分对于PEI-诱导的细胞毒性而言具有保护作用。因 此，在相同的PEI和DNA含量和条件下，PLGA-PEI/DNA递送系统的毒性低于PEI/DNA递送系 统。
[0188] 实施例9
[0189] PLGA-PEI/DNA(EGFP)纳米颗粒的体外转染效率
[0190] 胰腺癌细胞系PANC-1细胞在10%的血清的存在下培养。所述细胞用10%FBS DMEM 培养基中的纳米颗粒处理过夜，然后培养基用新鲜培养基替代，并且再孵育一天。评价与编 码绿色荧光蛋白（GFP)的质粒DNA复合的PLGA-PEI纳米颗粒在PANC-1细胞中于10%的FBS存 在下的转染效率，并将其与Lipofectamine/DNA和PEI/DNA递送系统做比较（图7A)。在PANC-1细胞中，PLGA-PEI/DNA纳米颗粒的转染活性优于PEI/DNA复合物，并类似于 Lipofectamine/DNA。此外，细胞中采用PLGA-PEI/DNA的GFP表达较在那些细胞中采用PEI/ DNA 或 1 ipof ectamine/DNA 而言更长久。
[0191] APMP(l-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪）用于共价连接至PLGA并配制APMP-PLGA-PEI。 该新材料有效荷载DNA并形成纳米颗粒(表5,图4B)。测试该新材料的纳米颗粒形成和向胰 腺癌细胞（PANC-1)的GFP质粒递送（图7B)，并且与相同条件（5yg质粒-GFP DNA)下 Lipofectamine 2000、？￡1、？11^^^1做比较。明显地4?]\03-?11^^^1/6??质粒0嫩的效率高 于PLGA-PEI、PEI和Lipofectamine 2000递送系统。
[0192] 不同类型的细胞响应不同转染试剂具有不同转染率。熟知的是，在向人脐静脉内 皮细胞(HUVEC)递送基因方面，Lipofectamine 2000并不有效(约2%)。研究了PLGA-PEI/质 粒DNA纳米颗粒在HUVEC细胞中的基因递送效率，并与相同条件下的Lipof ectamine 2000做 比较。HUVEV培养于10%FBS内皮细胞培养基(EBM-2加有补充物，Lonza)中。细胞用PLGA-PEI/质粒 DNA(25yg PLGA-PEI/包含 GFP 基因的 10yg 质粒 DNA)或 Lipof ectamine 2000/10yg DNA处理过夜;然后细胞用新鲜培养基再培养一天。拍摄荧光图像以指示GFP蛋白的转染率 和表达。HUVEC中，PLGA-PEI纳米颗粒的转染率比Lipofectamine 2000高得多（图7C)。作为 新药物递送系统，PLGA-PEI纳米颗粒有效于递送基因或药物至通过其它递送系统难以转染 的细胞，例如HUVEC。因此，PLGA-PEI递送系统显著优于其它递送系统，例如Lipof ectamine 2000 〇
[0193] 实施例10
[0194] PLGA-PEI/DNA纳米颗粒:小鼠中的毒性研究
[0195] 不推荐Lipofectamine 2000用于体内，因为其对血红细胞和其它细胞有毒性。仅 一些脂质体制剂和PEI可用于体内；但其毒性是众所周知的。将PLGA-PEI/DNA的体内毒性与 PE I /DNA做比较。对于PE I /DNA递送系统，所有小鼠（n = 3)在尾静脉注射以1.5:1的w/w比与 PEI(75yg)复合的50yg DNA之后死亡；而所有小鼠（n = 3)在尾静脉注射与PLAE-PEI(125yg) 复合的50yg DNA之后存活。此外，接受了与PLGA-PEI(250yg)复合的100yg DNA的所有小鼠 (n = 8)存活。接受了与PLGA-PEI(500yg)复合的200yg DNA的小鼠（n = 4)有50%存活。因此， PLGA-PEI /DNA显示的体内毒性远小于PE I /DNA。PLGA显著地降低了 PE I相关的体内毒性。这 是本发明用于体外和体内基因或药物递送应用的一项主要优势。
[0196] 实施例11
[0197] PLGA-PEI/红色荧光蛋白（RFP)DNA纳米颗粒在小鼠模型中的递送效率
[0198] 采用PLGA-PEI作为递送系统，通过尾静脉注射向小白鼠递送红色荧光蛋白（RFP) 质粒DNA，以研究小鼠器官中的DNA转染，并与PEI/DNA递送做比较。在5天内向小鼠注射三个 剂量的与PLGA-PEI或PEI联合的30yg DNA，然后，在第7天处死小鼠，并通过红色荧光检测器 官组织的DNA转染。对于PLGA-PEI/DNA处理的小鼠，器官例如肝、脾和胰腺显示强红色荧光； PE I /DNA处理的小鼠仅显示肝、脾和胰腺中的弱红色荧光（图8)。因此，在体内，PLGA-PE I递 送系统远比基于PEI的递送系统高效。
