基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于聚氨基酸的纳米粒子的制备方法。首先以疏水性羟基化合物、对硝基苯基氯甲酸酯为原料，反应得到对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子；然后以对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子和二胺化合物为反应物，反应制备疏水性胺基化合物；再以疏水性胺基化合物作为引发剂，开环聚合α?氨基酸?N?羧基内酸酐化合物得到基于聚氨基酸的聚合物；最后将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后加入聚合物的丙酮溶液，搅拌得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子。得到的载药靶向纳米粒子具有很高的稳定性，其可以与靶向分子结合很好地富集到肿瘤部位，并对包括人乳腺癌在内的多种固体肿瘤具有很好地治疗作用和低的毒副作用。
【专利说明】
基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种聚合物粒子，具体设及一种基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳 米粒子的制备方法。
【背景技术】
[0002] 聚(乳酸-径基乙酸KPLGA)是一种抑A批准的生物可降解聚合物，被广泛地应用于 手术缝合线、组织工程支架、药物控制释放载体等生物医用领域。基于PLGA的生物可降解纳 米粒子和微米粒子已成为实现药物祀向长效治疗的最重要载体之一。例如，多种包载蛋白 药物和多肤药物的PLGA微球如Depot?，Decapeptyl?，Soma1:ulline?，Nut;ropin?，D邱ot?，已 被临床用于治疗前列腺癌、肢端肥大症、生长激素缺乏症。PLGA纳米粒子和微米粒子通常是 用乳化-溶剂挥发法或纳米沉淀法制备，运通常要用表面活性剂来稳定分散的小液滴，减小 表面张力和防止絮积。聚乙締醇(PVA)、泊洛沙姆(poloxamer)和聚丙締化咯烧酬(PVP))等 表面活性剂因具有在水溶液中粘度高，能很好地吸附在分散小液滴的表面等优点而成为制 备PLGA纳米粒子和微米粒子最常用的表面活性剂。但运些表面活性剂存在不能生物降解、 体内存在潜在的毒性、缺少功能基团等缺点。例如，PVA不仅可能致癌，而且动物实验发现皮 下或静脉注射PVA会导致高血压、器官损伤、贫血、中枢神经抑制等问题（J. Biomed. Mater. Res. Part A: lOOA; 1998-2005, 2012)〇
[0003] 最近，聚乙二醇1000维生素 E班巧酸醋(TPGS)作为一种生物相容性表面活性剂被 广泛用于纳米粒子制备(Biomaterials 33; 4889-4906，2012)。例如，用TPGS制备得到了 一系列包裹紫杉醇等药物的PLGA、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)纳米粒子;运 些纳米粒子的粒径可控制在200-800nm之间。与传统PVA乳化剂相比，TPGS展现出了更好的 乳化效果和包载效率。研究还发现TPGS乳化剂能通过抑制肿瘤细胞表面P-糖蛋白功能来阻 止抗癌化疗药物被细胞累出，从而大大增强抗癌药物(阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇等)对耐 药肿瘤细胞的毒性。而且，TPGS还被发现本身就有抗癌活性，能抑制移植在裸鼠身上的人肺 癌细胞的生长。但用TPGS乳化的PLGA等纳米微球通常稳定性较低，而且表面很难进行功能 化。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种基于聚氨基酸的纳米粒子，可用来作为纳米药物载体。
[0005] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种基于聚氨基酸的功能性生物可 降解纳米粒子的制备方法，包括如下步骤： (OW疏水性径基化合物、对硝基苯基氯甲酸醋为原料，在无水二氯甲烧和化晚中，反 应得到对硝基苯基氯甲酸醋活化的功能性疏水小分子;然后W对硝基苯基氯甲酸醋活化的 功能性疏水小分子和二胺化合物为反应物，在无水二氯甲烧和化晚中，反应制备疏水性胺 基化合物； (2 ) W疏水性胺基化合物作为引发剂，开环聚合α-氨基酸-N-簇基内酸酢化合物得到基 于聚氨基酸的聚合物;所述α-氨基酸-N-簇基内酸酢化合物为丫-寡聚乙二醇-k谷氨酸-N- 簇基内酸酢或0-寡聚乙二醇-心天冬氨酸-N-簇基内酸酢； (3)将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后逐滴加入PLGA、PLA、P化或阳G-PLA的丙 酬溶液，揽拌得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子。
