一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶及其制备方法
【专利摘要】本发明属于生物医用材料技术领域，公开了一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶及其制备方法。所述制备方法为：在海藻酸钠的水溶液中加入活化剂，活化后加入糠胺避光反应，透析冻干后得到改性的海藻酸钠固体；将改性海藻酸钠固体溶于去离子水中，然后加入马来酰亚胺封端的聚乙烯醇，在37～60℃温度下反应交联得到凝胶；将所得凝胶浸泡于抗菌多肽溶液中，利用光引发剂在紫外光条件下将抗菌多肽接枝于凝胶中，得到产物。本发明所得抗菌凝胶对大肠杆菌具有优秀的抗菌能力，且能促进人成纤维细胞的粘附。
【专利说明】
一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]随着近代医学的发展，伤口护理所用的伤口敷料随之发生的革命性的变化。伤口敷料从传统的纱布、绷带等，发展到现在的新型生物活性敷料。理想的生物活性敷料要求生物相容性良好，保湿且能为创面提供湿润环境，具有抗菌能力和一定的生物活性。
[0003]水凝胶敷料作为其中一种新型的生物活性敷料，能为创面保持湿润环境，加速创面愈合，而且可以隔绝外界，阻止细菌感染创面，具有一定的吸水能力，可以很好的包载药物，生物活性因子等。
[0004]目前的水凝胶敷料一般通过物理包载抗菌剂和药物，这可能导致药物突释的问题。例如包载银离子的水凝胶，在使用初期容易因为银离子突释而引发局部度过高，导致一定的毒性。随着药物的持续释放，最终凝胶还会失去抗菌能力。为了满足临床需要，我们希望制备出一种生物相容性良好，抗菌能力持久的抗菌凝胶敷料。
【发明内容】
[0005]本发明的首要目的在于提供一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶的制备方法，该方法使用生物相容性较好的海藻酸钠作为凝胶基材，通过呋喃根改性后利用Diels-Alder点击化学反应交联成凝胶，利用Diels-Alder点击化学反应产物中的双键与抗菌剂多肽中的巯基通过紫外光引发反应，从而实现抗菌多肽共价接枝到凝胶中，实现长期抗菌能力。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶。所得凝胶具有生物相容性好和持久抗菌能力持久的优点。
[0007]本发明目的通过以下技术方案实现:
[0008]—种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶的制备方法，包括以下制备步骤:
[0009](I)海藻酸钠溶于去离子水中，加入4-(4，6_二甲氧基三嗪-2-基)-4_甲基吗啉盐酸盐活化剂，活化0.5?lh，然后加入糠胺反应12?36h，反应产物经透析，冷冻干燥得到呋喃改性海藻酸钠；
[0010](2)将步骤(I)中所得呋喃改性海藻酸钠溶于去离子水中，搅拌得到透明呋喃改性海藻酸钠溶液，然后加入马来酰亚胺封端的聚乙烯醇，搅拌充分溶解，超声处理后注入模具，在37?60°C温度下反应交联得到凝胶；
[0011](3)把端基为巯基的抗菌多肽溶于去离子水中，配制成抗菌多肽溶液，取步骤(2)所得凝胶浸泡于抗菌多肽溶液中，然后加入光引发剂，在紫外光照下反应，随后使用PBS溶液把凝胶中未反应物质洗去，得到共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶。
[0012]上述制备步骤的反应原理图如图1所示。
[0013]步骤(I)中所述海藻酸钠、活化剂与糠胺的摩尔比优选为1:(0.5?1.5):(0.5?1.5)o
[0014]优选地，所述的透析是指用截留分子量为3500的透析袋透析，透析时间为3?5天。
[0015]步骤(2)中所述呋喃改性海藻酸钠溶液的质量浓度优选为I%?2%。
[0016]优选地，所述马来酰亚胺封端的聚乙烯醇的重均分子量为1000?4000。
[0017]优选地，所述超声处理的时间为5?lOmin。
[0018]步骤(3)中所述端基为巯基的抗菌多肽优选抗菌多肽CYS-HHC_10(合肥国肽生物科技有限公司Cleophas，R T C1R10l ,M and Quarles Van Ufford1H L C,et al.,2014),抗菌多肽溶液的浓度为0.5mg/mL?6mg/mL。该抗菌多肽CYS-HHC-1O的分子结构图如图2所不O
[0019]优选地，所述光引发剂是指光引发剂12959，光引发剂的用量为反应液质量的
0.5%?
