一种二萜类化合物在制备治疗肝癌的药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种二萜类化合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明属于药物技术领域，具体涉及从灯心草的干燥茎髓中分离得到的一种二萜化合物在治疗肝癌的药物中的应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的二萜类化合物，可以从灯心草的干燥茎髓中提取、分离纯化得到。本发明具有治疗肝癌的作用，本发明对人肝癌细胞HepG2进行干预处理时，化合物(Ⅰ)能够有效抑制HepG2细胞的生长增殖，干预组细胞的存活率显著降低，细胞内ROS水平显著下降，且细胞存活率下降的程度与化合物(Ⅰ)干预浓度之间存在一定剂量效应趋势。
【专利说明】
一种二萜类化合物在制备治疗肝癌的药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从灯心草的干燥茎髓中分离得到的一种二萜 类化合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源 于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤;后 者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见;继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起 源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。
[0003] 灯心草别名灯芯草、灯草，为灯心草科植物灯心草Juncuse ffusus L.的干燥茎 髓。夏末至秋季割取茎，晒干，取出茎髓，理直，扎成小把。为多年生稀一年生草本，主产于江 苏、福建、四川、贵州、云南，通常生长在草甸、沼泽、水边及阴湿的环境中。味甘、淡，性微寒， 归心、肺、小肠经，是治疗心烦少眠、高热口渴、尿少涩痛、小儿疳积、口舌生疮等症的传统药 物。
[0004] 各国学者对灯心草属植物的化学成分进行了一系列研究，发现其化学成分比较复 杂，主要含二萜类、三萜类、苯并香豆素类、留类化合物，此外还含有黄酮类、糖类及苷类等 化合物。灯心草属植物在中国和日本都有悠久的药用历史，被收录于很多医药学著作。灯心 草属植物中大部分化合物为具有二氢菲和菲母核的二萜类化合物，并且都具有酚羟基，因 此许多化合物都具有较好的生物活性。灯心草具有抗藻活性、抗菌活性、抗湿疹活性、抗氧 化活性、抗病毒活性、镇静作用等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从灯心草的干燥茎髓中分离提取得到的二萜类化合物 在制备治疗肝癌的药物中的应用。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] -种二萜类化合物在制备治疗肝癌的药物中的应用，具有下述结构式的化合物 ⑴，
[0008]
[0009]进一步地，所述化合物（I)从灯心草中提取获得，提取步骤包括：
[0010] (a)灯心草的干燥茎髓粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无 醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯 萃取物和正丁醇萃取物；
[0011] (b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再 用75%乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；
[0012] (C)步骤(b)中75%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、 30:1、15 :1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得至1」5个组分；
[0013] (d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
[0014] (e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为 75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物 (1)〇
[0015] 进一步地，步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0016]进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0017] -种药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用，该药物组合物含有治疗有效量 的上述化合物（I)和药学上可接受的载体。
[0018] 进一步地，该药物组合物含有药学上可接受的赋形剂。
[0019] 上述载体和赋形剂为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和 可药用赋形剂。
[0020] 本发明提供的上述化合物（I)用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形 式使用。
[0021] 将上述化合物（I)作为药物组合物的组分之一，在制备治疗肝癌的药物中的应用 时，药物组合物中所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释 剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明中的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。
[0022] 本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将 其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用 于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0024] 本发明具有治疗肝癌的作用，本发明对人肝癌细胞HepG2进行干预处理时，化合物 (I)能够有效抑制HepG2细胞的生长增殖，干预组细胞的存活率显著降低，细胞内ROS水平显 著下降，且细胞存活率下降的程度与化合物(I)干预浓度之间存在一定剂量效应趋势。
【附图说明】
[0025] 图1为化合物(I)结构式；
[0026]图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较；
