一种结核病基因药物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种结核病基因药物及其制备方法，所述结核病基因药物以腺病毒为基因表达载体，表达细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外颗粒溶素蛋白，所述细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外颗粒溶素蛋白的表达量在2:8至8:2之间。所述方法包括：制备细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒以及细胞外颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒；制备表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一腺病毒和表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二腺病毒；并按照数量比例2:8至8:2混合，即制得本发明提供的基因药物。本发明提供的基因药物通过联合细胞内和细胞外颗粒溶素重组腺病毒，一次性给药，相对于单独使用细胞内和细胞外颗粒溶素重组腺病毒，能更好地治疗原发性结核病，甚至耐多药结核病。
【专利说明】
-种结核病基因药物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，更具体地，设及一种结核病基因药物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 腺病毒(Ad)作为一种常见的基因表达载体，可用于介导外源基因在机体的表达。 目前，近25%基因药物的临床试验方案，均是基于重组腺病毒(rAd)构建，显示其在医学上 的重要地位和安全性;而且，国内、外已经批准用于临床的四种基因药物和疫苗中，中国批 准的两种都是WrAd为基础，并证实其安全性。rAd制备简单、产生的病毒滴度高，并可W经 呼吸道吸入、肌注和局部注射等多种途径应用。
[0003] 结核病（Tuberculosis, TB)不仅是目前传染病中威胁全球人类健康的头号杀手， 而且是严重影响全球和中国人民健康的重大公共卫生问题之一。每年全世界TB新发病例 960万，150万人因 TB而死亡。尽管异烟阱、利福平等一线和卡那霉素等二线抗TB药物在临床 上应用广泛，但治疗周期长达6个月W上，患者的依从性差，导致临床上结核分枝杆菌 (M.tb)对运些药物的耐药性较为常见。尤其是耐多药结核病(MDR-TB)的流行，对TB的有效 治疗提出显著挑战。然而，新型抗TB化学药物的研制尚不能满足TB治疗的需求。因此，开发 基因药物用于治疗TB，具有重要意义和实践价值。
[0004] 前期，我们构建了一种表达细胞内颗粒溶素的重组腺病毒，用于TB动物模型的治 疗，证实其可W直接杀伤寄居在小鼠肺脏巨隧细胞内的M.tb,从而对小鼠 TB模型具有治疗 作用。机体感染M.tb后，主要导致肺脏感染，但仍不清楚M.tb在肺脏的具体寄居部位。尽管 Μ. tb被公认是兼性胞内寄生菌，在体内不仅寄居在细胞内，也可寄居在细胞外，但在不同疾 病类型如：原发性TB、MDR-TB或潜伏感染状况下，尚不清楚M. tb在机体的细胞内、外的寄生 情况和数量。前述的重组腺病毒的优势在于仅对细胞内寄生的M.tb治疗有效，但游离在细 胞外的M.tb仍可导致疾病。因此，应用前述的重组腺病毒为基础的TB基因治疗药物的疗效 仍有待提局。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的W上缺陷或改进需求，本发明提供了一种TB基因药物及其制备方 法，其目的在于通过在腺病毒基因组中整合细胞内及细胞外颗粒溶素蛋白表达系统，通过 优化剂量比例，同时杀伤细胞内、外的M.tb,从而提供一种高效治疗TB的基因药物，尤其适 用于MDR-TB的治疗和潜伏感染的防治，由此解决现有技术没有基于重组腺病毒的TB基因治 疗药物的技术问题。
[0006] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种TB基因药物，所述TB基因药 物W腺病毒为基因表达载体，表达细胞内颗粒溶素蛋白W及细胞外颗粒溶素蛋白，所述细 胞内颗粒溶素蛋白W及细胞外颗粒溶素蛋白的表达量在2:8至8:2之间。
[0007] 优选地，所述TB基因药物，其腺病毒滴度在1 〇1中即/ml至1 〇i2PFU/ml之间。
[000引优选地，所述TB基因药物，其包括用于表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一重组腺病 毒w及用于表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二重组腺病毒。
[0009]优选地，所述TB基因药物，其第一腺病毒，其重组腺病毒基因组的E1缺失区整合有 用于表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列，所述第一序列为：
[0010] (1)由SEQ ID No.l所示的基因序列；或
[0011] (2)与序列SEQ ID No.l限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋 白质的氨基酸序列;或
[0012] (3)SEQ ID No.l限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达 产物具有与序列SEQ ID No.l表达蛋白具有同等活性的基因序列。
[0013] 优选地，所述TB基因药物，其第二腺病毒，其重组腺病毒基因组的E1缺失区整合有 用于表达细胞外颗粒溶素的第二序列。
[0014] 所述第二序列为：
[001引 A、由沈Q ID No.2所示的基因序列；或
[0016] B、与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋 白质的氨基酸序列;或