[0020]—种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶，通过以上方法制备得到。
[0021]本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果:
[0022](I)本发明使用Diels-Alder点击化学反应制备海藻酸钠凝胶，反应条件温和、选择性高，保证了凝胶的细胞相容性；
[0023](2)本发明利用Diels-Alder点击化学反应产物中的双键与巯基在紫外光条件下发生反应，将含有巯基的抗菌多肽共价接枝到凝胶中而不破坏多肽分子结构；
[0024](3)本发明所得凝胶具有良好的抗菌能力，而且细胞粘附能力有所增强。
【附图说明】
[0025]图1为本发明所述抗菌凝胶制备步骤的反应原理图。
[0026]图2为本发明中所使用抗菌多肽CYS-HHC-1O的分子结构图。
[0027]图3为实施例1?4所得抗菌凝胶对大肠杆菌的抗菌测试结果图。
[0028]图4为实施例2所得抗菌凝胶进行表面细胞培养I天(A)和3天(B)的活死染色图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0030]实施例1
[0031](1)0.5g海藻酸钠溶解于10ml去离子水中，加入4-(4，6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐0.750g，搅拌0.5h，再逐滴加入490μ1的糠胺，避光反应24h。使用截流分子量3500的透析袋透析5天。-80 °C冷冻干燥得到改性海藻酸钠固体。
[0032](2)75mg改性海藻酸钠溶于5ml去离子水中，搅拌2h，待其完全溶解后加入50mg分子量为2000的双马来酰亚胺端基聚乙烯醇，搅拌1min溶解后，超声5min后转移到高5mm，直径1mm的圆柱形模具中，在37°C温度下反应交联得到凝胶。
[0033](3)将上述凝胶浸泡于Iml浓度lmg/mL的CYS-HHC-1O抗菌多肽溶液中，充分溶胀。然后加入质量浓度为0.5%的光引发剂12959，使用紫外光照射上述凝胶，正反面各lOmin。随后使用PBS溶液将未反应物洗去，得到共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶。
[0034]实施例2
[0035](1)0.5g海藻酸钠溶解于10ml去离子水中，加入4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐0.750g，搅拌0.5h，再逐滴加入490μ1的糠胺，避光反应24h。使用截流分子量3500的透析袋透析5天。-80 °C冷冻干燥得到改性海藻酸钠固体。
[0036](2)75mg改性海藻酸钠溶于5ml去离子水中，搅拌2h，待其完全溶解后加入50mg分子量为2000的双马来酰亚胺端基聚乙烯醇，搅拌1min溶解后，超声5min后转移到高5mm，直径1mm的圆柱形模具中，在37°C温度下反应交联得到凝胶。
[0037](3)将上述凝胶浸泡于Iml浓度2mg/mL的CYS-HHC-10抗菌多肽溶液中，充分溶胀。然后加入质量浓度为0.5%的光引发剂12959，使用紫外光照射上述凝胶，正反面各lOmin。随后使用PBS溶液将未反应物洗去，得到共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶。
[0038]实施例3
[0039](1)0.5g海藻酸钠溶解于10ml去离子水中，加入4-(4，6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐0.750g，搅拌0.5h，再逐滴加入490μ1的糠胺，避光反应24h。使用截流分子量3500的透析袋透析5天。-80 °C冷冻干燥得到改性海藻酸钠固体。
[0040](2)75mg改性海藻酸钠溶于5ml去离子水中，搅拌2h，待其完全溶解后加入50mg分子量为2000的双马来酰亚胺端基聚乙烯醇，搅拌1min溶解后，超声5min后转移到高5mm，直径1mm的圆柱形模具中，在37°C温度下反应交联得到凝胶。
[0041 ] (3)将上述凝胶浸泡于Iml浓度3mg/mL的CYS-HHC-1O抗菌多肽溶液中，充分溶胀。然后加入质量浓度为0.5%的光引发剂12959，使用紫外光照射上述凝胶，正反面各lOmin。随后使用PBS溶液将未反应物洗去，得到共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶。
[0042]实施例4
[0043](1)0.5g海藻酸钠溶解于10ml去离子水中，加入4-(4，6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐0.750g，搅拌0.5h，再逐滴加入490μ1的糠胺，避光反应24h。使用截流分子量3500的透析袋透析5天。-80 °C冷冻干燥得到改性海藻酸钠固体。
[0044](2)75mg改性海藻酸钠溶于5ml去离子水中，搅拌2h，待其完全溶解后加入50mg分子量为2000的双马来酰亚胺端基聚乙烯醇，搅拌1min溶解后，超声5min后转移到高5mm，直径1mm的圆柱形模具中，在37°C温度下反应交联得到凝胶。