[0027]图3化合物（I)对HepG2及L02细胞增殖的影响(η = 3)。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0029]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0030] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0031] 制备方法：（a)将灯心草的干燥茎髓（8kg)粉碎，用80 %乙醇热回流提取（25L X 3 次），合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱 和的正丁醇(3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(363g)和正丁醇萃取 物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积， 再用75%乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏 (145g); (c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体 积）、50:1 (8个柱体积）、30:1 (6个柱体积）、15 :1 (8个柱体积)和1:1 (5个柱体积）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(47g)用正相硅胶进一步分离，依次用 体积比为20:1(8个柱体积）、15:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2(26g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百 分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯 的化合物（I)(39mg)。
[0032] 结构确证:HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 483.1612,结合核磁特征可得分子式为 〇24112809，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据51 1(??111，0130-(16,6001〇^):!1-1(5.03，(1，了 = 4.9)，H-2(4.47，br，d，J=4.9)，H-3(4.03，br，s)，H-5(2.77，s)，H-7(5.75，s)，H-9(2.88， s)，H-12(5.38，s)，H-14(2.61，d，J=16.0)，H-14(2.18，d，J=16.0)，H-15(5.81，dd，J = 17.8，11.2)，H-16(5.16，d，J=11.2)，H-16(4.98，d，J=17.8)，H-17(1.03，s)，H-19(1.43， s)，H-20(I ·01，s)，2-0Ac(2· 16，s)，12-0Ac(I ·97，s);核磁共振碳谱数据δ。（ppm，DMS〇-d6， 150MHz):80·I(CH，1-C)，75·2(CH，2-C)，76·6(CH，3-C)，46.0(C，4-C)，57.I(CH，5-C)，194.0 (C，6-C)，125.8(CH，7-C)，155.9(C，8-C)，45.6(CH，9-C)，41.1(C，10-C)，201.1(C，11-C)， 86.6(CH，12-C)，40.6(C，13-C)，43.0(CH2，14-C)，139.8(CH，15-C)，116.0(CH2，16-C)，20.1 (CH 3，17-C)，175.2(C，18-C)，16.9(CH3，19-C)，20.1(CH3,20-C)，169.3(C，2-0Ac)，25.1 (〇1 3,2-(^)，170.1((：，12-(^)，25.3(〇13，12-(^);碳原子标记参见图1。红外光谱表明该 化合物含有羟基（3437CHT1)和羰基（1758(31^1)基团。1H和 13C匪R谱表明该化合物含有两个 酮羰基(一个为不饱和酮羰基），一个酯羰基，两个乙酰氧基，单取代和三取代双键。此外，典 型的乙烯基[双二重峰5!15.81(了=17.8，11.2!^，!1-15)，两个双峰5!15.16(了=11.2!^，!1-16)，4.98(了=17.8他，!1-16)和3(：139.8((：-15)，116.0((：-16)和20.1((：-17)]和偕甲基[3 町.03(8，1^-17)]信号表明该化合物为二萜类化合物。腿8(：谱中，(：-13与16-17 ;(：-15与!1-12，!1-1613，!12-14和]^-17;(：-17与!1-12，!1 2-14，!1-15和!12-16的相关性表明乙烯基和偕甲基位 于C-130C4O.6)位上。HMBC谱中C-18与Η-1，Η-3，Η-5和Me-19,以及C-I与H-2和H-3的相关性 表明C-I和C-18之间存在内酯环。另外，C-18和Me-19与C-40C46.O)相连，HMBC谱中的C-4和 Me-19的耦合证实了上述结论。通过HMBC谱中C-6与H-5和H-14b;C-7与H-9和H2-14;C-8与H-9和 H2-H 的相关性可知α，β-不饱和酮基结构[SC194.0(C-6)，125.8(C-7MP155.9(C-8)W 及SH5.75(s，H-7)]位于C-5和C-9之间。HMBC谱中氢质子信号0!14.47，1^，(1，1 = 4.9泡和 5.38,8)与相应羰基碳0(：169.3和17〇.1)的相关性，表明(：-2和(：-12位分别连有一个乙酰氧 基。NOESY谱中，H-I和Me-20的相关性表明它们为α取向；H-3与H-2和]^-19，]\^-19与!1-5的相 关性，表明它们为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数 据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基 本一致(图2)。
[0033]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0034] -、材料和仪器
[0035] HepG2人肝癌细胞株购自中科院生物化学与细胞生物学研究所。L02正常人肝细胞 株由复旦大学中山医院肝癌研究所馈赠。化合物（I)自制，HPLC归一化纯度大于98% APMI-1640培养基、胰酶购自Gibco公司。标准小牛血清购自Biowest公司。3-(4,5-二甲基噻挫-2) -2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT )、二甲基亚砜(DMSO )、台盼蓝(TrypanBLue )、二氯荧光素双 醋酸盐(DCFH-DA)均购自上海国药集团化学试剂有限公司。其他常用试剂均为分析纯。 [0036] 微量天平(瑞士梅特勒-托利多，METTLRERAE2000)。普通台式离心机(上海安亭科 学仪器厂）。数显电热恒温水浴箱(上海跃进医疗机械厂，HH.W21.600S)。二氧化碳细胞培养 箱(美国FormaScientif ic公司）。高速冷冻离心机(美国Thermo公司，IECMICROMAXRF)。超微 量紫外分光光度计(美国ThermoHsher公司，NanoDrop-1000)。紫外成像系统(上海复日科技 有限公司，FR-200A)。酶联免疫检测仪，荧光分光光度计(HitachiF2500)。
[0037]二、试验方法 [0038] 1、细胞培养
[0039] 将细胞常规接种于含10% (体积分数)小牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37°C、 5 % CO2浓度的培养箱中培养。
[0040] 2、化合物（I)干预培养液的配置