[0006] 上述技术方案中，步骤（1)中，疏水性径基化合物包括维他命E、胆固醇、香豆素、胆 酸、喜树碱、伊立替康;二胺化合物选自W下化合物中的一种：乙二胺、下二胺、辛二胺、赖氨 酸甲醋、赖氨酸乙醋、鸟氨酸甲醋、鸟氨酸乙醋、脫氨酸甲醋、脫氨酸乙醋、脫胺;步骤（1)中， 疏水性径基化合物、对硝基苯基氯甲酸醋和化晚的摩尔比为1:2:5;对硝基苯基氯甲酸醋活 化的功能性疏水小分子、乙二胺和化晚的摩尔比为1:20:20。
[0007] 上述技术方案中，步骤(1)中，制备对硝基苯基氯甲酸醋活化的功能性疏水小分子 时，在〇°C度条件下滴加对硝基苯基氯甲酸醋，再在30°C反应24小时；制备疏水性胺基化合 物时，反应溫度为室溫，时间为24小时。
[0008] 上述技术方案中，步骤(2)中，疏水性胺基化合物、α-氨基酸-N-簇基内酸酢化合物 的摩尔比为1:3~25;疏水性胺基化合物的分子量大于240;步骤(2)中，制备基于聚氨基酸 的聚合物时，反应溫度是25~50°C，反应时间为12~72小时。
[0009] 上述技术方案中，步骤(3)中，将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后在抓C/ NHS催化条件下，与短肤、单糖、叶酸、生物素或者抗体分子反应，制得含祀向分子表面活性 剂;然后含祀向分子表面活性剂中逐滴加入PLGA、PLA、P化或阳G-PLA的丙酬溶液，得到基于 聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子;步骤(3)中，在室溫下揽拌挥发除去有机溶剂，离 屯、收集得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子。
[0010] 本发明公开的基于聚氨基酸的聚合物的化和结构式可W为：
[00川疏水功能小分子Ri作为憎水的头，水溶的聚（丫-寡聚乙二醇-レ谷氨酸）和聚(β- 寡聚乙二醇天冬氨酸）的聚氨基酸链段作为亲水的尾己，其中X为2~5，η为3~20;町分 子量大于240 Da。
[0012] 疏水性径基化合物包括维他命E、胆固醇、香豆素、胆酸、喜树碱、伊立替康等，其结 构式如下：
二胺化合物结构为^^化^^^^心劑約?，选自^下化合物中的一种：乙二胺、下二胺、辛二胺、 赖氨酸甲醋、赖氨酸乙醋、鸟氨酸甲醋、鸟氨酸乙醋、脫氨酸甲醋、脫氨酸乙醋、脫胺等，其具 体结构如下：
其中y为2,4,8。
[0013] 上述制备过程可表示如下： (1)中间体对硝基苯基氯甲酸醋活化的疏水小分子(Ri-4-NC)的制备:在0°C条件下，将 对硝基苯基氯甲酸醋的二氯甲烧溶液滴加到疏水性径基化合物和化晚的二氯甲烧溶液中。 滴加完毕后，将反应液转移到30°C油浴中反应24小时后过滤将除去化晚盐，旋蒸除去二氯 甲烧得到粗产品。将粗产品溶解在石油酸中，然后在-5°C度离屯、除去不溶物，再旋蒸除去溶 剂得到黄色油状的中间体Ri-4-NC;末端氨基的疏水小分子(Ri-N此）的制备:将对硝基苯基 氯甲酸醋活化的疏水小分子(Ri-4-NC)溶解在无水二氯甲烧溶液中，用恒压滴液漏斗10秒 每滴滴加到二胺和化晚的溶液中，室溫反应24小时后，用去离子水洗涂，有机相用无水硫酸 儀干燥过夜，过滤，旋转蒸发除去二氯甲烧，真空干燥24小时，得到产品。干燥后，抽滤除去 硫酸儀，收集有机相滤液，旋转蒸发除去二氯甲烧，并真空干燥24小时，得到末端氨基的疏 水小分子(R广畑2); (2 )将步骤（1)制备的末端氨基的疏水小分子(Ri-N此)溶解在无水二氯甲烧或二甲基 甲酯胺中并置于密闭反应器中，再将丫-寡聚乙二醇-1^-谷氨酸-N-簇基内酸酢(EGx-Glu- NCA)或β-寡聚乙二醇-1^-天冬氨酸-N-簇基内酸酢(EGx-Asp-NCA)的二氯甲烧或二甲基甲酯 胺溶液在氮气环境下快速加入到引发剂溶液中，然后在25~50°C反应12~72小时。反应结 束后，将反应液用冰乙酸沉淀，离屯、，真空干燥，得到基于聚氨基酸的聚合物； 末端氨基的疏水小分子(Ri-N出)与丫-寡聚乙二醇-k谷氨酸-N-簇基内酸酢(EGx-Glu- NCA)或β-寡聚乙二醇-1^-天冬氨酸-N-簇基内酸酢(EGx-Asp-NCA)的摩尔比根据需要控制在 1:3~25。所用有机溶剂可W是二氯甲烧、Ξ氯甲烧、N，N-二甲基甲酯胺、二甲基亚讽、N-甲 基-2-化咯烧酬，本发明优选二氯甲烧。
