一种具有pH响应的CpG核酸药物输送系统及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种CpG核酸药物输送系统，包括载体及CpG核酸药物，其特征在于：其中，所述载体为醛基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，所述CpG核酸药物为5’端修饰氨基的CpG寡核苷酸，所述载体和所述CpG核酸药物通过亚胺键共价连接，该亚胺键具有pH敏感性。本发明还提供了一种该CpG核酸药物输送系统的制备方法。根据本发明提供的CpG核酸药物输送系统，由于其中载体和CpG核酸药物通过pH敏感的亚胺键共价连接，能够在被免疫细胞摄取后到达溶酶体，在溶酶体的弱酸性条件下释放出游离CpG核酸药物，诱导免疫细胞分泌一系列细胞因子。该CpG核酸药物输送系统能够实现CpG核酸药物的胞内可控释放，诱导分泌效率高。
【专利说明】
一种具有pH响应的CpG核酸药物输送系统及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种药物输送系统，尤其涉及一种具有pH响应的CpG核酸药物输送系统及其制备方法。
【背景技术】
[0002]CpG寡核苷酸(以下简称CpG 0DN)是一种含有CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘧啶)基序的寡核苷酸，能够被细胞内的Toll样受体_9(以下简称TLR-9)识别，并诱导免疫细胞分泌包括白细胞介素_6(以下简称IL-6)在内的一系列细胞因子，从而诱导并增强免疫反应，因此可以用作制备免疫佐剂，在一些感染性疾病、过敏性疾病和肿瘤等疾病的防治中具有重要的应用前景。
[0003]由于CpGODN的化学本质是一种脱氧核苷酸，易被脱氧核苷酸酶分解，在血清中稳定性较差，并且细胞摄取率低，因此其应用受到了限制。为了提高CpG ODN的稳定性，常常采用药物输送载体将其负载，形成CpG药物输送系统。研究表明，采用纳米材料作为载体制备CpG药物输送系统，不仅能够提高CpG ODN在血清中的稳定性，还能够提高免疫细胞对CpG药物输送系统的摄取率，当纳米材料的粒径在20nm?10nm范围内时，药物输送系统更容易被免疫细胞摄取。
[0004]介孔氧化硅是一种纳米多孔材料，具有生物相容性好、稳定性高、比表面积大、内部孔径大的优点。在介孔氧化硅的合成过程中，对合成条件进行调整即可改变得到的介孔氧化硅的形态及内部孔径大小，使其与所要输送的药物相适应;此外，介孔氧化硅的表面富含羟基，能够根据需求进行多种化学修饰并连接上不同的功能基团，从而进一步实现对药物释放性能的控制，因此介孔氧化硅是一种理想的药物输送载体。
[0005]研究表明，储存于载体上的CpGODN对IL-6的诱导作用较弱，胞内的TLR-9更易识别游离的CpG ODN，从而使免疫细胞被诱导分泌IL-6等细胞因子。因此，理想的CpG药物输送系统不仅需要能够在细胞外保持稳定、更容易被免疫细胞摄取，还需要能够在细胞内释放出游离CpG ODN，S卩，还需要实现CpG ODN的可控胞内释放。
【发明内容】
[0006]为解决上述问题，本发明采用了如下技术方案:
[0007]—种具有pH响应的CpG核酸药物输送系统，包括载体及CpG核酸药物，其特征在于:
[0008]其中，载体为醛基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，CpG核酸药物为5’端修饰氨基的CpG寡核苷酸，
[0009]载体和CpG核酸药物通过亚胺键共价连接，该亚胺键具有pH敏感性。
[0010]进一步地，本发明提供的具有pH响应的CpG核酸药物输送系统，还可以具有如下技术特征:
[0011 ] 其中，载体的粒径为50nm?150nm，载体中的介孔孔径为7nm?15nm。
[0012]进一步地，其中，CpG核酸药物含有24?72个碱基。
[0013]进一步地，其中，醛基硅烷偶联剂为三乙氧基甲硅烷正丁醛硅烷。
