冬凌草甲素多孔微粒吸入剂及其治疗原发性肺癌的应用

冬凌草甲素多孔微粒吸入剂及其治疗原发性肺癌的应用
【专利摘要】本发明公开了一种冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，以及冬凌草甲素多孔微粒吸入剂治疗原发性肺癌的应用。冬凌草甲素多孔微粒是将冬凌草甲素溶解或分散在高分子材料中，形成的骨架型微小球状多孔微粒。微粒中的多孔可以减少单个颗粒的密度，减轻质量，较容易沉积在肺深部。经在动物模型上的抗肺癌试验结果证明，冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，抗癌效果好；特别是对非小细胞肺癌的抗癌效果好。
【专利说明】
冬凌草甲素多孔微粒吸入剂及其治疗原发性肺癌的应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及含冬凌草甲素的多孔微粒吸入剂及其治疗原发性肺癌的应用。
【背景技术】
[0002]冬凌草甲素(Oridonin)是从冬凌草中提取的中药单体化合物，主要产于中国河南、陕西等地。它有广泛的生物活性，具有抗炎，降压，清热解毒，抗肿瘤等多种药理作用。冬凌草甲素对多种癌细胞具有很强的杀灭抑制作用，可用于治疗食管癌，贲门癌，肝癌，肺癌，前列腺癌，膀胱癌等。冬凌草甲素的抗肿瘤作用机制可能是以下几个方面:抑制影响NF-KB从胞浆到细胞核中的定位转移;激活caspase介导的细胞凋亡途径;通过阻断EGFR信号通路而诱导细胞凋亡。
[0003]冬凌草甲素是一种贝壳杉烯二萜类化合物。它不溶于水，生物利用差，结构不稳定，失活。这些特点大大限制了其应用，尤其是医药上的应用。
[0004]肺癌是人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。最近几年，世界范围内的发展中国家工业化进程加剧，导致环境污染加重，肺癌发生率增长迅速。中国肺癌的发生率和死亡率连续几年都是排在癌症之首。引起肺癌发生的因素有很多，其中最主要的因素有吸烟、大气污染、电离辐射等。肺癌又分小细胞肺癌和非小细胞肺癌两类，非小细胞肺癌约占肺癌总数的80?85%，多数患者确诊后已属晚期，容易扩散转移到身体其他部位，其治疗也是非常困难的，患者的预后也比较差。临床上多采用分子靶向性药物如替尼类化合物治疗，但非分子靶向的非小细胞肺癌并没有很好的治疗方法，大多采用广谱抗癌化疗药物。它们通过静脉或口服给药进行全身化疗，药物全身分布，而分布在肺中的药物量有限，造成毒副作用大，对病人身体造成极大损害。同时，明显的肝肾毒性和不良反应以及药物耐受现象一直是影响化疗疗效的主要原因。因此，寻找低毒而又有效的药物或药物制剂一直是近年研究的热点。

【发明内容】

[0005]本发明公开了一种冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，以及冬凌草甲素多孔微粒吸入剂治疗原发性肺癌的应用。
[0006]冬凌草甲素多孔微粒是将冬凌草甲素溶解或分散在高分子材料中，形成的骨架型微小球状多孔微粒。微粒中的多孔可以减少单个颗粒的密度，减轻质量，较容易沉积在肺深部。