[0199] 此外，在裸小鼠模型中的胰腺肿瘤(作为示例）中测试PLGA-PEI/DNA系统。裸小鼠 用另一种人胰腺癌细胞系(AsPC-1细胞)皮下注射，两周内肿瘤生长出来。通过向肿瘤直接 注射，采用25yg PLGA-PEI并递送10yg RFP NDAJ天后，取出肿瘤，并在肿瘤中发现强红色 荧光，指示肿瘤组织内部的高DNA转染效率(图9)。
[0200] 实施例12
[0201] 载有miR-198的PLGA-PEI纳米颗粒的静脉内（IV)递送降低了原位胰腺癌模型中的 肿瘤荷载和转移扩散
[0202] 先前的研究显示间皮素(MSLN)过表达和miR-198下调导致胰腺癌(PC)细胞的体外 侵入和转移增加和体内肿瘤扩散的增加;并且miR-198重建能够减少转移扩散和肿瘤体积。 考虑通过PLGA-PEI纳米颗粒治疗性递送miR-198能否减少MSLN-过表达PC细胞在原位PC肿 瘤模型中的转移扩散。裸小鼠用胰腺癌细胞(Mia-MSLN)植入两周，并分成两组。对照小鼠通 过尾静脉注射3次/周，持续3周，接受PLGA-PEI/空载体质粒(50邱）；处理的小鼠通过尾静脉 注射3次/周，持续3周，接受PLGA-PEI/miR-198质粒(50yg)。所有动物在6周时处死。荧光成 像（图10A)和手术切除（图10B)下观察小鼠的肿瘤尺寸和转移。数据显示，载有miR-198的 PLGA-PEI纳米颗粒的静脉内（IV)递送显著地减少了原位胰腺癌模型中的肿瘤荷载和转移 扩散。
[0203] 实施例13
[0204] 载有miR-198的PLGA-PEI纳米颗粒的腹膜内（IP)递送和吉西他滨协同地降低了原 位胰腺癌模型中的肿瘤荷载和转移扩散
[0205] 通过将3xl06胰腺细胞系（MIA-MSLN-GFP细胞）直接注射进入胰腺来植入常位肿 瘤。肿瘤细胞植入后两周，在3个组(4只小鼠/组）中进行处理。对照小鼠不接受任何处理。吉 西他滨小鼠通过腹膜内注射3次/周，持续3周，接受临床化疗试剂吉西他滨(50mg/kg体重）。 吉西他滨+miR-l98小鼠通过腹膜内注射3次/周，持续3周，接受吉西他滨(50mg/kg体重）和 PLGA-PEI/miR-198质粒(50mg)的组合。所有动物在6周时处死。荧光成像（图11A)和手术切 除（图11B)下观察小鼠的肿瘤尺寸和转移。数据显示，采用吉西他滨和PLGA-PEI纳米颗粒包 封的miR-198的联合治疗有效地降低了原位PC小鼠模型中的胰腺癌生长和转移。
[0206] 实施例14
[0207] 治疗性XIST片段和基于PLGA-PEI的递送系统用于胰腺癌的治疗
[0208]胰腺癌(PC)是美国癌症死亡率的第四主要原因。评估指示，在2014,有约46,420例 新病例将被诊断，而39,590名人类将死于PC。大多数患者被诊断患有晚期PC，并且不符合手 术切除条件。PC患者的死亡率在过去二十年并未得到显著改善;PC的五年存活率仍保持低 于5%。急需对于PC的有效治疗。PC的起始和进展涉及两步遗传变异累积，例如导致肿瘤抑 制剂基因失活和癌基因活化的点突变、染色体易位和基因拷贝数变化。
[0209] 人X染色体携带大约1，500个基因，其中一些代表人类乳腺、卵巢、前列腺、睾丸、 肺、肝、结肠、皮肤、肾和其它器官癌症中观察到的遗传变异的可能位点。在女性中，一拷贝 的X染色体通过若干机理正常失活，包括DNA甲基化和乙酰化不足，和XI ST (X-失活-特异性 转录)RNA(-种没有编码能力的17kb剪接和聚腺苷酸化的RNA)的独特功能。XIST RNA保持 受限于核，其在该处以顺式分布在失活的X染色体上。在女性中，已发现XIST RNA的若干剪 接同种型，包括 AK054860(2.659kb，外显子 6的部分）、AK025198(2.176kb)和 X56199 (1.614kb)。在男性中，XIST不表达，除了在睾丸中的生殖细胞中。已在女性中的一些乳腺、 卵巢和宫颈癌中观察到XIST，并且其似乎与较差的癌症预后相关联。