[0014] 上述制备方法可表示如下：
本发明公开的由上述末端氨基的疏水小分子(Ri-N也）引发丫 -寡聚乙二醇-k谷氨酸- N-簇基内酸酢(EGx-Glu-NCA)或β-寡聚乙二醇-心天冬氨酸-N-簇基内酸酢(EGx-Asp-NCA)聚 合制备的聚合物，其分子量为0.5~6.5 kDa，其中聚氨基酸的重量百分数为20~95%。其末 端胺基可用来连接生物活性分子，运些生物活性分子包括但不仅限于祀向分子：cRGD、 iRGD、AP、奥曲肤、ACUPA等短肤分子，抗体及其片段、铁转移蛋白等蛋白分子，半乳糖(Gal) 和透明质酸等单糖或多糖分子，叶酸，生物素等；和穿膜分子:TAT、Angiopep-2、iRGD、T7、 Cilengitide 等。
[0015] (3)先将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水等溶剂中，然后在抓C/NHS催化条件下， 与短肤、单糖、叶酸、生物素、抗体等生物活性分子反应，制得含祀向分子等生物活性分子的 表面活性剂;然后向该表面活性剂的水溶液中逐滴加入化GA、PLA、P化或PEG-PLA等生物相 容性聚合物的丙酬溶液，再在室溫下揽拌挥发除去有机溶剂，离屯、收集到表面含有祀向分 子等生物活性分子的多功能性纳米粒子。由于上述聚合物由功能性疏水小分子和亲水聚氨 基酸组成，因此具有良好的生物相容性和生物降解性。同时憎水功能性疏水小分子头和亲 水聚氨基酸尾己都有大分子结构和大表面积，具备成为优良表面活性剂的基本特征。而且， 聚合物亲水链段长度能通过调节聚氨基酸的聚合度来控制，从而得到不同亲疏水比例的聚 合物，可方便制备具有不同乳化性能的聚合物。另外，聚氨基酸亲水链段的末端含有胺基， 可用来引入祀向分子等生物活性分子，从而制得多功能的纳米药物载体，负载药物用于肿 瘤的安全高效治疗。
[0016] 也可W不加入祀向分子，制备得到纳米粒子，可W负载多种药物，用于多种疾病的 体内治疗。
[0017] 本发明还公开了一种药物，包括疏水药W及上述方法制备的基于聚氨基酸的功能 性生物可降解纳米粒子;疏水药包括紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、伊立替康、长春新碱、拓 扑替康、贝洛替康、长春瑞滨。
[0018] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点： 1.本发明用基于聚氨基酸的聚合物作为高分子表面活性剂与化GA、PLA、P化或PEG- PLA等生物相容性聚合物制备的多功能纳米药物载体的表面由聚氨基酸链段构成，很好克 服了现有大多纳米粒子表面由聚乙二醇构成所带来的不能生物降解、容易引发过敏反应和 很难进行纳米粒子表面修饰等问题;亲水聚氨基酸链不仅具有很好的生物降解性，而且其 末端的胺基能方便在纳米粒子表面引入祀向分子和穿模肤等生物活性分子，从而增强纳米 药物在病灶处的富集量。
[0019] 2.本发明公开的基于聚氨基酸的生物可降解聚合物作为高分子表面活性剂能很 好克服现有高分子表面活性剂(PVA，poloxamer，PVP等）不具有生物可降解性、生物相容性 不好、很难进行官能化修饰等缺点；W其作为表面活性剂与PLGA、PLA、P化或PEG-PLA等生物 可降解聚合物聚合制备药物载体，成功解决了现有载体存在的不能生物降解、体内存在潜 在的毒性、缺少功能基团等缺点，取得了意想不到的技术效果。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明作进一步描述： 实施例一引发剂维他命E氨基(VE-N出)的合成 (1) 中间体VE-4-NC的制备:氮气环境下，将对硝基苯基氯甲酸醋(4-NC，1.98 g，9.8 mmol)的二氯甲烧(30 mL)溶液在0°C条件下W5秒一滴的速度滴加到维他命E(VE，2.12 g， 4.9 mmol)和化晚（1.98 mL, 24.5 mmol)的二氯甲烧（10血)溶液中。滴加完毕后，转移到 30°C油浴中反应24小时。反应后，过滤除去副产物化晚盐，再用旋转蒸发仪旋干滤液，得到 淡黄色粘稠的VE-4-NC粗产品。