[0007]冬凌草甲素多孔微粒的制备方法有单凝聚法、复凝聚法、溶剂-非溶剂法、改变温度法、流化床包衣法、多孔离心法、辐射交联法、界面缩聚法、超临界流体C02，乳化/溶剂挥发法、喷雾干燥法，静电纺丝法等，优选自超临界流体、乳化/溶剂挥发法和喷雾干燥法、静电纺丝法，更优选的是乳化/溶剂挥发法和静电纺丝法。一般地，冬凌草甲素多孔微粒由载体材料、致孔剂和冬凌草甲素在一定条件下混合制备而成。载体材料选自明胶、海藻酸盐、壳聚糖、血清白蛋白、玉米蛋白、右旋糖酐、羧甲基淀粉、羧甲纤维素盐、纤维醋法酯、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、聚碳酯、聚氨基酸、聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物。致孔剂选自氯化钠、表面活性剂、白蛋白、过氧化氢、碳酸氢铵、碳酸氢钠。一般在选择合适的处方后，将其与冬凌草甲素共同制备形成冬凌草甲素多孔微粒。
[0008]本发明中的冬凌草甲素多孔微粒，其粒径为I?100微米，优选的是I?50微米，更优选的是2?20微米。冬凌草甲素多孔微粒中冬凌草甲素的量、载体材料的量没有限制，只要满足冬凌草甲素多孔微粒吸入剂的制剂要求和治疗要求就可以，优选的冬凌草甲素含量是0.1 %?30%重量比，更优选的冬凌草甲素含量是0.3%?10 %重量比，进一步优选的冬凌草甲素含量是1%?5%重量比。冬凌草甲素多孔微粒的辅料除了载体材料外，还可含有其它在药学上可接受的辅料，并且选自吸附剂、增溶剂、助溶剂、防腐剂、稳定剂、冻干保护剂、表面活性剂中的一种或多种。
[0009]冬凌草甲素多孔微粒可直接作为冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，或通过适合工艺过程处理后制备得到冬凌草甲素多孔微粒吸入剂。冬凌草甲素多孔微粒在进行工艺过程处理时，可以根据需要和剂型的不同，添加辅料得到冬凌草甲素多孔微粒吸入剂。
[0010]冬凌草甲素多孔微粒吸入剂的具体剂型选自粉雾剂。粉雾剂是将含药物的粉末通过干粉吸入器，主动吸入到呼吸道和肺中。
[0011]冬凌草甲素多孔微粒吸入剂的制备步骤没有限制，只要获得相应的冬凌草甲素多孔微粒，并制备得到冬凌草甲素多孔微粒吸入剂就可满足本发明的要求。一般地，冬凌草甲素多孔微粒粉雾剂的制备可以采用以下步骤:
[0012](I)制备冬凌草甲素多孔微粒；
[0013](2)将冬凌草甲素多孔微粒或加入载体干燥成粉末；
[0014]上述步骤(2)在干燥时，根据冬凌草甲素多孔微粒的性质，可添加或不添加合适的辅料，以得到颗粒细流动性好的粉末为目的;干燥的方法选自冷冻干燥或真空干燥。
[0015]将冬凌草甲素多孔微粒粉雾剂包装入胶囊或泡罩或干粉吸入器内，就可以方便地携带和使用。
[0016]冬凌草甲素多孔微粒用于治疗原发性肺癌。经在动物模型上的抗肺癌试验结果证明，本发明公开的冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，抗癌效果好;特别是对非小细胞肺癌的抗癌效果好。
【附图说明】
[0017]图1.用乳化/溶剂挥发法制备的冬凌草甲素多孔微粒外观照片
[0018]图2.用乳化/溶剂挥发法制备的冬凌草甲素多孔微粒扫描电镜照片
[0019]图3.用乳化/溶剂挥发法制备的冬凌草甲素多孔微粒粉体粒径
[0020]图4.用静电纺丝法制备的冬凌草甲素多孔微粒外观照片
[0021]图5.用静电纺丝法制备的冬凌草甲素多孔微粒扫描电镜照片
[0022]图6.用静电纺丝法制备的冬凌草甲素多孔微粒粉体粒径
[0023]图7.大鼠肺癌组织的病理切片和肺癌细胞凋亡图。Tunel染色指示细胞凋亡(400X )，细胞核由DAPI染色(400 X )。它们合并后显示肺癌细胞凋亡。HE染色显示肺癌细胞状态。A为原发性肺癌组，B为冬凌草甲素原料药组，C为阳性药吉西他滨组，D为冬凌草甲素多孔微粒组;其中冬凌草甲素多孔微粒用乳化/溶剂挥发法制备。