[0045](3)将上述凝胶浸泡于Iml浓度4mg/mL的CYS-HHC-1O抗菌多肽溶液中，充分溶胀。然后加入质量浓度为0.5%的光引发剂12959，使用紫外光照射上述凝胶，正反面各lOmin。随后使用PBS溶液将未反应物洗去，得到共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶。
[0046]实施例5
[0047](1)0.5g海藻酸钠溶解于10ml去离子水中，加入4-(4，6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐0.750g，搅拌0.5h，再逐滴加入490μ1的糠胺，避光反应24h。使用截流分子量3500的透析袋透析5天。-80 °C冷冻干燥得到改性海藻酸钠固体。
[0048](2)50mg改性海藻酸钠溶于5ml去离子水中，搅拌2h，待其完全溶解后加入50mg分子量为4000的双马来酰亚胺端基聚乙烯醇，搅拌1min溶解后，超声1min后转移到高5mm，直径1mm的圆柱形模具中，在60°C温度下反应交联得到凝胶。
[0049](3)将上述凝胶浸泡于Iml浓度6mg/mL的CYS-HHC-1O抗菌多肽溶液中，充分溶胀。然后加入质量浓度为1%的光引发剂12959，使用紫外光照射上述凝胶，正反面各lOmin。随后使用PBS溶液将未反应物洗去，得到共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶。
[0050]以上实施例中I?4所得抗菌水凝胶分别对应图3中HHC-1ODAgel UHHC-1ODAgel
2,HHC-1ODAgel 3,HHC-1ODAgeI 4。结果表明抗菌凝胶在4h、24h对大肠杆菌的杀菌能力均达到98%以上，具有$父强的杀菌能力。
[0051]以上实施例中2所得抗菌凝胶进行表面HSF细胞培养，其I天(A)和3天(B)活死染色图如图4所示。结果表明接枝抗菌多肽凝胶在3天时，细胞能较好粘附呈现HSF细胞梭形形貌。
[0052]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤: (1)海藻酸钠溶于去离子水中，加入4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化剂，活化0.5?Ih，然后加入糠胺反应12?36h，反应产物经透析，冷冻干燥得到呋喃改性海藻酸钠； (2)将步骤(I)中所得呋喃改性海藻酸钠溶于去离子水中，搅拌得到透明呋喃改性海藻酸钠溶液，然后加入马来酰亚胺封端的聚乙烯醇，搅拌充分溶解，超声处理后注入模具，在37?60°C温度下反应交联得到凝胶； (3)把端基为巯基的抗菌多肽溶于去离子水中，配制成抗菌多肽溶液，取步骤(2)所得凝胶浸泡于抗菌多肽溶液中，然后加入光引发剂，在紫外光照下反应，随后使用PBS溶液把凝胶中未反应物质洗去，得到共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶。2.根据权利要求1所述的一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述海藻酸钠、活化剂与糠胺的摩尔比为1:(0.5?1.5):(0.5?1.5)。3.根据权利要求1所述的一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶的制备方法，其特征在于:所述的透析是指用截留分子量为3500的透析袋透析，透析时间为3?5天。4.根据权利要求1所述的一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述呋喃改性海藻酸钠溶液的质量浓度为1%?2%。5.根据权利要求1所述的一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶的制备方法，其特征在于:所述马来酰亚胺封端的聚乙烯醇的重均分子量为1000?4000。6.根据权利要求1所述的一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶的制备方法，其特征在于:所述超声处理的时间为5?1min。7.根据权利要求1所述的一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述端基为巯基的抗菌多肽是指抗菌多肽CYS-HHC-10，抗菌多肽溶液的浓度为0.5mg/mL?6mg/mL。8.根据权利要求1所述的一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶的制备方法，其特征在于:所述光引发剂是指光引发剂12959，光引发剂的用量为反应液质量的0.5 %?I %。9.一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶，其特征在于:通过权利要求1?8任一项所述的方法制备得到。
【文档编号】C08B37/04GK105920652SQ201610280846
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】曹晓东, 朱杰华, 吴水平, 游柏浩
【申请人】华南理工大学