[0210] 在XIST区域有新的发现，其在大多数女性人PC组织和癌细胞系中显著下调（图 13)。更重要地，通过施加XIST RNA的强行表达，在这些女性细胞中发现XIST RNA表达损失 具有功能显著性。XIST RNA向女性PC细胞系(其中XIST显著下调）的基因递送导致体外细胞 增殖的抑制，以及异种移植的小鼠模型中肿瘤生长的减少（图14)。惊人地，XIST片段 (AK054860,2.659kb，外显子6的部分)在男性人PC细胞系PANC-1 (其不表达XIST)中的强行 表达也显著地降低细胞增殖(MTT测试）、体外转移(Boyden室试验），和裸小鼠模型(n = 8，p〈 0.05)中抑制的肿瘤生长。将XIST基因片段(AK054860,2.659kb，外显子6的部分)亚克隆进 入质粒PUMVC3载体，其是临床试验的获批载体。此外，采用一系列截短亚克隆试验，并在女 性和男性PC细胞系(分别是ASPC-1和PANC-1)中采用PLGA-PEI NP递送系统的细胞增殖试验 (MTT测试），鉴定了 XIST基因片段的短功能结构域(486bp)(图15)。
[0211] 参考文献
[0212] 本说明书中涉及的所有专利和出版物指示本发明涉及领域技术人员的水平。本文 中所有专利和出版物通过引用纳入，就如各出版物被具体地和单独地说明通过引用全文纳 入本文一样。
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[0238] 尽管已经详细描述了本发明和其优势，但是应当理解，可对本文进行各种变化、替 代和改变而不背离所附权利要求所定义的本发明的精神和范围。此外，本申请的范围不是 旨在限制于本说明书所述的形式、手段、方法和步骤的过程、机器、制造、组合物的具体实施 方式。本领域普通技术人员通过本发明的内容将容易理解，现存或后续开发的与本文所述 相应实施方式实施基本相同功能或实现基本相同结果的形式、手段、方法、或步骤的过程、 机器、制造、组合物均可使用。因此，所附权利要求旨在将形式、手段、方法、或步骤的过程、 机器、制造、组合物包括在其范围内。
【主权项】
1. 一种共聚物组合物，其包含聚（乳酸-共聚-乙醇酸）（PLGA)和聚乙烯亚胺(PEI)，其特 征在于，所述PLGA与PEI的w/w比是0 · 5:1、1:1、2:1或5:1。2. -种包含PLGA和PEI的共聚物组合物，其特征在于，所述PLGA与PEI的w/w比是0.5:1， 并且其中来自PLGA的约70-130个交酯-共聚-乙交酯单元通过酰胺键偶联至PEI分子。3. -种包含PLGA和PEI的共聚物组合物，其特征在于，伯胺浓度是约40 %-约55 %。4. 如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述伯胺浓度是约45 %-约55 %。5. 如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述伯胺浓度是约45 %-约52 %。6. 如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述伯胺浓度是约46 %-约52 %。7. -种包含PLGA、PEI和选自下组的其他化合物的共聚物组合物：1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪(APMP)、2_(3_氨基丙基氨基）乙醇、2-甲基-1，5-二氨基戊烧、1_(3_氨基丙基）P比 咯烷、4-氨基苯基二硫化物和胱胺。8. 如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述化合物是APMP。9. 一种包含PLGA、PEI、APMP和接头的共聚物组合物。10. 如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述接头是聚乙二醇(PEG)接头。11. 如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述PEG接头是马来酰亚胺-PEG-NHS。12. 如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述接头是化学偶联至PLGA-PEI或APMP-PLGA-PEI 聚合物的PEG生物接头(Ma 1-PEG-NHS)，以分别产生Mai-PEG-PLGA-PEI或Ma 1-PEG-APMP-PLGA-PEI〇13. 如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述Mal-TOG-PLGA-PEI或Mal-TOG-APMP-PLGA-PEI化学偶联至Fc结合肽或抗体，用于特异性递送。14. 如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含至少一种 治疗和/或诊断剂，并且其中所述共聚物在纳米颗粒中包含该试剂。15. 如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述治疗和/或诊断剂被合适地配制，用 于动物疾病、作为研究试剂、或二者兼具。