然后用石油酸(b. P: 60-90 °C )溶解粗产品，离屯、除去杂质， 旋蒸、最后真空干燥得到黄色粘稠油状产品VE-4-NC，产率93.4%; (2) 引发剂维他命E氨基(VE-N此)的制备:氮气环境下，将步骤(1)制备的对硝基苯基氯 甲酸醋活化的VE-4-NC(0.6 g, 1.0 mmol)的二氯甲烧(14 mL)溶液用恒压滴液漏斗10秒每 滴滴加到乙二胺（1.35 ιΛ, 20.0 mmol)和化晚（1.6血，20 mmol)混合的二氯甲烧(4血） 溶液中，室溫磁力揽拌反应24小时。然后加入一定体积的二氯甲烧，并用去离子水萃取，直 到水相变得没有颜色。将收集到的二氯甲烧相用无水硫酸儀在-24°C条件下干燥24小时，抽 滤除去硫酸儀，旋转蒸发除去二氯甲烧，最后真空干燥24小时，得到黄色粘稠油状产品VE- N出，产率78.1%。
[0021] VE-N出核磁表征；IhNMR (400MHz, CDC13): δ 3.33 (t, -NHC此邸2畑2); 2.90 (t, -N肥此CH2畑2); 2.58 (t,-曲（C曲）3CH2C此-);2.08，2.02 (s,-曲（C曲）3-):1.77 (t，-Ph (C出）3C出細2-); 1.52 (m，C出（CH (C出）C出C出細2) 3-) ; 1.37-1.07 (m，C出（CH(C出） CH2CH2CH2) 3-; s，-C(咖)0-); 0.87-0.83 (d，咖(CH(咖)CH2CH2CH2)厂）。
[0022] 将维他命E更换为胆固醇，可W制备引发剂胆固醇氨基(化ol-N此）；iH醒R (400 MHz, CDCI3): δ 5.37 (t,-畑=〇);4.49(111，-(-邸2)2畑0(：0畑-);3.214，- 畑师师畑2); 2.81(t,-畑师师畑2); 2.：M，2.27(d，-CH=CCH2CH(-C出）0-)。
[0023] 实施例二维他命E-聚（丫-二乙二醇单甲酸-k谷氨酸）(VE-poly化G2-GIU))的合 成 将引发剂维他命E氨基VE-N出（1.16 g，2.25 mmol)溶于37 mL二氯甲烧溶剂中并置于 密闭反应器中。氮气环境下，将丫-二乙二醇单甲酸-レ谷氨酸-N-簇基内酸酢^62-6111- NCAX3.71 g，13.50 mmol)单体的二氯甲烧溶液(37 mL)快速加到引发剂中，25 °C反应12 小时。反应过程用傅里叶红外光谱仪监测。反应结束后，将反应液旋转蒸发浓缩至约18毫 升，用冰乙酸沉淀，低溫离屯、（-5Γ，5000巧m)收集沉淀。最后用冰乙酸洗涂Ξ次，真空干 燥48小时，得到淡黄色产品，产率55.8%。
[0024] VE-polHEG2-Glu)核磁表征；iH 應 R (600 MHz, CDC13): δ 4.24 (m,- NHCOCH-; t, CH3OCH2CH2OCH2CH2-); 3.68-3.54 (m, CH3OCH2CH2OCH2CH2-); 3.40-3.36 (t, -NHCH2C出NH-; s, C出OC出CH2OCH2C此-);2.66-2.34 (t, -I%(C出）3CH2C出-，t，-COCH (NH)C出CH2-); 2.07，2.03 (s, -Ph(CH3)3-); 1.99-1.88 (m, -COCH(NH)C出CH2-); 1.78 (t, -I%(C曲）3CH2C此-);1.53 (m, C出（CH(CH3)CH2C此 C此）3-); 1.37-1.07 (m, C曲（CH 畑3)师师师)3-; s，-C(CH3)(CH2)-); 0.87-0.83 化咖畑畑3)师师师)3-)。
[0025] 将引发剂维他命E氨基VE-N出更换为引发剂胆固醇氨基(化ol-N出），得到淡黄色固 体Chol-poly化G2-Asp)i9.i，产率62.1%</HNMR (400 MHz, CDC13): δ 5.35 (t, -CH=C-); 4.46 (m, -(-CH2)2C册C0NH-); 4.24 (m, -NHC0CH-; t, C曲OC出CH2OCH2C出-)3.65-3.54 (m, CH3OCH2CH2OCH2CH2-); 3.42-3.34 (t, -NHCH2CH2NH-; s, CH3OCH2CH2OCH2CH2-) 〇
[0026] 用相似的方法，通过选用不同单体(EGx-Glu-NCA或EGx-Asp-NCA)和控制单体/引发 剂的投料比，可W制备得到一系列聚合度不同的VE-poly化Gx-Glu)n和￥6-9〇17化61~43口)。 两亲性聚合物，其表征见表1。
[0027] 表 1 聚合物V E-poly化Gx-Glu)n和VE-pol^EGx-Asp)n的制备和表征