[0017] C、SEQ ID No.2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产 物具有与序列SEQ ID No.2表达蛋白具有同等活性的基因序列。
[0018] 按照本发明的另一个方面，提供了一种所述TB基因药物的制备方法，其包括W下 步骤：
[0019] 步骤1、将表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列W及表达细胞外颗粒溶素蛋白的 第二序列分别整合到穿梭质粒上，形成细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒W及细胞外颗粒 溶素蛋白基因穿梭质粒；
[0020] 步骤2、将步骤1获得的细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒W及细胞外颗粒溶素蛋 白基因穿梭质粒分别与骨架质粒共转染宿主细胞，获得表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一腺 病毒和表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二腺病毒；
[0021] 步骤3、将第一腺病毒与第二腺病毒分别纯化，并按照数量比例2:8至8:2混合，即 制得本发明提供的基因药物。
[0022] 优选地，所述的制备方法，其将腺病毒滴度稀释到1 〇1 V即/ml至1 〇i2PFU/ml之间。
[0023] 优选地，所述的制备方法，其第一序列为：
[0024] (1)由SEQ ID No.l所示的基因序列；或
[0025] (2)与序列SEQ ID No.l限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋 白质的氨基酸序列;或
[0026] (3)SEQ ID No.l限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达 产物具有与序列SEQ ID No.l表达蛋白具有同等活性的基因序列。
[0027] 优选地，所述的制备方法，其第二序列为：
[0028] A、由沈Q ID No.2所示的基因序列；或
[0029] B、与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋 白质的氨基酸序列;或
[0030] C、SEQ ID No.2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产 物具有与序列SEQ ID No.2表达蛋白具有同等活性的基因序列。
[0031] 按照本发明的另一方面，提供了一种TB治疗型疫苗，其包括本发明提供的TB基因 药物。
[0032] 总体而言，通过本发明所构思的W上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有 益效果：
[0033] 本发明提供的一种TB基因药物，通过联合细胞内和细胞外颗粒溶素重组腺病毒， 一次性给药，相对于单独使用细胞内和细胞外颗粒溶素重组腺病毒，能更好地治疗原发性 TB，甚至MDR-TB。而且，能清除潜伏感染者体内的Μ. tb，具有良好效果，可作为成人TB的治疗 型疫苗。优选地，采用对正常细胞无毒性的颗粒溶素表达基因，大大提高了TB基因药物的安 全性能。
【附图说明】
[0034] 图1是颗粒溶素重组腺病毒的结构示意图及表达证实。细胞内颗粒溶素重组腺病 毒(rA化GLi)的结构示意图（图1A)及在感染的肥K293细胞中颗粒溶素 mRNA水平的证实表达 图（图1B);细胞外颗粒溶素重组腺病毒(rA化GLs)的结构示意图（图1C)及在感染的皿K293 细胞中颗粒溶素 mRNA水平的证实表达图（图1D)。
[0035] 图2是不同比例rA化GLi和rA化GLs联合治疗原发性TB小鼠模型两个月后的治疗效 果（η = 6)。其中图 2A是 1 OrAdh化i +0rAdhGLs (rAdhGLi : rAdhGLs = 10 : 0)、8rAdhGLi + 2rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs = 8:2)、5rAdhGLi+5rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs = 5:5)、 2r A化化i+8r A化化s (r A化化i : r A化化s = 2:8)及Or A化化i+1 Or A化化s (r A化化i : r A化化s = 0 :10)分别治疗原发性TB小鼠模型的肺脏菌落计数结果；图2B是lOrA化化i+化AdhGLs (rA化化i :rA化化s = 10: 0)、化A化化i+2rA化化s(rA化化i :rA化化s = 8 : 2)、5rA化化i + 5'八(11161^3('4(11161^;[:'4(11161^3 = 5:5)、2'4(111化1+8'4(11161^3('4(11161^;[:'4(11161^3 = 2:8)及 OrA化GLi+1 OrA化化s (rA化化i : rA化化s = 0:10)分别治疗原发性TB小鼠模型的脾脏菌落计 数结果。PBS组和野生型腺病毒AdNull分别为阴性对照。Bar表示P<0.05。
[0036] 图3 rA化化i和rA化化S联合治疗小鼠 MDR-TB模型两周后的治疗效果(n = 6)。其中 图3a是rA化化i和rA化化S单独治疗，W及rA化化i+rA化化S联合治疗治疗小鼠 MDR-TB模型的 肺脏菌落计数结果；图3b是治疗小鼠 MDR-TB模型的脾脏菌落计数结果。PBS组和畑Z治疗组 (异烟阱:H、利福平:R和邮嗦酷胺:Z)分别为阴性对照。Bar表示P<0.05。
[0037] 图4 rA化GLi和rA化GLs联合治疗小鼠 MDR-TB的肺脏病理的皿染色（scale bar， 400皿)和抗酸染色(AF，scale bar，50皿）dPBS组和R监治疗组分别为阴性对照。