16. 如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述治疗试剂被合适地配制，用于人癌、 AIDS、心脏病、中风、糖尿病、呼吸道疾病、肾疾病、细菌感染，和/或病毒感染。17. 如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述试剂是核酸、蛋白质、肽、小分子、抗 原、疫苗或其混合物。18. 如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述核酸是DNA。19. 如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述DNA是双链、单链或其混合物。20. 如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述DNA是寡核苷酸。21. 如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述核酸是RNA。22. 如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述RNA是双链、单链或其混合物。23. 如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述RNA是s iRNA、shRNA、miRNA或其混合 物。24. 如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述诊断剂经标记。25. 如权利要求1、2、3或7所述的组合物，其特征在于，当PLGA与PEI的比率是0.5 : lw/w 时，所述纳米颗粒介于100和130nm之间。26. -种制备如权利要求8所述组合物的方法，所述方法包括以下步骤： 使APMP-共聚-1，4-丁二醇二丙烯酸酯与PEI混合以产生APMP-PEI聚合物;和 使所述APMP-PEI聚合物与PLGA混合以形成APMP-PLGA-PEI共聚物组合物。1，4_ 丁二醇 二丙烯酸酯-共聚-1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪。27. 如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述APMP-共聚-1，4-丁二醇二丙烯酸酯和 ΡΕΓ混合至少24小时。28. 如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述APMP-PEI聚合物和PLGA混合至少24小 时。29. 如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤:使所述共聚物 组合物与至少一种治疗和/或诊断剂混合。30. -种治疗个体的医学状况的方法，所述方法包括如下步骤：向所述个体递送治疗有 效量的权利要求14所述的组合物。31. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述组合物被递送超过一次。32. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述组合物通过注射递送。33. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述组合物通过腹膜内或静脉内递送。34. 如权利要求30所述的方法，所述方法还包括：向所述个体递送治疗有效量的其他化 合物，用于治疗所述医学状况。35. 如权利要求30所述的方法，所述方法还包括如下步骤:鉴定所述个体是否需要对其 医学状况进行治疗。36. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述医学状况是癌。37. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述组合物包含治疗性核酸。38. 如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述治疗性核酸包含XIST核酸的功能性 部分或全部。
【文档编号】A61K47/48GK105873613SQ201480056399
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年8月13日
【发明人】吕建明, 姚奇志, 陈昌义
【申请人】贝勒医学院