用相似的方法，选用不同的引发剂如香豆素胺基化合物（Cou-N也）、胆酸胺基化合物 (CA-N也）、喜树碱胺基化合物(CPT-N也）、伊立替康胺基化合物（INT-N也）、二硬脂酷基憐脂 酷乙醇胺(DSPE)、二油酷基憐脂酷乙醇胺(DOPE)、艾日布林(Er i )和十六烷基胺(THDA)，开 环聚合NCA单体可制得一系列疏水功能性小分子-亲水聚氨基酸聚合物，其表征见表2。
[0028] 表2疏水功能性小分子-亲水聚氨基酸聚合物的制备和表征
实施例Ξ用VE-poly(EGx-Glu)n为高分子表面活性剂制备PLGA纳米粒子 化GA纳米粒子(PLGA NPs)的制备：WVE-poly化G2-G1u)5为高分子表面活性剂为例，将 0.9血PLGA的丙酬溶液（10 mg/mL)逐滴滴加到9 mL VE-poly(EG2-Glu)日水溶液(0.45 mg/ mL)中，室溫揽拌6 h，使丙酬挥发，然后离屯、（12000 ;rpm, 10 min, 4 °C; Sorvall Bio化ge Stratos, Thermo Scientific)收集纳米粒子，并用二次水洗一次，除去自由的乳 化剂，制备得到表面含VE-poly化G2-G1u)5的PLGA纳米粒子。纳米粒子的粒径和粒径分布可 用动态光散射测量分别为135 nm和0.06。纳米粒子表面含有VE-poly(EG2-Glu)5聚氨基酸链 段可通过X射线光电子能谱观察到N峰的出现得到证实。而且，纳米粒子表面含有表面活性 剂的量可用氨谱核磁具体测得，通过比较表面活性剂上E&在3.54-3.68的亚甲基和PLGA 在5.21处的次甲基的峰面积，可计算出PLGA表面含有7.3 wt. %的VE-po 1パEG2-G1U)日。通过 调节￥6-9〇17巧62-6111)日为高分子表面活性剂的浓度为0.15,030 111旨/1^，可^制备得到粒径 在150 nm的纳米粒子(表征结果见表3)。
[0029]实施例四表面含有祀向分子的PLA纳米粒子的制备 先将祀向分子连接到高分子表面活性剂的亲水聚氨基酸链段的末端。W连接ACUPA短 肤祀向分子到VE-poly(EG3-Glu)i4.4聚合物为例，首先将聚合物末端胺基转化为簇基，具体 方法如下：将VE-polWEG广G1u)i4.4(900 mg, 0.20 mmol),下二酸酢（24.0 mg, 0.24 111111〇1)，014?(24.4 111旨，0.20 111111〇1)和^乙胺（20.4 111旨，0.20 111111〇1)溶解在9毫升的无水1， 4-二氧六环中，室溫揽拌24小时;反应结束，旋蒸除去溶剂，再用少量二氯甲烧溶解，然后过 滤收集滤液，用无水乙酸沉淀，离屯、，最后真空干燥，得到VE-poly(EG3-Glu)i4.4-C00H，产率 78.1%。接着，用抓C/NHS活化VE-poly 化G3-G1u)i4.4-C00H末端簇基，将VE-polyUG3-Glu )14.广C00H(680mg，0.15 mmol)，NHS巧 1.8 mg，0.45 mmol)和抓(X57.5 mg，0.30 mmol)溶解 在二氯甲烧（6.8 mL)中，室溫反应24小时后，用无水乙酸沉淀，离屯、，真空干燥，得到VE- poly 化 G3-G1u)i4.4-NHS，产率 87.1%。最后，将制得的 VE-poly 化 G3-G1u)i4.4-NHS 与含氨基的 ACUPA祀向分子反应，具体的，先将ACUPA(44.7 mg，0.14 mmo 1)和VE-po 1 y 化G3-G1U) 14.4-NHS (585mg，0.13 mmol)溶解在DMF(6 mL)中，再在30°C反应2天。反应后，用无水乙酸沉淀，离 屯、，真空干燥，得到带祀向分子的VE-poly(EG3-Glu)l4.4-ACUPA聚合物，产率77.9%。然后，按 照实施例立类似的方法用VE-poly化G3-G1u)i4.4-ACUPA为高分子表面活性剂制备得到表面 含有ACUPA祀向分子的PLA纳米粒子，该纳米粒子表面含有的祀向分子密度可W通过调节高 分子表面活性剂的浓度来控制。
[0030] 用相似方法可W将其它祀向分子如cRGD、iRGD、AP、奥曲肤、TAT、Angiopep-2、 1尺60、了7、(：116叫1^(16、抗体及其片段、半乳糖化31)、叶酸、生物素等连接到纳米粒子表面， 从而实现纳米粒子的表面功能化和作为药物载体包载药物后纳米药物的祀向输送。
[0031] 表3用VE-poly化G2-G1U)日表面活性剂制备PLGA纳米粒子(PLGA NPs)及在其表面 引入透明质酸(HA)，制得表面交联且含祀向分子的纳米粒子(HA-PLGA NPs)表征