[0014]本发明还提供一种制备具有pH响应的CpG核酸药物输送系统的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0015]步骤一，将表面活性剂和助溶剂完全溶解于一定温度的水中，搅拌30分钟?2小时，得到水溶液，将硅源和有机溶剂混合均匀，加入该水溶液中，缓慢搅拌6小时?24小时，产生白色胶体颗粒，将该白色胶体颗粒用乙醇洗涤3?5次后干燥，干燥后的产物在酸性溶液中回流，去除有机溶剂，得到介孔氧化硅纳米颗粒；
[0016]步骤二，将醛基娃烧偶联剂和步骤一中得到的介孔氧化娃纳米颗粒以0.5mL:1g?1.5 m L:1 g的比例加入到无水甲苯中，在隔绝空气、8 O °C?110 °C的条件下，冷凝回流12小时?36小时，离心、洗涤、真空干燥，得到载体；
[0017]步骤三，将步骤二中得到的载体分散于缓冲液中得到悬浮液，将浓度为IygAxL?3yg/yL的CpG核酸药物按质量比1:2?1:50的比例，加入到该悬浮液中，在振荡器中室温振荡4小时?8小时，离心分离，用缓冲液洗涤，得到CpG核酸药物输送载体系统。
[0018]进一步地，本发明提供的具有pH响应的CpG核酸药物输送系统的方法，还可以具有如下技术特征:
[0019]其中，在步骤一中，表面活性剂:助溶剂:水:硅源:有机溶剂的摩尔比为0.8?1.2:0.35?0.53:986?1480:2.6?3.9:55?83。
[0020]进一步地，其中，在步骤一中，一定温度为60°C?80°C。
[0021]进一步地，其中，表面活性剂为十四烷基三甲基卤化铵、十六烷基三甲基卤化铵、十八烷基三乙基卤化铵中的任意一种或几种的混合物；
[0022]助溶剂为三乙醇胺、丙三醇中的任意一种或二者的混合物；
[0023]硅源为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯中的任意一种或二者的混合物；
[0024]有机溶剂为环己烷、正己烷中的任意一种或者二者的混合物；
[0025]酸性溶液为浓盐酸-乙醇溶液，浓盐酸与乙醇的体积比为4:100?8:100;
[0026]缓冲液为pH8.1的磷酸盐缓冲液。
[0027]进一步地，其中，在步骤一中，酸性溶液中回流的次数为3?5次，每次的时间为24小时?48小时。
[0028]发明作用与效果
[0029]根据本发明的具有pH响应的CpG核酸药物输送系统，由于载体与CpG核酸药物通过亚胺键共价连接，亚胺键具有PH敏感性，在中性条件下能够保持稳定，并在酸性条件下断裂，释放出CpG药物;此外，载体为介孔氧化硅纳米颗粒，易被免疫细胞摄取。因此，本发明提供的具有PH响应的CpG核酸药物输送系统进入人体后，能够在血清及体液的中性环境中保持稳定，在被免疫细胞细胞吞噬后能够到达细胞内的溶酶体，并且在溶酶体的弱酸性环境下释放出游离CpG药物，实现了CpG核酸药物的可控释放;释放出的游离CpG药物能够与细胞内的TLR-9受体结合，并促进免疫细胞分泌包括IL-6在内的一系列细胞因子，从而诱导并增强免疫反应，诱导效率高。
[0030]根据本发明的具有pH响应的CpG核酸药物输送系统的制备方法，由于采用本发明提供的方法合成得到了介孔氧化硅纳米颗粒，该制备得到的介孔氧化硅纳米颗粒的粒径在20nm?10nm范围内，药物输送系统更容易被免疫细胞摄取，并且该颗粒表面富含羟基，通过醛基硅烷偶联剂即可修饰得到醛基，该醛基能够与5’端氨基修饰的CpG核酸药物上的5’氨基反应，并通过亚胺键连接，得到通过亚胺键连接的载体-CpG核酸药物输送系统，该药物输送系统即为具有PH响应的CpG核酸药物输送系统。
【附图说明】
[0031]图1为实施例一制备的介孔氧化硅纳米颗粒的扫描电镜(SEM)图；
[0032]图2为实施例一制备的介孔氧化硅纳米颗粒的透射电镜(STEM)图；
[0033]图3为实施例一制备介孔氧化硅纳米颗粒在醛基硅烷偶联剂修饰前后的氮气吸附-脱附等温线及孔径分布曲线；
[0034]图4为实施例一制备的介孔氧化硅纳米颗粒、载体颗粒和CpG核酸药物输送系统的傅里叶红外特征曲线；
