一种明胶/聚己内酯纳米纤维材料在外科术后防粘连中的应用
【专利摘要】本发明涉及一种明胶/聚己内酯纳米纤维材料的应用，所述的明胶/聚己内酯纳米纤维材料通过如下方法制得：将明胶和聚己内酯溶于三氟乙醇中，并向溶液中加入乙酸，搅拌至完全溶解，得到透明的明胶/聚己内酯纺丝液；抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上进行电纺，收集纤维膜进行真空干燥即得。其优点表现在：孔径小，能有效阻隔创面的接触，机体内炎症细胞的浸润。柔韧，能减少组织之间的摩擦还不易撕裂。生物相容性好，防粘连效果显著。以心脏术后防粘连为例，随着该材料的逐渐降解，机体自身细胞能够长入材料内部，形成具有生长活性的新生组织，并且该新生组织与周围心包组织融为一体，有效阻隔心脏与胸腔的粘连。
【专利说明】
一种明胶/聚己内酯纳米纤维材料在外科术后防粘连中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及组织工程技术领域，具体地说，是一种明胶/聚己内酯纳米纤维材料在外科术后防粘连中的应用。
【背景技术】
[0002]术后粘连是外科领域常见的临床现象，如脑外科，腹部外科，妇产科，心脏外科。若产生粘连，有的可导致严重的并发症，比如:脑外科开颅术后硬膜缺损，瘢痕粘连可引起术后癫痫;腹部外科手术后的粘连可引起肠梗阻，腹盆腔疼痛;妇产科手术后的宫腔粘连，严重的可导致不孕、周期性下腹痛;心脏术后心脏和胸腔的粘连可增加二次手术的风险，严重的可危及患儿的生命。因此，术后粘连是自手术史以来亟待解决的重要医学难题。目前解决粘连既简单又可靠的办法是采用所谓的“物理屏障”，即把材料置于组织的切口部位，对纤维组织的生长起阻隔作用。早期，国内外多采用硅胶，明胶海绵，透明质酸钠等作为隔离材料，防止粘连的发生，但它们都因各自的局限性而影响使用。硅胶在防粘连中应用较早，但是硅胶制品的组织相容性差，不能被机体吸收，作为异物长期存留可产生机械刺激作用。明胶海绵在术后早期具有一定的防粘连效果，但是明胶海绵吸血可发生膨胀，形成血肿，后期可诱导和加重瘢痕的形成。透明质酸钠具有消炎、止痛、促进伤口愈合的作用，但是透明质酸钠水溶性好，机械性能差，在体内易降解，仅在术后早期具有防粘连作用。近年来，国内外医学专家和材料专家将目光集中在生物可吸收膜上，构成膜的材料具有良好的生物相容性和血液相容性，在术后能有效隔离创面的接触，并且在完成隔离目的后能被人体降解吸收而不需要二次手术取出。同其它生物医用产品类同，我国目前的可吸收防粘连产品主要依靠进口。自主研发的产品品种较少，主要包括聚乳酸膜和壳聚糖膜，都存在着柔韧性不足，生物相容性欠佳等缺陷。因此开发新一代可吸收防粘连膜，是临床外科的迫切需要。
[0003]明胶是一种天然蛋白质，由胶原蛋白水解而来，其结构与生物体组织结构相似，因此具有良好的生物相容性。它在体内酶、盐等的作用下可自行降解，低分子产物可被人体吸收，或者通过排泄系统排出体外，而不会产生副作用，目前已被广泛用于食品及医药产业。
[0004]聚己内酯(po lycapro lactone，PCL)是经美国FDA认证、批准的一种医用可生物降解的合成材料，PCL降解后的产物为COdPH2O，对人体无毒，具有良好的生物相容性和优良的力学性能。目前已被广泛用于药物可控释放载体，细胞和组织培养支架，完全可降解手术缝合线等。
[0005]静电纺丝技术是一种利用电场力将聚合物溶液或熔体制备成纤维直径在几十纳米到几个微米的纳-微米超细纤维制备技术。静电纺丝技术所制备的纳-微米纤维支架具有高的比表面积、多孔结构，能仿生细胞外基质的组成和结构，从而为细胞的生长和功能发挥提供了一种类似天然细胞外基质的理想微环境，成为当今组织工程支架研究的热点。