实施例五表面可逆交联且含有转铁蛋白（Tf)祀向分子的PCL纳米粒子的制备 首先将转铁蛋白的N-糖巧链氧化制备醒基官能化的转铁蛋白（Tf-CHO)，将转铁蛋白 (Tf，25mg)溶解在900 μL的醋酸钢(0.1M，pH5.5)溶液中，再向其加入225 μL高舰酸钢溶 液巧0 ml),在室溫下反应1 h后。反应后，在4°C条件下用Se地adex G-25色谱柱（1.8 X 25 cm)提纯(流动相为醋酸钢(0.1 M，pH 5.5)溶液），制备得到Tf-CHO。将Chol-poly化G2-ASP) 19.1的末端胺基转化为簇基，接着，用抓C/NHS活化;接着与Tf-CHO反应得到祀向聚合物;然 后，用祀向聚合物为高分子表面活性剂制备rcL纳米粒子，将0.9 mL P化的丙酬和四氨巧喃 溶液（10 mg/mL)逐滴滴加到9 mL祀向聚合物水溶液(0.45 mg/mL)中，室溫揽拌6 h，使丙 酬和四氨巧喃挥发，然后离屯、收集纳米粒子，并用二次水洗一次，除去自由的乳化剂，制备 得到表面含转铁蛋白（Tf)祀向分子的PCL纳米粒子。动态光散色结果显示该纳米粒子的平 均直径约为150 nm。
[0032] 实施例六纳米粒子对疏水药物的装载及体外释放 用纳米粒子包载疏水药物紫杉醇(PTX)为例，先将PTX和化GA(理论载药量8 wt.%)溶 解到丙酬溶液中，再逐滴滴加该溶液到VE-poly化G2-G1U)日高分子表面活性剂的水溶液 (0.45 mg/mL)中，室溫揽拌6 h，使丙酬挥发，然后离屯、收集纳米粒子，并用二次水洗涂除去 自由的乳化剂，制备得到包载有PTX的PLGA纳米粒子(PTX-PLGA NPs)。
[0033] 纳米粒子的粒径和粒径分布可用动态光散射测量分别为164 nm和0.16。纳米粒子 的载药量可用高效液相色谱(HPLC)测定。先取0.2 mL PTX-化GA NPs的溶液，冻干称重。再 用水和乙腊巧0:50，v/v)重新溶解，经0.45 μπι滤膜过滤后，用HPLC测定载药量(DLC)和载 药效率(DLE)分别为6.4 wt.%和80.1%。用相似的方法可用VE-poly(EG2-Glu)5高分子表面活 性剂制备纳米粒子实现对其它憎水性药物如多西紫杉醇（DTX)、喜树碱(CPT)、伊立替康 (INT)、长春新碱(VCR)、拓扑替康(TPT)、贝洛替康(BLT)、长春瑞滨(NVB)、阿霉素(D0X)等的 包载，其结果见表4。
[0034] 表4用VE-poly化G2-G1u)5制备的包载疏水药物的纳米粒子
PTX的体外释放实验是在37 °C恒溫摇床中震荡（200 rpm)进行，有Ξ个平行样。将0.5 mL的PTX-HA-PLGA NPs载药纳米粒子溶液置于透析袋(MWC0 12000-14000 Da, Spec化um Laboratories, USA)中，然后将该透析袋放到含有吐溫80(0.1%, v/v)的PB(10 mM, pH 7.4)缓冲溶液(25 mL)中进行体外释放实验。每间隔一定时间，从释放介质中取出5.0 mL溶 液用作测试，同时向试管中补加5.0 mL相应介质。将取出的释放介质溶液冻干，再加入0.5 mL乙腊/水（1:4，v/v)溶解，然后用HPLC测定溶液中药物浓度，最终观察到PTX从PTX-HA- PLGANPs累计释放量随时间变化的行为，结果表明在PBα0mM，pH7.4)介质中，大约有 54.0%的PTX在7天后从HA-PLGA NPs中释放出来。
[0(X3日]实施例屯MTT法分析空纳米粒子(HA-PLGA NPs)的细胞毒性 选用正常细胞（小鼠成纤维L929细胞）和肿瘤细胞（人乳腺癌MCF-7,人脑胶质瘤MG U87)用MTT法测试HA-PLGA NPs的细胞毒性。首先将细胞种在96孔板上（1 X 104个细胞/孔）， 经24小时培养至细胞贴壁约70%。然后，加入不同浓度（10-350 pg/mL)的HA-PLGA空纳米粒 子样品。培养48小时后，向每孔加入10化的MTT巧.0 mg/mL)溶液，再接着培养4小时。随 后，向每孔加入150化DMSO溶解生成的结晶子，并用酶标仪于492皿处测吸光度值(A),计 算细胞存活率。用细胞空白对照孔和培养基空白孔为参照。测试结果表明空纳米粒子导致 肿瘤细胞的存活率明显降低。例如MCF-7肿瘤细胞与350 pg/mL的空纳米粒子作用后，其存 活率下降到约60%。运说明本发明的聚合物作为高分子表面活性剂制得的化GA NPs对肿瘤 细胞具有一定的杀伤力。相反，L929正常细胞即使与浓度高达350 pg/mL的空纳米粒子作 用，其存活率仍然大于90%。运说明本发明的聚合物作为高分子表面活性剂制得的PLGA NPs 具有良好的生物相容性，克服了现有乳化剂有毒、生物相容性差的缺陷。