[0035]图5为实施例二中载体颗粒的细胞毒性柱状图；
[0036]图6为实施例三中FITC修饰的CpG核酸药物输送系统的细胞摄取情况；
[0037]图7为实施例四中，CpG核酸药物输送系统在细胞摄取后，诱导分泌IL-6的结果。
【具体实施方式】
[0038]以下结合实施例及附图来说明本发明的【具体实施方式】，在下述各实施例中，未注明的具体条件均遵照相关实验的常规条件或材料供应商建议。
[0039]【实施例一】
[0040]本实施例一为本发明提供的具有pH响应的CpG核酸药物输送系统的制备实验。[0041 ]在本实施例中，所采用的CpG核酸药物为含有72个碱基对的5’端氨基修饰的CpG寡脱氧核苷酸，其序列为:
[0042]5 ’ -NH2- (CH2) 6_TCAGAGAGTTAGAGAGTTAGAGAGTCAGAGAGTTAGAGAGTTAGAGAGTCAGAGAGTTAGAGAGTTAGAGAG-3，。
[0043]在本实施例中，采用的醛基硅烷偶联剂为三乙氧基甲硅烷正丁醛硅烷，硅源为正硅酸乙酯，表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵，助溶剂为三乙醇胺，缓冲液为pH 8.1的磷酸盐缓冲液。
[0044]本发明提供的具有pH响应的CpG核酸药物输送系统的制备步骤如下所述:
[0045]步骤一:将Ig十六烷基三甲基溴化铵和0.18g三乙醇胺加入60mL去离子水，将温度保持在60°C左右，搅拌至少I小时；
[0046]体系澄清后，将20mL环己烷溶液(其中含有正硅酸四乙酯ImL)加入上述澄清体系中，温度保持在60°C，搅拌18小时后，产生白色沉淀；
[0047]离心收集上述白色沉淀，用乙醇洗涤该白色沉淀，加入浓盐酸-乙醇溶液(浓盐酸:乙醇的体积比为8:100)，回流12小时，重复3次，离心收集得到的白色沉淀并用乙醇洗涤，真空干燥(温度为60°C)，得到介孔氧化硅纳米颗粒；
[0048]步骤二:取125mg步骤一制备得到的介孔氧化硅纳米颗粒，超声分散于无水甲苯，得到悬浮液；
[0049]将0.1mL三乙氧基甲硅烷基正丁醛硅烷加入上述悬浮液，在冷凝回流装置中，90°C、隔绝空气的条件下回流20小时；
[0050]上述反应结束后，用无水甲苯洗去未反应的三乙氧基甲硅烷基正丁醛硅烷，将得到的固体进行真空干燥，得到醛基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，该醛基偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米颗粒即为载体颗粒(以下称载体颗粒)；
[0051]步骤三:将CpG核酸药物溶于缓冲液，配制成IygAxL的溶液，保存在-20°C备用，使用时先解冻至室温，该CpG药物为5，端修饰氨基的CpG寡核苷酸；
[0052]将步骤二中得到的载体颗粒分散于缓冲液，配制成IygAxL的悬浮液，将该悬浮液和上述CpG核酸药物溶液以质量比为1:1混合，制得二者的混悬液，然后在振荡器中，室温振荡4小时，离心分离，缓冲液洗涤后滤出固体，即得到具有PH响应的CpG核酸药物输送系统。
[0053 ]图1为实施例一制备的介孔氧化硅纳米颗粒的扫描电镜(SEM)图。
[0054]图2为实施例一制备的介孔氧化硅纳米颗粒的透射电镜(STEM)图。
[0055]将实施例一制备得到的介孔氧化硅纳米颗粒在扫描电镜和透射电镜下观察，结果如图1及图2所示，该介孔氧化硅纳米颗粒为球形颗粒，粒径为SOnm左右，粒径分布均匀，分散性好，其中的介孔孔道呈树枝状分布。
[0056]图3为实施例一制备介孔氧化硅纳米颗粒在醛基硅烷偶联剂修饰前后的氮气吸附-脱附等温线及孔径分布曲线。
[0057]将本实施例制备的介孔氧化硅纳米颗粒及载体颗粒进行氮气吸附-脱附实验，结果如图3所示，图中，DMSN为介孔氧化硅纳米颗粒，DMSN-CHO为载体颗粒。根据该等温曲线，计算得到介孔氧化硅纳米颗粒和载体颗粒的BET比表面积分别为768m2/g和540m2/g;采用BJH方法，计算得到介孔氧化娃纳米颗粒和载体颗粒的平均介孔孔径分别为9nm和7.7nm。