[00411 将45.44mg化合物（I)溶于IOmL二甲基亚砜(DMSO)制得储备液并分别稀释2倍、4 倍，分别得到2mmo I /L、4mmo I /L及8mmo I /L的化合物（I)应用液。进行细胞干预前，将5 OyL应 用液与4950yL常规培养液(含10%体积分数的小牛血清)充分混合，得到化合物（I)干预培 养液(20411101/1^、4(^1]1〇1/1^、8(^1]1〇1/1^)。
[0042] 3、MTT法检测细胞存活率
[0043]取对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔200yL(5X103细胞）。培养12h待细胞 贴壁后，弃去原培养液，加入200此不同浓度的化合物（I)培养液(DMSO溶解化合物（I)后以 1 %体积分数与常规培养液混合，使化合物（I)终浓度为20μπι〇 1/L、40μπι〇 1/L、80μπι〇 1/L)，每 组6个平行孔。同时设6个溶剂(DMSO)对照孔。培养24h、48h、72h，每24小时更换化合物（I)干 预培养液。干预结束后，吸去培养液，向各孔加入20yLMTT溶液，37 °C孵育4h后吸去各孔上清 液，加入150yL DMSO，置摇床上低速震荡IOmin，待结晶充分溶解后，以DMSO调零，用酶联免 疫检测仪在490nm处测定各孔吸光度，计算细胞存活率（survival rate，SR)。SR =实验组 A49〇/对照组 A49QX100%
[0044] 4、台盼蓝染色測定存活细胞数
[0045] 将相同数量(2 X IO6)的细胞接种于细胞培养瓶，培养一段时间待细胞贴壁后，弃 去培养液，用I3BS洗细胞两遍后，加入5mL的化合物（I)干预培养液(20ym 〇l/L、40ym〇l/L、80y mol/L)。每组三瓶细胞，同时设立三瓶溶剂(DMSO)对照。培养48h后，用0.25 %胰酶消化细 胞，收集细胞悬液，台盼蓝染色测定细胞数。
[0046] 5、DCFH-DA法测定细胞内ROS活性
[0047] 将相同数量(2 X IO6)的细胞接种于细胞培养瓶，培养一段时间待细胞贴壁后，吸 去原培养液，加入5mL化合物（I)干预培养液，继续培养48h后，弃去培养液，胰酶消化细胞， 收集细胞悬液于1.5mL EP管中，1500rpm离心5min，弃上清，向沉淀中加入lmLDCFH-DA，吹打 混匀，37°C孵育30min，加入PBS终止反应，离心收集沉淀并溶解于ImL PBS，吹打成均匀细胞 悬液，用Hitachi-F2500焚光分光光度计测定荧光值。激发波长488nm，发射波长525nm。
[0048] 三、结果及结论
[0049] 1、细胞生长存活率
[0050] HepG2细胞经化合物（I)干预培养24h、48h、72h后，低、中、高剂量组的细胞存活率 均显著低于溶剂对照组(P〈〇.05)，且细胞存活率下降的程度与化合物（I)干预浓度之间存 在一定剂量效应趋势(表1，aP〈〇. 05VS对照组;bP〈0.05VS低剂量组;eP〈0.05VS中剂量组）。在 同一化合物（I)干预浓度下，细胞存活率随着干预时间的增加而呈现下降的趋势。而同等条 件下，L02人正常肝细胞经化合物（I)干预后，细胞存活率无显著变化(表2)。台盼蓝染色细 胞计数结果与MTT-致(图3， aP〈0.05VS对照组;bP〈0.05VS低剂量组;CP〈0.05VS中剂量组）。 [0051 ] 2、细胞内ROS活性
[0052] HepG2人肝癌细胞经不同浓度化合物（I)干预后，与对照组相比，细胞内ROS水平显 著下降(p〈0.05)。结果见表3(aP〈0.05VS对照组;bP〈0.05VS低剂量组）。
[0053] 结论，采用不同浓度的化合物（I)对人肝癌细胞HepG2进行干预处理，经MTT比色及 台盼蓝染色细胞计数表明，化合物（I)能够有效抑制HepG2细胞的生长增殖，干预组细胞的 存活率较对照组显著降低，且降低程度与化合物（I)浓度呈现一定的剂量效应趋势，同时在 同一化合物（I)浓度下，细胞存活率随着干预时间的增加而呈现持续降低的趋势。与此同 时，相同剂量的化合物（I)干预对L02正常肝细胞并不产生抑制作用。
[0054] 表1化合物（I)对HepG2细胞生长存活率的影响(X土s，n = 6)
[0060] 实施例3
[0061 ]片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0062] 实施例4
[0063] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服 液。
[0064] 实施例5
[0065] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0066] 实施例6
[0067] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0068] 实施例7
[0069] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0070]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种二萜类化合物在制备治疗肝癌的药物中的应用，其特征在于：具有下述结构式 的化合物(I)，2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述化合物（I)从灯心草中提取获得，提取 步骤包括： (a) 将灯心草的干燥茎髓粉碎，用75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇 味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃 取物和正丁醇萃取物； (b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用 75%乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏； (c) 步骤(b)中75%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30: 1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分； (d) 步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e) 步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的 甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并 提取液。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。5. -种药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用，其特征在于：该药物组合物含有 治疗有效量的权利要求1所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
【文档编号】A61P1/16GK105943532SQ201610355939
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】董秋月
【申请人】杭州更蓝生物科技有限公司