[0006]然而，明胶是一种天然高分子材料，含有许多细胞结合位点，但生物降解太快，机械性能及电纺性能差。相反，聚己内酯是一种合成高分子材料，降解速率慢，机械性能好，容易电纺成丝，但没有细胞亲和位点，为了达到二者的优势互补，中国专利文献CN102242463A公开了一种静电纺制备明胶/聚己内酯复合纳米纤维膜的方法。将该纳米纤维膜作为支架，应用于组织工程软骨、皮肤的研究，实验表明:该材料生物相容性好，以软骨细胞作为种子细胞，该材料可构建出精细复杂的三维软骨组织。以软骨细胞和骨髓基质干细胞混合共培养作为种子细胞，形成的软骨组织亦非常均一稳定。以角质细胞作为种子细胞，新型明胶/聚己内酯材料有利于皮肤缺损的修复。但是关于本发明的一种明胶/聚己内酯纳米纤维材料在外科手术防粘连中的应用目前还未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中的不足，开发一种新的防粘连的材料，减轻病人的痛苦，减少外科手术后遗症，提高手术质量，提供一种明胶/聚己内酯纳米纤维材料在外科术后防粘连中的应用。
[0008]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种明胶/聚己内酯纳米纤维材料在制备外科术后防粘连的材料中的应用，所述的明胶/聚己内酯纳米纤维材料通过如下方法制得:将明胶和聚己内酯溶于三氟乙醇中，并向溶液中加入微量乙酸，搅拌至完全溶解，得到透明的明胶/聚己内酯纺丝液;抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上进行电纺，收集纤维膜进行真空干燥即得。
[0009]所述的防粘连为心脏术后防止心包粘连。
[0010]明胶和聚己内酯的质量比为1:0.1?10。优选地，明胶和聚己内酯的质量比为30:70?70:30。
[0011 ]明胶和聚己内酯的质量比为1:1。
[0012]乙酸在纺丝液中的体积比为0.1-2%。
[0013]乙酸在纺丝液中的体积比为0.2%。
[0014]所述的明胶/聚己内酯纳米纤维材料通过如下方法制得:将0.5g明胶与0.5g聚己内酯溶于1ml三氟乙醇中，并向溶液中加入20ul乙酸，搅拌至完全溶解，得到透明的明胶/聚己内酯纺丝液;抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上进行电纺，电纺参数为:电压8-12kv，接收距离10-15cm，注射速率l-5ml/h，温度18-28°C，相对湿度40-60%;采用滚筒作为接收装置，收集纤维膜然后放入真空干燥箱中除去残留的有机溶剂即得。
[0015]本发明优点在于:
[0016]1、本发明所制备的明胶/聚己内酯纳米纤维膜孔径小，能有效阻隔创面的接触，机体内炎症细胞的浸润。
[0017]2、本发明所制备的明胶/聚己内酯纳米纤维膜柔韧，能减少组织之间的摩擦还不易撕裂。
[0018]3、明胶/聚己内酯纳米纤维膜生物相容性好，防粘连效果显著。以心脏术后防粘连为例，随着该材料的逐渐降解，机体自身细胞能够长入材料内部，形成具有生长活性的新生组织，并且该新生组织与周围心包组织融为一体，有效阻隔心脏与胸腔的粘连。
【附图说明】
[0019]附图1:明胶/聚己内酯纳米纤维膜大体观(2X2cm)。
[0020]附图2:明胶/聚己内酯纳米纤维膜扫描电镜照片(放大1000倍)。
[0021]附图3:明胶/聚己内酯纳米纤维膜力学性能结果。
[0022]附图4:明胶/聚己内酯纳米纤维膜生物相容性结果(放大200倍)。
[0023]附图5:兔子心脏术后防粘连模型的建立。
[0024]附图6:明胶/聚己内酯(30:70)术后I个月大体观。
[0025]A:材料组开胸后大体观；
[0026]B:材料组开胸后大体观。
[0027]附图7:明胶/聚己内酯(50:50)术后I个月大体观。
[0028]A:材料组开胸后大体观；
[0029]B:材料组开胸后大体观。
[0030]附图8:明胶/聚己内酯(70:30)术后I个月大体观。