[003引图5 rA化GLi和rA化GLs联合治疗TB潜伏感染小鼠的治疗效果(η = 6)。其中图5a是 rA化化巧日rA化化S单独治疗，W及rA化化i+rA化化S联合治疗组治疗TB潜伏感染小鼠的肺 脏菌落计数结果；图化是治疗TB潜伏感染小鼠的脾脏菌落计数结果。PBS组和野生型腺病毒 AdNul 1分别为阴性对照。Bar表示P<0.05。
[0039] 图6 rAdhGLi和rAdhGLs联合治疗治疗TB潜伏感染小鼠的肺脏病理皿染色（scale bar，400皿)和抗酸染色(AF，scale bar，50皿）JBS组和野生型腺病毒AdNul 1分别为阴性对 照。
【具体实施方式】
[0040] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并 不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所设及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可W相互组合。
[0041] 本发明提供的TB基因药物，其W腺病毒为基因表达载体，表达细胞内颗粒溶素蛋 白W及细胞外颗粒溶素蛋白，所述细胞内颗粒溶素蛋白W及胞外颗粒溶素蛋白的表达量在 2:8至8:2之间。
[0042] 优选地，所述TB基因药物，其腺病毒的滴度在1〇1中即/ml至l〇i2PFU/ml之间。
[0043] 所述TB基因药物，优选包括用于表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一重组腺病毒W及 用于表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二重组腺病毒。
[0044] 所述第一腺病毒，其重组腺病毒基因组的E1确失区整合有用于表达细胞内颗粒溶 素蛋白的第一序列。
[0045] 所述第一序列为：
[0046] (1)由SEQ ID No.l所示的基因序列；或
[0047] (2)与序列SEQ ID No.l限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能 蛋白质的氨基酸序列;或
[004引（3)SEQ ID No.l限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达 产物具有与序列SEQ ID No.l表达蛋白具有同等活性的基因序列。
[0049]所述第二腺病毒，其重组腺病毒基因组的E1确失区整合有用于表达细胞外颗粒溶 素蛋白的第二序列。
[(K)加]所述第二序列为：
[0化1] A、由沈Q ID No.2所示的基因序列；或
[0052] B、与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋 白质的氨基酸序列;或
[0053] C、SEQ ID No.2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产 物具有与序列SEQ ID No.2表达蛋白具有同等活性的基因序列。
[0054] 本发明提供的TB基因药物，其制备方法包括W下步骤：
[0055] 步骤1、将表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列W及表达细胞外颗粒溶素蛋白的 第二序列分别整合到穿梭质粒上，形成细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒(pD化化i)W及 细胞外颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒(pDChGLs);
[0056] 所述第一序列，优选为：
[0化7] (1)由SEQ ID No.l所示的基因序列；或
[005引（2)与序列SEQ ID No.l限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋 白质的氨基酸序列;或
[0059] (3)SEQ ID No.l限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达 产物具有与序列SEQ ID No.l表达蛋白具有同等活性的基因序列。
[0060] 所述第二序列，优选为：
[0061 ] A、由沈Q ID No.2所示的基因序列；或
[0062] B、与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋 白质的氨基酸序列;或
[0063] C、SEQ ID No.2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产 物具有与序列SEQ ID No.2表达蛋白具有同等活性的基因序列。
[0064] 步骤2、将步骤1获得的细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒(pDChGLi)W及细胞外 颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒(pDChGLs)分别与骨架质粒共转染宿主细胞，获得表达细胞内 颗粒溶素蛋白的第一腺病毒（rAdhGLi)和表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二腺病毒 (rAdhGLs)；
[0065] 步骤3、将第一腺病毒与第二腺病毒分别纯化，并按照数量比例2:8至8:2混合，即 制得本发明提供的基因药物。
[0066] 优选地，所述基因药物的制备方法，将腺病毒滴度稀释到l〇iDp即/ml至1〇1中即/ml 之间。