[0024]图8.大鼠肺癌组织的⑶31表达。A为原发性肺癌组，B为冬凌草甲素原料药组，C为阳性药吉西他滨组，D为冬凌草甲素多孔微粒组;其中冬凌草甲素多孔微粒用乳化/溶剂挥发法制备。
[0025]图9.大鼠肺癌组织的病理切片和肺癌细胞凋亡图。Tunel染色指示细胞凋亡(400X )，细胞核由DAPI染色(400 X )。它们合并后显示肺癌细胞凋亡。HE染色显示肺癌细胞状态。A为原发性肺癌组，B为冬凌草甲素原料药组，C为阳性药吉西他滨组，D为冬凌草甲素多孔微粒组;其中冬凌草甲素多孔微粒用静电纺丝法制备。
[0026]图10.大鼠肺癌组织的⑶31表达。A为原发性肺癌组，B为冬凌草甲素原料药组，C为阳性药吉西他滨组，D为冬凌草甲素多孔微粒组;其中冬凌草甲素多孔微粒用静电纺丝法制备。
【具体实施方式】
[0027]实施例1.用乳化/溶剂挥发法制备的冬凌草甲素多孔微粒
[0028]取冬凌草甲素SOmg和700mg聚乳酸羟基乙酸溶于2ml 二氯甲烷;取6mg碳酸氢铵溶于0.4ml去离子水，加入到有机溶液中混合，在冰浴中超声I分钟，形成白色乳剂;将上述乳剂缓慢加入到I %聚乙烯醇水溶液中，同时保持2000rpm高速剪切I分钟，形成W/0/W型复乳，搅拌过夜，挥去有机溶剂;将挥去有机溶剂的白色混悬液在1000rpm离心1min，用水洗涤沉淀2次;冷冻干燥，得到冬凌草甲素多孔微粒。
[0029]上述聚乳酸羟基乙酸(PLGA)的分子量范围为2000?100000，其中乳酸:羟基乙酸的摩尔比范围为5:1?1:5。
[0030]冬凌草甲素多孔微粒的外观为白色疏松粉末(图1)。在扫描电镜观察，冬凌草甲素多孔微粒粉雾剂为球形颗粒，表面光滑多孔(图2A)，破碎后暴露出内部多孔结构(图2B)。用粉体激光粒度仪测定冬凌草甲素多孔微粒的粒径D5Q为11.6±2.3μπι(图3)，计算得到空气动力学粒径为2.7 ± 0.3μηι，基本符合肺可吸入粒子范围。
[0031]实施例2.用静电纺丝法制备的冬凌草甲素多孔微粒
[0032]取ISOmg聚乳酸羟基乙酸和ISmg冬凌草甲素溶于3ml 二氯甲烷，再加30微升司盘80;取4.5mg碳酸氢铵溶于0.3ml去离子水，加入到有机溶液中混合，在冰浴中超声I分钟，形成白色乳剂;选择内径0.6mm的19号针头，控制针头到接触屏距离为20cm，电压15kV，推注速度为0.8ml/h，用静电纺丝装置进行电纺操作，收集得到的粉末，在真空干燥箱内30°C减压干燥48h，得冬凌草甲素多孔微粒。
[0033]上述聚乳酸羟基乙酸(PLGA)的分子量范围为2000?100000，其中乳酸:羟基乙酸的摩尔比范围为5:1?1:5。上述静电纺丝装置可选用市场上销售的各种型号设备，如北京永康乐业科技发展有限公司生产的SS-2535H型静电纺丝设备。
[0034]冬凌草甲素多孔微粒的外观为白色疏松粉末(图4)。在扫描电镜观察，冬凌草甲素多孔微粒粉雾剂为类球形颗粒，表面多孔(图5)。用粉体激光粒度仪测定冬凌草甲素多孔微粒的粒径D5Q为5.23μηι(图6)，计算得到空气动力学粒径为2.1 ±0.Ιμπι，基本符合肺可吸入粒子范围。
[0035]实施例3.用喷雾干燥法制备的冬凌草甲素多孔微粒
[0036]取ISOmg聚乳酸羟基乙酸和ISmg冬凌草甲素溶于3ml 二氯甲烷，再加30微升司盘80;取4.5mg碳酸氢铵溶于0.3ml去离子水，加入到有机溶液中混合，在冰浴中超声I分钟，形成白色乳剂，进行喷雾干燥，选择进口温度100 °C，出口温度50 0C，蠕动栗转速300ml/h，频率55HZ，得冬凌草甲素多孔微粒。