[0031]A:材料组开胸后大体观；
[0032]B:材料组开胸后大体观。
[0033]附图9:明胶/聚己内酯(50:50)术后2个月大体观。
[0034]A:阴性对照组开胸后大体观；
[0035]B:阳性对照组开胸后大体观；
[0036]C:材料组开胸后大体观；
[0037]D:材料组开胸后大体观。
[0038]附图10:明胶/聚己内酯(50:50)术后3个月大体观。
[0039]A:阴性对照组开胸后大体观；
[0040]B:阳性对照组开胸后大体观；
[0041 ]C:材料组开胸后大体观；
[0042]D:材料组开胸后大体观。
[0043 ]附图11:明胶/聚己内酯(50:50)术后6个月大体观。
[0044]A:阴性对照组开胸后大体观；
[0045]B:阳性对照组开胸后大体观；
[0046]C:材料组开胸后大体观；
[0047]D:材料组开胸后大体观。
【具体实施方式】
[0048]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0049]I材料与方法
[0050]1.1明胶/聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备
[0051]1.1.1明胶/聚己内酯(30:70)电纺纳米纤维膜的制备
[0052]将0.3g明胶与0.7g聚己内酯溶于1ml三氟乙醇中，并向溶液中加入1uI乙酸，搅拌24h至完全溶解，得到透明的明胶/聚己内酯纺丝液。选用1ml的注射器，1.2mm内径的针头，抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上进行电纺，参数为:电压8-12kv，接收距离10-15cm，注射速率2.5ml/h，温度18-28°C，相对湿度40-60%。采用滚筒作为接收装置，纺丝0.75h，得到明胶/聚己内酯纳米纤维膜，放入真空干燥箱中除去残留的有机溶剂备用。
[0053]1.1.2明胶/聚己内酯(50:50)电纺纳米纤维膜的制备
[0054]将0.5g明胶与0.5g聚己内酯溶于1ml三氟乙醇中，并向溶液中加入20ul乙酸，搅拌24h至完全溶解，得到透明的明胶/聚己内酯纺丝液。选用1ml的注射器，1.2mm内径的针头，抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上进行电纺，参数为:电压8-12kv，接收距离10-15cm，注射速率2ml/h，温度18-28°C，相对湿度40-60%。采用滚筒作为接收装置，纺丝lh，得到明胶/聚己内酯纳米纤维膜，放入真空干燥箱中除去残留的有机溶剂备用。
[0055]1.1.3明胶/聚己内酯(70:30)电纺纳米纤维膜的制备
[0056]将0.7g明胶与0.3g聚己内酯溶于1ml三氟乙醇中，并向溶液中加入30ul乙酸，搅拌24h至完全溶解，得到透明的明胶/聚己内酯纺丝液。选用1ml的注射器，1.2mm内径的针头，抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上进行电纺，参数为:电压8-12kv，接收距离10-15cm，注射速率1.5ml/h，温度18-28°C，相对湿度40-60%。采用滚筒作为接收装置，纺丝1.5h，得到明胶/聚己内酯纳米纤维膜，放入真空干燥箱中除去残留的有机溶剂备用。
[0057]1.2明胶/聚己内酯电纺纳米纤维膜的鉴定
[0058]1.2.1纳米纤维膜形貌的观察
[0059]将干燥后纳米纤维膜剪成小块，贴在载物台上镀金90秒，在1KV的加速电压下，用扫描电子显微镜(JSM-5600LV)观察静电纺纳米纤维的形态并拍照。基于所得SEM图像，使用分析软件ImageJ(NIH，USA)对制备的静电纺丝纳米纤维的直径进行测量。
[0060]1.2.2纳米纤维膜力学性能的检测