[0067] 颗粒溶素属于皂角素样蛋白（saposin-like protein,SAPLIP)家族成员，是由人 细胞毒性T细胞(CTLs)、丫 δΤ淋己细胞及自然杀伤(NK)细胞表达的一种蛋白因子，与穿孔素 及颗粒酶共同存在于运些细胞的溶细胞颗粒中，并随溶细胞颗粒分泌产生。通过溶细胞颗 粒中的穿孔素在祀细胞表面打孔后，颗粒溶素进入祀细胞内，可与细胞内的病原微生物接 触，是目前唯一的存在于溶细胞颗粒中的、可直接杀伤细胞内包括M.tb在内的病原微生物 的蛋白质分子，在机体抗感染免疫中具有重要作用。但是，颗粒溶素的分子量较小，仅为 9kDa，本身并不能穿透细胞膜，只有在穿孔素的帮助下，它才能进入细胞并杀伤细胞内吞隧 的细菌，运无疑阻碍了临床应用颗粒溶素作为基因药物杀伤病原微生物、尤其是M.tb。尽管 如此，目前仍不清楚在不同的疾病状态下，M.tb在感染机体内具体是寄居在细胞内、还是在 细胞外，或同时寄居细胞内外及各自的比例。
[0068] 腺病毒作为一种常见的基因表达载体，可用于介导外源基因在机体的表达。因此， 本发明综合利用重组腺病毒表达载体和颗粒溶素各自的优势，建立表达颗粒溶素的重组腺 病毒，作为TB治疗的基因药物，W满足TB治疗的临床需要。
[0069] 然而，现有的整合有颗粒溶素的重组腺病毒，如果整合完整序列的颗粒溶素基因， 则对正常细胞也有毒性作用，因此本发明通过分子克隆技术将颗粒溶素基因序列剪切修 饰，得到如序列表SEQ ID No.1所示的基因序列，已通过实验证实其对动物整体水平或细胞 水平均具有安全性。然而，单纯利用细胞内颗粒溶素的重组腺病毒，仅能杀伤寄居在细胞内 的M.tb,而对细胞外寄居的M.tb无效。因此本发明增加了细胞外颗粒溶素蛋白表达基因，其 连接颗粒溶素蛋白与TPA信号肤，得到能在细胞外表达的颗粒溶素蛋白基因序列，如序列表 SEQ ID No.2所示的基因序列，其表达的颗粒溶素氨基酸见表SEQ ID No.3。结合细胞内、细 胞外分泌的颗粒溶素，本发明提供的基因药物，治疗原发性TB和MDR-TB具有突破性的疗效； 更为重要的是，能清除潜伏在感染者体内的M.tb,从而起到良好的控制潜伏感染的效果。
[0070] 实验显示，本发明提供的重组颗粒溶素腺病毒应用于制备TB治疗型疫苗，在小鼠 原发感染M.忧、MDR-TB和潜伏感染M.忧模型都获得显著的治疗效果，能有效防治TB。
[0071] W下为实施例：
[0072] 实施例1细胞内颗粒溶素重组腺病毒（rAdhGLi)和细胞外颗粒溶素重组腺病毒 (rA化GLs)的包装和纯化
[0073] 1)按照常规分子克隆技术，分别将SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2的基因序列克隆入 腺病毒-大肠杆菌穿梭载体PDC316，获得重组质粒pD化化i和pD化化s，经酶切鉴定和测序证 实。
[0074] 2)将质粒pDCh化i(或pDCh化S)和骨架质粒pBHGloxAEl，3Cre(l:l)共转染 HEK293细胞，包装重组病毒rA化GLi (或rA化GLs)。
[0075] (1)接种生长状态良好的皿K293细胞于六孔板，每孔5 X 105个细胞，37 °C，5 % C02 细胞培养箱中培养18-24小时，使细胞的汇合度达到90%左右。弃培养基，每孔加入ImL不含 抗生素的DMEM完全培养基。
[0076] (2)DNA-Lipofectamine? 2000复合物的制备：用125化不含血清的DMEM培养基，分 别稀释化g质粒pDCh化i(或pD化化S)和化g质粒pBHGlox ΔΕ1，3Cre(l: 1)，终体积250yL，吹 打混匀；取10化Lipofectamine? 2000加入到24化L不包含血清的DMEM培养基中，总体积 25化L，吹打混匀，室溫解育5分钟；将混合稀释的质粒加入到等量稀释的Lipofectamine? 2000中，吹打混匀，室溫解育20分钟，W便允许复合物的形成。
[0077] (3)将混匀后的质粒-Lipofectamine? 2000复合物共50化L逐滴加入到含细胞的 培养基中，混和均匀。37°C，C02培养箱解育过夜。
[0078] (4) 24小时后，弃培养基，更换2mL新鲜DMEM完全培养基。
[0079] (5)48小时后，膜酶消化细胞，转移入更大的培养皿扩大培养。运时起细胞将产生 细胞病变效应，并产生病毒，W及感染更多的细胞。W后每2-3天更换新鲜DMEM完全培养基。
[0080] (6)转染后第十天，观察细胞单层是否有桐，如有细胞死亡，细胞病变效应(CPE)区 域达80 %，即可收集。如无明显CPE，可补充新鲜培养基，继续观察，直至C阳达80 %。
[0081] (7)收集病毒，将部分已发生病变但尚且贴壁的细胞轻轻地吹打下来，收集细胞。- 80°C放置30分钟后置于37°C水浴解融15分钟，重复冻融2次。30(Κ)巧m室溫离屯、15分钟，将上 清分装至1.5mL无菌EP管中-80 °C冻存。
[0082] 3)大量制备重组腺病毒rA化GLi或rA化GLs
[0083] (1)在75cm2培养瓶中扩大培养肥K293细胞，使其密度达到70%- 100%。
[0084] (2)弃培养基，缓慢加入初次包装rA化化i或rA化化S病毒悬液2mL/培养瓶。感染1 小时后，加入DMEM完全培养基。
[0085] (3)当大部分细胞都出现病变现象后（约3-4天），收集细胞及培养基。通过-80°C放 置30分钟后置于37°C水浴解融15分钟，重复冻融3次充分裂解细胞释放病毒颗粒。300化pm， 4°C离屯、10分钟，收集含有病毒颗粒的上清液，-80°C保存备用。
[0086] 4)CsCl密度梯度离屯、纯化病毒颗粒
[0087] (1)每lOOmL收集的病毒上清中加入50血病毒沉淀液(20%EG8000，2.5M化C1)，冰 浴1小时W沉淀病毒。12000巧m离屯、20分钟，弃上清，将沉淀物悬浮在lOmL密度为l.lOg/mL 的CsCl溶液中（溶剂为20mM Tris-HCl，pH 8.0)4°C7000巧m离屯、5分钟，收集病毒悬浮液。 [008引（2)在超速离屯、管中加入2.0mL的1.40g/mL CsCl溶液（溶剂同上），再加入 3.01^1.30旨/1^的〔3(：1溶液。最后加入51^的病毒悬浮液，22800巧111，4°(：离屯、2.5小时。收集 密度在1.30-1.40g/血之间的病毒条带至透析袋中。在透析缓冲液(50g薦糖，10血1M抑为 8.0的Tris-HCl液，2mL 1M MgC12溶液定容至lOOOmL)中，4°C透析过夜，中间更换透析液一 次。