[0058]图4为实施例一制备的介孔氧化硅纳米颗粒、载体颗粒和CpG核酸药物输送系统的傅里叶红外特征曲线。
[0059]将本实施例制备的介孔氧化硅纳米颗粒、载体颗粒和CpG核酸药物输送系统进行傅里叶红外特征曲线测试实验，结果如图4所示，图中，DMSN为介孔氧化硅纳米颗粒，DMSN-CHO为载体颗粒，DMSN-CHO-CpG为CpG核酸药物输送系统。从图中可看出，与介孔氧化硅纳米颗粒相比，载体颗粒在1709cm—1处出现明显的醛基吸收峰，说明该载体颗粒表面分布有醛基;而与载体颗粒相比，CpG核酸药物输送系统在该处的吸收峰消失，而出现了明显的亚胺键的吸收峰(1636cm—1处)，说明CpG核酸药物通过亚胺键与载体颗粒上的醛基结合，从而被固定在载体颗粒上。
[0060]实施例作用与效果
[0061]根据本实施例提供的方法，能够制备得到介孔氧化硅纳米颗粒，该颗粒的粒径为SOnm左右，介孔孔道呈树枝状分布，比表面积为768m2/g，介孔孔径为9nm;根据本实施例提供的方法可以对该介孔氧化硅纳米颗粒进行修饰，得到载体颗粒，该载体颗粒的比表面积为540m2/g，介孔孔径为7.7nm，表面分布有醛基;根据本实施例提供的方法还可以将CpG核酸药物通过亚胺键固定到载体颗粒上，得到CpG核酸药物输送系统，该亚胺键具有pH敏感性，在中性环境下稳定，在弱酸性环境下易断裂，释放出CpG核酸药物，因此根据本实施例提供的方法制备得到的CpG核酸药物输送系统具有pH响应性。
[0062]【实施例二】
[0063]取实施例一制备得到的载体颗粒进行细胞毒性测定，测定方法采用标准的CellCounting Kit-8方法。本实施例中，巨噬细胞株RAW264.7细胞购买于日本Riken，并按供应商提供的方法进行培养。
[0064]具体实验过程如下:
[0065]将实施例一制备得到的载体颗粒分散于MEM培养基并配制成浓度为lmg/mL的悬浮液，当RAW264.7细胞播种在96孔板中(细胞密度为5000个/孔)后，将上述载体颗粒的悬浮液加到96孔板中，终浓度分别为0,25,50,75,100和20(^8/1^，溶液体积为10(^匕
[0066]将五种不同浓度的载体颗粒悬浮液及没有加入载体颗粒的空白对照组分别与细胞共培养24小时，然后向每孔中加入I OyL的CCK-8溶液，细胞继续培养I小时后用酶标仪(MTP-880)测定450nm波长处的吸光度。经过载体颗粒处理的RAW264.7细胞与未经载体颗粒处理的RAW264.7细胞中的活细胞数量的比值为细胞毒性。
[0067]图5为实施例二中载体颗粒的细胞毒性柱状图。
[0068]实验结果如图5所示，与空白对照组相比，实施例一制备得到的载体颗粒在浓度达到200yg/mL仍然没有表现出细胞毒性。
[0069]实施例作用与效果
[0070]根据本实施例提供的测定方法，与空白对照组相比，载体颗粒在浓度达到200yg/mL仍然没有细胞毒性，说明根据实施例一提供的方法制备得到的载体颗粒具有良好的生物相容性，符合药物输送系统中对载体的生物相容性的要求。
[0071]【实施例三】
[0072]本实施例采用荧光标记法，对根据实施例一提供的方法制备得到的CpG核酸药物输送系统进行细胞摄取实验。
[0073]本实施例采用荧光标记物FITC对实施例一中的CpG核酸药物进行修饰，得到FITC修饰的CpG核酸药物。然后将该FITC修饰的CpG核酸药物作为CpG核酸药物，根据实施例一所提供的制备方法，制备得到FITC修饰的CpG核酸药物输送系统。
[0074]将1.5 X 14个RAW264.7细胞播种于一个35mm的玻璃底培养皿，培养24小时后，将FITC修饰的CpG核酸药物输送系统加入培养皿，终浓度为100yg/mL。继续培养细胞，4小时后用缓冲液洗涤2次并用4% (质量百分数)的甲醛溶液固定细胞10分钟;再用缓冲液洗涤两次后，用0.2 % (质量百分数)吐温-20溶液于室温下处理细胞10分钟，随后用LAMPl抗体进行细胞染色处理I小时，缓冲液洗涤2次，然后用Alexa Fluor 555goat ant1-rabbit IgG染色I小时，缓冲液洗涤2次。最后，细胞用莱卡SP5共聚焦荧光显微镜观察细胞摄取CpG核酸药物输送系统情况。