[0036] 实施例八载药纳米粒子(PTX-HA-PLGA NPs)体外细胞毒性 用MTT法分析PTX-HA-化GA NPs对MCF-7 (表面过度表达CD44受体)肿瘤细胞的毒性。首 先将细胞种在96孔板上（IX 104个细胞/孔），经24小时培养至细胞贴壁约70%。然后，加入 PTX-HA-PLGA NPs，PTX浓度范围选定为0.0005、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5 和10 yg/mL。培养4小时后，吸出含载药纳米粒子的培养液，然后添加新鲜培养基继续解育 44 h。再向每孔加入10化的MTT巧.0 mg/mL)溶液，接着培养4小时。随后，向每孔加入150 化DMS0溶解生成的结晶子，并用酶标仪于492 nm处测吸光度值(A)，计算细胞存活率。实验 用PTX临床制剂Taxol作对照。另外为证实表面含HA的纳米粒子具有祀向性，我们添加了一 组细胞表面受体封闭实验，具体方法是：首先将MCF-7细胞与过量的HA大分子巧mg/mL)解 育4 h，使HA大分子结合并占据了细胞表面的CD44受体，然后再加入PTX-HA-PLGA NPs,分析 其细胞毒性。实验结果显示PTX-HA-PLGA NPs对过量表达CD44受体的MCF-7肿瘤细胞有较高 毒性，其半致死浓度aC5G= 0.37 yg/mL)低于化xoiaC5G= 0.82 yg/mL)，运说明载药纳米 粒子在体外有较高的抗肿瘤活性。另外，载药纳米粒子对表面受体封闭后的MCF-7细胞的毒 性大大降低，其IC50为2.16蛇/血，运说明PTX-HA-化GA NPs主要是通过受体介导方式进入 肿瘤细胞，具有很好的肿瘤祀向性。
[0037] 实施例九载药纳米粒子(PTX-HA-PLGA NPs)的体内抗肿瘤活性 体内抗肿瘤活性实验是用荷MCF-7人乳腺癌Ba化/c裸鼠（18~20克，4~6周龄)进行。首 先通过在裸鼠皮下注射MCF-7人乳腺癌细胞巧X106个/只）建立皮下乳腺癌肿瘤模型，等肿 瘤长大到约50-80 mm3时（大约1周）开始进行治疗。治疗共分两组，即载药纳米粒子(PTX- HA-PLGA NPs)和PTX临床制剂(Taxol)，用空纳米粒子(HA-PLGA NPs)和生理盐水(PBS)作为 对照组。将给药起始日定义第0天，分别在第〇、3、6、9和12天通过小鼠尾静脉注射给药(PTX 药量为5 mg/kg)。在治疗期间，观察荷瘤小鼠的肿瘤体积、体重变化和存活率。小鼠的体重 是每S天称量一次。小鼠的肿瘤体积用游标卡尺测量，计算方法为:V=化XWXH)/2,（其中L 为肿瘤的长度，W为肿瘤的宽度，Η为肿瘤的厚度）。持续观察小鼠的生存到38天。实验过程中 小鼠自然死亡或肿瘤体积大于1000 mm3时，判定为死亡。结果发现PTX-HA-PLGA NPs和 Taxol都能在一定程度上抑制肿瘤的生长，而且PTX-HA-PLGA NPs表现出了明显更优越的抑 制肿瘤生长效果，在静脉注射载药纳米21天后，肿瘤仍能得到很好地抑制，无明显增长。体 重测试结果显示PTX-HA-PLGA NPs不会引起小鼠体重明显变化，运证实了PTX-HA-PLGA NPs 不会产生明显的毒副作用。Kaplan-Meier生存曲线观察结果显示荷瘤老鼠经静脉注射ΡΤΧ- HA-PLGA NPs后，在整个治疗周期没有出现死亡；而PBS组和空白纳米粒子组动物在治疗38 天后全部死亡，Taxol组也有60%的动物在治疗观察结束后死亡。H&E染色后的组织学分析表 明PTX-HA-PLGA NPs能诱导肿瘤细胞大面积坏死，而对肝脏、肾脏等正常组织无明显毒性； 而化xol虽然能在一定程度上杀死肿瘤细胞，但同时也会导致正常组织(肝脏和肾脏）的损 伤。因此，用本发明的高分子表面活性剂制备的载药纳米粒子能将药物祀向输送到病灶部 位，实现明显增强的疗效;同时还大大减小了小分子憎水药物的毒副作用。
[0038]综上可知，本发明基于聚氨基酸的生物可降解性聚合物可W作为表面活性剂，与 PLGA、PLA、P化或阳G-PLA等形成纳米粒子，增加了聚合物的生物可降解性W及功能性，进一 步的，还可W加入祀向分子，得到祀向纳米粒子，用于药物的载体，不仅增加药物富集率，提 高药物祀向能力，更解决了现有载体存在的生物可降解性差、有毒、不稳定的缺陷。
【主权项】