[0089] 5)基因药物和疫苗制备：
[0090] 收集病毒，加入病毒保存液，分装，即制成相应的基因药物和疫苗。保存于-80°C， 备用。
[0091] 6)重组腺病毒滴度检测
[0092] (1)24孔板中加入ImL 5.0X105个/血的细胞悬液，37°C、5%C02培养。
[0093] (2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，然后依次将10-5至10-8稀释的病毒液加入 24孔板中，每孔加入10化L。
[0094] (3)感染48小时。去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇50化L，-20°C 固定20分钟。
[0095] (4)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5分钟。
[0096] (5)加入200μΙ 1%BSA 37°C封闭 1小时。
[0097] (6)加入2(Κ)化的一抗溶液至每个孔中，37°C解育1小时。
[0098] (7)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5分钟。
[0099] (8)加入200化的二抗至每孔，37 °C解育1小时。
[0100] (9)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5分钟。
[0101] (10)加入20化L新配置的工作液至每孔，室溫解育5-10分钟。
[0102] (11)弃工作液，使用PBS清洗2次，每孔加入ImL PBS。
[0103] (12)每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10X物镜下计算阳性细胞个数。
[0104] (13)计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度。
[01化]实施例2RT-qPCR证实rA化GLi或rA化GLs感染细胞后，颗粒溶素 mRNA水平的表达
[0106] 1)八(1伽11^八化61^巧化八化61^3分别感染肥1(293细胞
[0107] (1)膜蛋白酶消化状态良好的肥Κ29：3Τ细胞，加入DMEM完全培养基重悬并计数，W5 X 1〇5的细胞总数接种于六孔板的每一个孔中，补加 DMEM完全培养基至2ml，置入37°CC02培 养箱中培养18-2地。
[010引 （2)弃去每孔旧培养基，加入2ml不含抗生素 DMEM完全培养基，AdNul 1、rA化GLi和 rA化GLs分别WM0I值为10的感染计量感染HEK293T，培养72h。
[0109] (3)用无菌1.5ml EP收集细胞悬液，lOOOrpm/min离屯、lOmin，弃上清收集细胞沉 淀，用无菌PBS洗涂细胞2次，离屯、弃上清，每个EP管中加入1ml化izol冰上反复吹打混匀， 使细胞充分裂解，冻存在-80°C冰箱备用。
[0110] 2)细胞总RNA提取：
[0111] (1)取出放置在-80°C冰箱中的标本，室溫放置5-1 Omin，使其充分融化。
[0112] (2)4°C下12000巧m离屯、5min，用新的EP管收集上清。
[0113] (3)W每1ml Trizol加入0.2ml氯仿的比例，每管加入0.2ml的氯仿，剧烈摇荡离屯、 管 15sec，4°C 下 12000巧m 离屯、15min。
[0114] (4)吸取上层水相于一新EP管中，加入等体积的异丙醇，室溫放置10分钟后，4°C下 12000rpm 离屯、lOmin。
[0115] (5)弃去上清液，每EP管内加入lml-2(TC预冷75%乙醇（750μ1乙醇+250μ1 DEPC 水），上下颠倒ΕΡ管数次混匀后，4°C下8000巧m离屯、5min。
[0116] (6)小屯、弃去上清液，室溫干燥10-15min，然后加入20μ1 DEPC水，使RNA溶解到 DEPC水中。
[0117] 3)RT-qPCR检测AdNulUrA化GL巧日rA化化s分别感染肥K293细胞后颗粒溶素 mRNA 表达水平：
[0118] (1)引物设计:根据设计的颗粒溶素基因序列，设计定量PCR的引物序列如下：
[0119] 颗粒溶素上游引物序列：5 'GATAAGCCCACCCAGAGAAG 3 '
[0120] 颗粒溶素下游引物序列：5'GATCTGCTGGGCAGTTTCTC 3'
[0121] 内参β-actin上游引物序列：5'TTCTACAATGAGCTGCGTG 3'
[0122] 内参e-actin下游引物序列：5'CTCAAACATGATCTGGGTC 3'
[0123] (2)RNA浓度测定：另取3支1.5ml EP管，分别加入9祉1的DEPC水，再分别加入化1的 RNA，用巧pendof f核酸蛋白检测仪进行RNA纯度和浓度的测定。
[0124] (3)总RNA逆转录成cDNA:每化g RNA采用Thermo Scientific公司的逆转录试剂盒 逆转录成cDNA，操作按说明书进行：
[0125] 按W下反应体系加入
[0126] 总RNA化邑
[0127] oligo(dT)18p;rime;r 化1
[0128] 加入无 RNA酶的ddH20补足至12μ1;混匀后瞬时离屯、，PCR仪65°C下放置5min，然后 迅速置于冰上5min。
[0129] 继续加入 5X.R:6aetj.i.onBuf.fer 4 μ 1 民ib'o'Loek RNase Inhibitor 1 片1
[0130] 10 iTiM clNTP \I：x 2μ1 Rovoi'tAi d M-Mul.V Revo r so 1.μ.1 Tr'a.n.s'cri..pt.ase