[0061]将明胶/聚己内酯电纺纳米纤维膜裁剪成矩形，长5cm，宽lcm，厚度约为0.2-
0.3mm，将所制得的样品放入PBS中浸泡2小时，然后固定于材料测试机(Instron-3343;USA)上，以I Omm/ m i η拉伸速度对样品进行拉伸测试。
[0062]1.2.3纳米纤维膜生物相容性测试
[0063]将成纤维细胞接种到消毒好的支架材料上，应用普通的10%FBS的高糖DMEM培养液进行培养，I和7天后，利用SEM及荧光显微镜观察细胞在支架上的生长情况。
[0064]1.3兔子心脏术后防粘连模型的建立。
[0065]选取2_3kg的新西兰大白兔作为模型动物，戊巴比妥(用量30mg/kg)麻醉，麻醉后进行气管插管并接入呼吸机，通气量为25ml/次，36次/min。胸骨正中皮肤切开，用直剪在胸骨正中开胸，并用胸骨撑开器撑开。阴性对照组:不做任何处理直接关胸。阳性对照组:分离胸腺及心底组织，识别心包，右心室外的心包纵行剪去大约2 X 2cm，用棉签摩擦心脏表面至点状出血，关胸。实验组:用棉签摩擦心脏表面至点状出血后，将纳米纤维膜裁剪成2 X 2cm方形(如图1所示)，消毒后置于缺损处，用6-Oproline缝线做四个角的固定并关胸。
[0066]1.4防粘连效果评价
[0067]术后一个月，戊巴比妥(用量60mg/kg)将兔子麻醉过量牺牲，正中开胸，并用胸骨撑开器撑开，分离胸骨和心包，观察心包是否和心脏表面粘连，并用高清相机进行拍照。
[0068]2 结果
[0069]2.1明胶/聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备
[0070]图1为通过静电纺丝技术所制备的纳米纤维膜的大体观，从大体上看，材料呈白色，质地柔软，大小可随意裁剪，厚度可任意控制。
[0071]2.2明胶/聚己内酯电纺纳米纤维膜的鉴定
[0072]2.2.1纳米纤维膜形貌的观察
[0073]图2为明胶/聚己内酯纳米纤维膜的扫描电镜照片，从图2中可以看出不同质量比的材料均能够电纺出丝，形成的纤维均一、连续、光滑。纤维孔径小，这样既有利于营养物质的运输，又能有效阻隔创面的接触，机体内炎症细胞的浸润。
[0074]2.2.2纳米纤维膜力学性能的检测
[0075]图3为所制备的明胶/聚己内酯纳米纤维膜湿态下的力学性能测试结果。图A为各自不同比例的材料的应力-应变曲线，图B为材料的最大拉伸强度，图C为材料的最大拉伸长度。从图中可以看出，随着明胶含量的逐渐升高，材料的拉伸强度显著降低，由4.4 ±
0.4310^(30:70)降到3.2±0.2810^(50:50)，最终降至1.1±0.07]\0^(70:30)。然而，材料的最大拉伸长度却出现了小幅度的上升，应变由1.75±0.30(30:70)升到2.1 ±0.18(50:50)，最终升至 2.4±0.39(70:30)。
[0076]2.2.3纳米纤维膜生物相容性测试
[0077]图4为明胶/聚己内酯纳米纤维膜生物相容性测试结果，从图中可以看出，明胶/聚己内酯纳米纤维膜生物相容性好，细胞在材料上生长良好，并未出现毒副现象，细胞种植在材料上I天后，已经有大量的细胞贴附在材料表面上生长，随着培养时间的延长，细胞不断增值，分泌大量的细胞外基质，相互接触并融合，7天时几乎覆盖住整个材料表面。
[0078]2.3兔子心脏术后防粘连模型的建立
[0079]图5A为将兔子正中开胸后，去掉部分心包组织，暴露出直径约15mm的缺口；图13为将图A中缺口下的心脏表面用棉签摩擦至点状出血，然后用图1中所示大小的各组材料做四个角的缝合固定，建立防粘连模型。
[0080]2.4术后防粘连效果评价
[0081]总体来看，阴性对照组由于没有破坏心包，开胸后心脏表面光滑，很容易与其它组织分离开，心脏与心包之间无任何粘连，各组织清晰可见。阳性对照组心包破损后直接关胸，心脏表面与心包，胸骨粘连严重，随着术后时间的延长，很难将各组织分离开，这将延长二次手术的时间和增加二次手术的难度，有时候会发生心脏大出血的危险。