[0037]上述聚乳酸羟基乙酸(PLGA)的分子量范围为2000?100000，其中乳酸:羟基乙酸的摩尔比范围为5:1?1:5。上述喷雾干燥设备可选用市场上销售的各种型号设备，如上海沃迪科技有限公司生产的SD-1500型喷雾干燥机。
[0038]冬凌草甲素多孔微粒的外观为白色疏松粉末。在扫描电镜观察，冬凌草甲素多孔微粒粉雾剂为类球形颗粒，表面多孔。
[0039]实施例4.用超临界流体法制备的冬凌草甲素多孔微粒
[0040]取ISOmg聚乳酸羟基乙酸和ISmg冬凌草甲素溶于3ml 二氯甲烷，再加30微升司盘80;取4.5mg碳酸氢铵溶于0.3ml去离子水，加入到有机溶液中混合，在冰浴中超声I分钟，形成白色乳剂，缓慢加入I %聚乙烯醇水溶液中，同时保持2000rpm高速剪切I分钟，形成W/0/W型复乳，倒入试管中，通入CO2进行超临界流体萃取，控制压力1200psi，得冬凌草甲素多孔微粒。
[0041 ]实验例1.用乳化/溶剂挥发法制备的冬凌草甲素多孔微粒治疗大鼠原发性肺癌
[0042]材料:按照实施例1制备的冬凌草甲素多孔微粒，冬凌草甲素原料药粉末，吉西他滨，生理盐水。
[0043]方法:将24只健康雄性Wistar大鼠随机分为4组，每组6只。各组大鼠经气管一次性喷入化学致癌剂(三甲基胆蒽和二乙基亚硝胺)，30天后形成原发性非小细胞肺癌模型。4组分别为原发性肺癌组(给生理盐水)、冬凌草甲素原料治疗组、阳性药(吉西他滨)治疗组、冬凌草甲素多孔微粒治疗组。
[0044]各组经气管喷入给药。给药剂量参照成人每日常规剂量进行换算。原发性肺癌组用气管内雾化器(IA-lB，Penn-Century 11^.，？厶，1^厶)气管内给予生理盐水，0.21111/只。冬凌草甲素原料治疗组采用气管给药装置(DP-4M，Penn-Century Inc.，PA，USA)气管内给予冬凌草甲素原料药，lmg/只。阳性药治疗组用上述气管内雾化器气管内给予吉西他滨的生理盐水溶液(10mg/ml )，0.1ml/只。冬凌草甲素多孔微粒治疗组采用上述气管给药装置气管内给予冬凌草甲素多孔微粒，1mg多孔微粒/只，相对于Img冬凌草甲素/只。上述药品每周给药I次，共4次。给药4周后，开胸将肺完整取出并分离，作病理切片、免疫组化。
[0045]结果:大鼠肺癌组织病理切片(图7A)显示模型组肿瘤面积较大，在肺泡腔内有大量增殖的癌细胞，可能为肺泡II型细胞，而治疗组都有明显减轻的趋势，肿瘤面积有明显减小。特别是冬凌草甲素多孔微粒治疗组，肿瘤面积较小，而且肺泡界线较清楚，治疗效果很好。CD31是血管生成的标志物，它能够表达肿瘤血管的生成，它的增多预示着肿瘤生成的旺盛。从图8可以看到，肺癌组阳性表达较多，示肿瘤增殖较快，而治疗组均有所减少，尤以冬凌草甲素多孔微粒治疗组效果最好，阳性表达最低，说明本发明制备的冬凌草甲素多孔微粒能较好抑制肿瘤增长。通过Tunel测得肺癌组织中细胞凋亡的情况(图7)，可以看到在肺癌组，细胞凋亡较少，基本没有凋亡表现，而各治疗组都有凋亡细胞为绿色荧光点，其中冬凌草甲素多孔微粒组细胞凋亡数量要明显高于冬凌草甲素原料药组，提示我们冬凌草甲素制备成多孔微粒后能大大增加药效，加强了药物对肺癌细胞的作用，更好治疗肺癌。
[0046]实验例2.用静电纺丝法制备的冬凌草甲素多孔微粒治疗大鼠原发性肺癌
[0047]材料:按照实施例1制备的冬凌草甲素多孔微粒，冬凌草甲素原料药粉末，吉西他滨，生理盐水。
[0048]方法:完全同实验例I。
[0049]结果:具体结果见图9和图10，分析同实验例I描述。该结果与实验例I相近，说明不同方法制备得到冬凌草甲素多孔微粒均具有提高药效，有效抑制和治疗原发性肺癌的效果ο