[0131] 总体积20μ1，混匀后瞬时离屯、，放入PCR仪中42 °C 60min，70 °C 5min。
[0132] (4)定量PCR反应
[0133] 定量PCR反应体系如下表所示。
[0134] 表定量PCR反应体系
[0135]
[0136] PCR反应程序如下表所示。
[0137] 表PCR反应程序 [013 引
[0139] (5)实验结果见图1:其中图1B为RT-qPCR检测rA化GLi的颗粒溶素 mRNA表达水平， rA化GLi相对于野生型对照病毒AdNull高表达颗粒溶素；图1D为RT-qPCR检iirA化GLs的颗 粒溶素 mRNA表达水平，rAdhGLs相对于野生型对照病毒AdNull高表达颗粒溶素，且和 rAdhGLi相比的水平相当。
[0140] 实施例4重组腺病毒rA化GLi和rA化GLs联合治疗小鼠 M.忧册7Rv的原发感染
[0141] 1)原发实验动物模型的建立及分组：
[0142] SPF 级 C57BL/6 小鼠，雌性，6-8 周龄。
[0143] 小鼠适应环境后，腹腔注射0.8%戊己比妥钢12化1，即0.96mg/每15g小鼠体重麻 醉小鼠。5-10分钟后小鼠处于麻醉状态，分别用H37RV标准毒株，用量程为50μ1的滴鼻针，取 1〇μ1滴鼻感染所有小鼠。次日处死小鼠3只，肺脏细菌计数，确定感染实际约剂量为200CFU/ 只。
[0144] H37RV感染小鼠2周后，根据实验需要，将实验动物随机分为5组，每组6只：阴性对 照PBS组；对照病毒AdNul 1组；lOrAdh化i+OrA化化S(rA化化i : rAdh化S = 10 : 0)治疗组、 8rAdh化i+化A化化S (rAdhGLi : rAdh化S = 8 : 2)治疗组、5rAdh化i+5rAdh化S (rA化GLi : rA化化S = 5:5治疗组）、2rA化化i+8rA化化S (rA化化i : rA化化S = 2:8)治疗组及OrA化化i+ 1 OrAdhGLs (rAdhGLi : rAdhGLs = 0:10)治疗组。
[0145] 腹腔注射0.8 %戊己比妥钢12化1，即0.96mg/每15g小鼠体重麻醉小鼠。5-10分钟 后，小鼠处于麻醉状态。PBS组：取10μ1无菌PBS滴鼻每只小鼠；AdNull组：取病毒滴度为1* 109PFU，体积15μ1滴鼻每只小鼠；rAdhG^+rA化GLs治疗组:分别按照相应的比例，取病毒滴 度为1.00*l〇iipFU/ml rA化化i和病毒滴度为1.10*l〇iip即/ml rA化化S，每组均配制成总病 毒1*109PFU，滴鼻治疗各组中的每只小鼠。整个实验过程中治疗仅一次。
[0146] 2)肺脏和脾脏的荷菌量分析
[0147] 治疗2个月后，处死各组小鼠。W75%酒精浸泡消毒lOmin，无菌取出肺脏和脾脏， 称取全肺脏重量和用于病理分析的肺脏重量;将剩余肺脏和全部脾脏，按照每脏器分别加 入2ml无菌1XPBS，在无菌匀浆器内充分并研磨，转移到5ml无菌管中，振荡器充分混匀。取 100μΙ原液加入到90化1 PBS中做倍比稀释，振荡器充分混匀后，取4个稀释度的菌液各10化 1涂布含有lOOmg/L氨节青霉素、50mg/L簇节青霉素、2.5mg/L两性霉素 Β和25mg/L多黏菌素 Β 的7H11固体培养皿中。同1个稀释度的菌液分别涂布Ξ格平板。剩余原液保存在-80°C冰箱 备用。平皿放于37Γ培养箱培养3~4周后进行菌落计数。根据计数结果，计算成单个脏器所 含菌落总数，WLogio(CFU)进行荷菌量分析。计算各组的均值和标准误。
[0148] 实验结果见图2,治疗2个月后各组小鼠肺脏和脾脏的荷菌量。其中PBS阴性对照组 和野生型病毒AdNull对照组小鼠的肺脏和脾脏的荷菌量相当，无统计学差异，即：腺病毒本 身不影响感染小鼠的荷菌量。单独使用rA化化i(lOrA化化i+OrA化化S，rA化化i : rA化化S = 10:0)治疗组或rA化化s(0rA化化i+lOrA化化S，rA化化i : rA化化S = 0:10)治疗组，肺脏和脾 脏的荷菌量也分别显著低于PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组(p<0.05)。而且，rA化化i 的治疗效果优于rA化化s(p<0.05)。运些结果，一方面表明细胞内颗粒溶素腺病毒和细胞 外颗粒溶素腺病毒，依据各自杀伤细胞内、或细胞外的M.tb的作用，均对原发TB具有治疗效 果;另一方面也表明机体在TB原发感染小鼠模型，M.tb主要是寄居在细胞内，一部分寄居在 细胞外，为本专利申请的联合不同比例的细胞内、外颗粒溶素腺病毒治疗提供了理论基础。
[0149] 特别值得注意的是，不同剂量比例的rA化化i+rA化GLs联合治疗组小鼠的肺脏和脾 脏的荷菌量，均显著低于PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组(p<0.001);而且，不同比例 联合组相互之间无显著差异;尤其是，运些联合治疗组的肺脏和脾脏的荷菌量，均显著低于 rA化化i(lOrA化化i+OrA化化S，rA化化i : rA化化S = 10: 0)治疗组或rA化化S(OrAdh化i + 1 Or A化GLs，r A化GL i : r A化GLs = 0:10)治疗组(P < 0.0 01)。因此，不同剂量比例的r A化化i+ rA化化s联合治疗组小鼠肺脏和脾脏的荷菌量最低，即联合r A化化i+rA化化s治疗TB原发感 染小鼠模型的效果最好。
[0150] 实施例5联合重组腺病毒rA化GLi和rA化GLs治疗小鼠 MDR-TB
[0151] 1)实验动物模型的建立及分组：
[0152] SPF 级C57BL/6小鼠，雌性，6-8 周龄，14-16g，动物合格证 No. 11401300025148，许可 证号 SCXK(京)2014-0004。
[0153] 实验动物随机分为5组，每组6只：阴性对照PBS组;rA化化i治疗组;rA化化S治疗组； rA化化i+rA化化S联合治疗组(rA化化i+s联合治疗组）和畑Z治疗组（异烟阱:H、利福平:R和 邮嗦酷胺:Z)。