[0082]对于材料组而言，当明胶/聚己内酯比例为30:70时，材料的力学性能好，手术操作方便，但是由于聚己内酯含量过高，材料亲水性差，硬度高，与心包表面的摩擦力度大。术后一个月材观察，发现粘连现象严重，材料紧紧粘贴在心脏表面，无法分割(图6)。当明胶/聚己内酯比例为50:50时，材料亲水性好，柔软光滑，材料的力学有轻微的下降，但是完全适合手术缝合操作。术后一个月取材观察，发现只有材料的边缘与心脏表面有轻微的粘连，手术器械很容易分离，分离后材料呈白色，有效阻隔心脏与胸腔的粘连(图7)。当明胶/聚己内酯比例为70:30时，由于明胶组分含量高，所制备的纳米纤维膜力学性能明显下降，手术时针线容易穿破材料，不适合外科缝合操作。手术勉强缝合后，一个月取材观察，发现粘连现象严重，并且材料已基本降解，无法完全阻止粘连的发生。(图8)。
[0083]优选地，本发明选用比例为50:50的明胶/聚己内酯纳米纤维膜作进一步的观察，从图9，图10，图11可以看出，随着术后时间的延长，明胶/聚己内酯纳米纤维膜已逐渐降解，机体自身细胞能够长入材料内部，形成具有生长活性的新生组织，并且该组织与周围心包组织融为一体，有效阻隔心脏与胸腔的粘连。
[0084]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种明胶/聚己内酯纳米纤维材料在制备防粘连的材料中的应用，其特征在于，所述的明胶/聚己内酯纳米纤维材料通过如下方法制得:将明胶和聚己内酯溶于三氟乙醇中，并向溶液中加入乙酸，搅拌至完全溶解，得到透明的明胶/聚己内酯纺丝液;抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上进行电纺，收集纤维膜进行真空干燥即得。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的防粘连为心脏术后防止心包粘连。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，明胶和聚己内酯的质量比为1:0.1?10。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，明胶和聚己内酯的质量比为1:1。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，乙酸在纺丝液中的体积比为0.1-2%。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，乙酸在纺丝液中的体积比为0.2%。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的明胶/聚己内酯纳米纤维材料通过如下方法制得:将0.5g明胶与0.5g聚己内酯溶于1ml三氟乙醇中，并向溶液中加入20ul乙酸，搅拌至完全溶解，得到透明的明胶/聚己内酯纺丝液;抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上进行电纺，电纺参数为:电压8_12kv，接收距离10-15cm，注射速率l-5ml/h，温度18-28°C，相对湿度40-60采用滚筒作为接收装置，收集纤维膜然后放入真空干燥箱中除去残留的有机溶剂即得。
【文档编号】A61L31/06GK105903089SQ201610296574
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】刘锦纷, 冯蓓, 洪海筏
【申请人】上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心