1. 一种基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如 下步骤： (1)以疏水性羟基化合物、对硝基苯基氯甲酸酯为原料，在无水二氯甲烷和吡啶中，反 应得到对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子;然后以对硝基苯基氯甲酸酯活化的 功能性疏水小分子和二胺化合物为反应物，在无水二氯甲烷和吡啶中，反应制备疏水性胺 基化合物； (2 )以疏水性胺基化合物作为引发剂，开环聚合Ct-氨基酸-N-羧基内酸酐化合物得到基 于聚氨基酸的聚合物;所述氨基酸-N-羧基内酸酐化合物为γ -寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐或寡聚乙二醇-L-天冬氨酸-N-羧基内酸酐； (3)将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后逐滴加入PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA的丙 酮溶液，搅拌得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子。2. 根据权利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法，其特 征在于:步骤(1)中，疏水性羟基化合物包括维他命E、胆固醇、香豆素、胆酸、喜树碱、伊立替 康；二胺化合物选自以下化合物中的一种：乙二胺、丁二胺、辛二胺、赖氨酸甲酯、赖氨酸乙 酯、鸟氨酸甲酯、鸟氨酸乙酯、胱氨酸甲酯、胱氨酸乙酯、胱胺。3. 根据权利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法，其特 征在于:步骤（1)中，疏水性羟基化合物、对硝基苯基氯甲酸酯和吡啶的摩尔比为1: 2:5;对 硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子、乙二胺和吡啶的摩尔比为1:20:20。4. 根据权利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法，其特 征在于:步骤(1)中，制备对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子时，在0°C度条件下 滴加对硝基苯基氯甲酸酯，再在30°C反应24小时；制备疏水性胺基化合物时，反应温度为室 温，时间为24小时。5. 根据权利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法，其特 征在于:步骤(2)中，疏水性胺基化合物、α-氨基酸-N-羧基内酸酐化合物的摩尔比为1:3~ 25;疏水性胺基化合物的分子量大于240。6. 根据权利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法，其特 征在于:步骤(2)中，制备基于聚氨基酸的聚合物时，反应温度是25~50°C，反应时间为12~ 72小时。7. 根据权利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法，其特 征在于:步骤(3)中，将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中，然后在EDC/NHS催化条件下，与 短肽、单糖、叶酸、生物素或者抗体分子反应，制得含靶向分子表面活性剂;然后含靶向分子 表面活性剂中逐滴加入PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA的丙酮溶液，得到基于聚氨基酸的功能性 生物可降解纳米粒子。8. 根据权利要求1所述基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法，其特 征在于:步骤(3)中，在室温下搅拌挥发除去有机溶剂，离心收集得到基于聚氨基酸的功能 性生物可降解纳米粒子。9. 一种药物，包括疏水药以及权利要求1所述制备方法制备的基于聚氨基酸的功能性 生物可降解纳米粒子。10. 根据权利要求9所述药物，其特征在于:疏水药包括紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、伊 立替康、长春新碱、拓扑替康、贝洛替康或者长春瑞滨。
【文档编号】C08G69/48GK105879048SQ201610307271
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】邓超, 武金田, 孟凤华, 钟志远
【申请人】苏州大学张家港工业技术研究院