【主权项】
1.一种冬凌草甲素多孔微粒吸入剂。2.如权利要求1所述的冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，是将冬凌草甲素溶解或分散在高分子材料中，形成的骨架型微小球状多孔微粒。3.如权利要求1所述的冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，其中冬凌草甲素多孔微粒的粒径为I?100微米。4.如权利要求1所述的冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，其中冬凌草甲素多孔微粒中冬凌草甲素含量是0.1 %?30 %重量比。5.如权利要求1所述的冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，其中冬凌草甲素多孔微粒由载体材料、致孔剂和冬凌草甲素在一定条件下混合制备而成。6.如权利要求5所述的冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，其中载体材料选自明胶、海藻酸盐、壳聚糖、血清白蛋白、玉米蛋白、右旋糖酐、羧甲基淀粉、羧甲纤维素盐、纤维醋法酯、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、聚碳酯、聚氨基酸、聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物;其中致孔剂选自氯化钠、表面活性剂、白蛋白、过氧化氢、碳酸氢铵、碳酸氢钠。7.如权利要求1所述的冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，其中冬凌草甲素多孔微粒的制备方法选自超临界流体、乳化/溶剂挥发法和喷雾干燥法、静电纺丝法。8.如权利要求1所述的冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，是冬凌草甲素多孔微粒粉雾剂，并且其制备采用以下步骤: (1)制备冬凌草甲素多孔微粒； (2)将冬凌草甲素多孔微粒或加入载体干燥成粉末； 上述步骤(2)在干燥时，根据冬凌草甲素多孔微粒的性质，可添加或不添加合适的辅料，以得到颗粒细流动性好的粉末为目的;干燥的方法选自冷冻干燥或真空干燥。9.如权利要求1所述的冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，其中冬凌草甲素多孔微粒的制备方法如下:取冬凌草甲素SOmg和700mg聚乳酸羟基乙酸溶于2ml 二氯甲烷;取6mg碳酸氢铵溶于0.4ml去离子水，加入到有机溶液中混合，在冰浴中超声I分钟，形成白色乳剂;将上述乳剂缓慢加入到I %聚乙烯醇水溶液中，同时保持2000rpm高速剪切I分钟，形成W/0/W型复乳，搅拌过夜，挥去有机溶剂;将挥去有机溶剂的白色混悬液在1000rpm离心1min，用水洗涤沉淀2次;冷冻干燥，得到冬凌草甲素多孔微粒。10.如权利要求1所述的冬凌草甲素多孔微粒吸入剂，用于治疗原发性肺癌。
【文档编号】A61K47/34GK105919984SQ201610231231
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】金义光, 李淼, 朱李飞, 杜丽娜
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所