[0154] 小鼠麻醉处理同前。取10μ1 MDR-TB菌悬液滴鼻感染滴鼻感染所有小鼠。次日处死 3只小鼠，肺脏细菌计数，确定感染实际约剂量为60CFU/只。
[01对 2周后，同上麻醉。分别PBS组取10μ1无菌PBS滴鼻每只小鼠；rAdh化i治疗组和 rA化化i单独治疗组和rA化化i+s联合治疗组的治疗剂量同前。畑Z治疗组采用标准化治疗 方案，即lOmg/kg/day RIF(利福平）、25 mg/kg/day 1畑(异烟阱）、150mg/kg/day PZA川比嗦 酷胺)联合治疗，灌胃，5天/周，1次/天。
[0156] 2)肺脏和脾脏的荷菌量分析
[0157] 治疗2周后，处死小鼠，W75%酒精浸泡消毒lOmin，无菌取出肺脏和脾脏。进行肺 脏和脾脏脏器细菌计数，计数方法同前。
[0158] 实验结果见图3,治疗两周后MDR-TB小鼠肺脏和脾脏的荷菌量。其中PBS阴性对照 组和R监治疗组小鼠的肺脏和脾脏的荷菌量相当，无统计学差异，也证实标准化学治疗方案 对MDR-TB无效。但是，单独rA化化i治疗组或r A化化S治疗组小鼠的肺脏（图3a)和脾脏（图3b) 的荷菌量，均分别明显低于PBS阴性对照组和R监治疗组(p<0.05)，即：rA化化i和rA化化期 对小鼠体内MDR-TB都具有直接杀伤作用，尽管在肺脏，rA化化i的治疗效应强于rA化化s(p< 0.05)。最重要的是，在所有组中，rA化化i+rA化化S联合治疗组小鼠肺脏和脾脏的荷菌量最 低(P <0.05)，既低于单独的rA化化域rA化化S治疗组，也低于PBS阴性对照组和畑Z治疗组 (p<0.05)，即联合'4化6以+'4化61^5治疗小鼠101?-了8感染的效果最好。
[0159] 3)肺脏组织病理学评价
[0160] 每组随机采取3只小鼠左肺上叶，放入4%多聚甲醒固定，石蜡包埋，切片，分别皿 染色和抗酸染色(AF)。由病理医师盲法评价肺部组织结构的破坏和炎性细胞浸润情况W及 MDR-TB感染情况，并出具病理报告。
[0161 ] 实验结果见图4。其中PBS阴性对照组和R监治疗组小鼠的肺组织的病变效应较重， 明显炎性细胞浸润;抗酸染色后，可见PBS阴性对照组和畑Z治疗组肺组织切片中有大量的 抗酸杆菌。rA化化i治疗组、rA化GLs治疗组和rA化化i+rA化化S联合治疗组小鼠肺部组织病 变，均较PBS阴性对照组和畑Z治疗组明显改善。其中，rAdh化i+rAdhGLs联合治疗组效果最 好，rA化化i治疗组和rA化化S治疗组次之，；抗酸染色后，rA化化i治疗组和rA化化S治疗组 肺组织切片有散在分布的抗酸杆菌，rA化GLi+rA化化S联合治疗组未见抗酸杆菌。
[0162] 实施例6联合重组腺病毒rA化GLi和rA化GLs控制小鼠 M.忧册7Rv的潜伏感染
[0163] 1)潜伏实验动物模型的建立及分组：
[0164] SPF级C57BL/6雌性小鼠，雌性，6-8周龄，18-20g，共33只小鼠。动物合格证 No. 42000500004938，许可证号 SCXK2014-0004。饲养于 Ventirack 动物饲养柜。
[0165] 先将30只小鼠用卡介苗经背部皮下免疫，免疫剂量为106C即/只。4周后，同前麻醉 小鼠。取10μ1 M.忧H37RV菌悬液滴鼻感染所有小鼠。次日处死3只未免疫小鼠，肺脏细菌计 数，确定感染实际约剂量为200CFU/只。
[0166] 免疫8周后，根据实验需要，将实验动物随机分为5组，每组6只：阴性对照PBS组;对 照病毒AdNul 1组；rA化化i治疗组；rA化化S治疗组;rA化化i甘A化GLs联合治疗组(rA化GLi+s 联合治疗组）。同前麻醉小鼠。
[0167] 分别PBS组取10μ1无菌PBS滴鼻每只小鼠；各病毒组的剂量同前。
[0168] 2)肺脏和脾脏的荷菌量分析
[0169] 治疗4周后，处死小鼠，W75%酒精浸泡消毒lOmin，无菌取出肺脏和脾脏。同前进 行脏器细菌计数。
[0170] 实验结果见图5,各组小鼠肺脏和脾脏的荷菌量。其中PBS阴性对照组和对照病毒 AdNull组小鼠的肺脏和脾脏的荷菌量相当，无统计学差异，即：腺病毒本身不影响小鼠荷菌 量。值得注意的是，r A化化i治疗组、r A化GLs治疗组和rA化化i+rA化GLs联合治疗组小鼠的肺 脏和脾脏的荷菌量，均分别明显低于PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组(p<0.05);而且， rA化GLs治疗组的肺脏和脾脏细菌荷菌量，略低于rA化化1治疗组，但无统计学差异。运些结 果，一方面表明rA化化i和rA化GLs单独使用，均对小鼠体内的潜伏感染的M.tb具有直接杀 伤作用；另一方面也表明在潜伏感染状态下，M.tb在感染机体内的定位，仍同时位于细胞 内、外。最重要的是，在所有实验组中，rA^Gk+rA化GLs联合治疗组小鼠肺脏和脾脏的荷菌 量，均最低(P<〇.〇5)，且显著低于rA化化谎疗组或rA化化S治疗组(p<0.05);特别是，该组 2/6小鼠肺脏和脾脏细菌被完全清除。因此，联合rA化化i+rA化化S治疗小鼠潜伏感染的效果 最好。
[0171] 3)肺脏组织病理学评价
[0172] 每组随机采取3只小鼠左肺上叶，放入4%多聚甲醒固定，石蜡包埋，切片，分别皿 染色和抗酸染色(AF)。由病理医师盲法评价肺部组织结构的破坏和炎性细胞浸润情况W及 结核分枝杆菌感染情况，并出具病理报告。
[0173] 实验结果见图6dPBS阴性对照组和对照病毒AdNull组小鼠的肺组织的病变效应较 重，明显炎性细胞浸润;抗酸染色后，PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组肺组织切片散在 分布少量的抗酸杆菌。rA化化i治疗组、rA化化S治疗组和rA化化i+rA化化S联合治疗组小鼠 肺部组织病变，分别较PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组明显改善，几乎接近于未感染状 态;其中rA化化i+rA化GLs联合治疗组效果最好，rA化化谎疗组和rA化化滿疗组次之;肺组 织切片抗酸染色后，rA化化i治疗组、rA化GLs治疗组和rA化化i+rA化化S联合治疗组，均未见 抗酸杆菌。
[0174] 本领域的技术人员容易理解，W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W 限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含 在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种结核病基因药物，其特征在于，所述结核病基因药物以腺病毒为基因表达载体， 表达细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外颗粒溶素蛋白，所述细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外 颗粒溶素蛋白的表达量在2:8至8:2之间。2. 如权利要求1所述的结核病基因药物，其特征在于，所述腺病毒滴度在101()PFU/ml至 IO12PFlVml 之间。3. 如权利要求1所述的结核病基因药物，其特征在于，包括用于表达细胞内颗粒溶素蛋 白的第一重组腺病毒以及用于表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二重组腺病毒。4. 如权利要求3所述的结核病基因药物，其特征在于，所述第一腺病毒，其重组腺病毒 基因组的El缺失区整合有用于表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列，所述第一序列为： (1) 由SEQ ID No. 1所示的基因序列；或 (2) 与序列SEQ ID No. 1限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋白质 的氨基酸序列;或 (3) SEQ ID No. 1限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物 具有与序列SEQ ID No. 1表达蛋白具有同等活性的基因序列。5. 如权利要求3所述的结核病基因药物，其特征在于，所述第二腺病毒，其重组腺病毒 基因组的El缺失区整合有用于表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二序列，所述第二序列为： A、 由SEQ ID No.2所示的基因序列；或 B、 与序列SEQ ID No. 2限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋白质 的氨基酸序列;或 C、 SEQ ID No.2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具 有与序列SEQ ID No.2表达蛋白具有同等活性的基因序列。6. 如权利要求1至5任意一项所述结核病基因药物的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤： 步骤1、将表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列以及表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二 序列分别整合到穿梭质粒上，形成细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒以及细胞外颗粒溶素 蛋白基因穿梭质粒； 步骤2、将步骤1获得的细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒以及细胞外颗粒溶素蛋白基 因穿梭质粒分别与骨架质粒共转染宿主细胞，获得表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一腺病毒 和表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二腺病毒； 步骤3、将第一腺病毒与第二腺病毒分别纯化，并按照数量比例2:8至8: 2混合，即制得 本发明提供的基因药物。7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将腺病毒滴度稀释到101()PFU/ml至 IO12PFlVml 之间。8. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一序列为： (1) 由SEQ ID No. 1所示的基因序列；或 (2) 与序列SEQ ID No. 1限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋白质 的氨基酸序列;或 (3) SEQ ID No. 1限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物 具有与序列SEQ ID No. 1表达蛋白具有同等活性的基因序列。9. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第二序列为： A、 由SEQ ID No.2所示的基因序列；或 B、 与序列SEQ ID No. 2限定的氨基酸序列同源性在80%值100%编码相同功能蛋白质 的氨基酸序列;或 C、 SEQ ID No.2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具 有与序列SEQ ID No.2表达蛋白具有同等活性的基因序列。10. -种结核病治疗型疫苗，其特征在于，包括如权利要求1至5任意一项所述的结核病 基因药物。
【文档编号】A61P31/06GK105879058SQ201610303281
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】范雄林
【申请人】华中科技大学