[0075]图6为实施例三中FITC修饰的CpG核酸药物输送系统的细胞摄取情况。
[0076]结果如图6所示，FITC修饰的CpG核酸药物输送系统能够很好的被细胞吞噬，并且分布在细胞的溶酶体中(图中的亮色部分)。
[0077]实施例作用与效果
[0078]由于FITC为荧光染色剂，对细胞的摄取作用不产生影响，根据本实施例提供的测定结果，证明实施例一制备得到的CpG核酸药物输送系统能够很好的被细胞吞噬，并且分布在细胞的溶酶体中。
[0079]【实施例四】
[0080]本实施例采用根据实施例一提供的方法制备得到的CpG核酸药物输送系统，测定在细胞溶酶体弱酸性条件刺激下，该输送系统诱导IL-6的分泌情况。[0081 ] 将Raw264.7细胞播种于96孔板，密度为I X 15个/孔，培养24小时后，将配制好的CpG核酸药物输送系统加入到细胞培养孔中，终浓度为lyg/mL。继续培养6小时后，收集细胞，抽提其中的RNA，并按供应商提供的方法对RNA进行DNase I消化处理，得到总RNA。采用primeScript? RT试剂盒(购自日本Takara公司)对得到的总RNA进行反转录，得到cDNA。IL-6的分泌水平用RT-PCR法测定。
[0082]图7为实施例四中，CpG核酸药物输送系统在细胞摄取后，诱导分泌IL-6的结果。
[0083]如图7所示，载体颗粒(图中表示为“DMSN-CH0”)本身几乎不会对IL-6的分泌产生影响;与游离的CpG寡脱氧核苷酸(图中表示为“free CpG”)相比，根据实施例一提供的方法制备得到的CpG核酸药物输送系统(图中表示为“DMSN-CHO-CpG” )具有非常高的IL-6诱导分泌能力。
[0084]实施例的作用与效果
[0085]根据本实施例提供的测定方法，结果表明，根据实施例一提供的方法制备得到的CpG核酸药物具有非常高的IL-6诱导分泌能力，这种诱导能力远高于游离的CpG核酸药物，并且该诱导作用不是载体颗粒本身产生的。
[0086]综上所述，根据实施例一提供的方法可以得到具有pH响应的CpG核酸药物输送系统，其中CpG核酸药物与载体通过亚胺键共价连接，该亚胺键具有pH敏感性，在CpG核酸药物输送系统被免疫细胞摄取并到达溶酶体后，能够在溶酶体的弱酸性条件下释放出游离的CpG核酸药物，诱导免疫细胞分泌IL-6等细胞因子;该CpG核酸药物输送系统的诱导作用远高于游离的CpG核酸药物。
[0087]此外，载体颗粒本身具有良好的生物相容性，其粒径在80nm左右，因此能够促进免疫细胞对CpG核酸药物输送系统的摄取，并使细胞摄取后CpG核酸药物输送系统能够分布在溶酶体内；载体颗粒中的介孔孔径在7.7nm左右，并且介孔呈树枝状分布，使CpG核酸药物能够被固定在介孔的孔道内，避免在输送过程中，CpG核酸药物在血清中发生降解。
[0088]上述实施例仅用于说明本发明的【具体实施方式】，而非用于限定本发明的保护范围，依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均归结在本发明的保护范围之内。例如，本发明所采用的CpG核酸药物还可以是5’端修饰有氨基的其他序列的CpG寡核苷酸，长度为24?72个碱基对;载体颗粒的粒径可以是50nm?150nm范围内的任意粒径，载体颗粒的介孔孔径可以是7nm?15nm范围内的任意孔径。
【主权项】
1.一种具有pH响应的CpG核酸药物输送系统，包括载体及CpG核酸药物，其特征在于:其中，所述载体为醛基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，所述CpG核酸药物为5 ’端修饰氨基的CpG寡核苷酸， 所述载体和所述CpG核酸药物通过亚胺键共价连接，该亚胺键具有pH敏感性。2.根据权利要求1所述的具有pH响应的CpG核酸药物输送系统，其特征在于: 其中，所述载体的粒径为50nm?150nm，所述载体中的介孔孔径为7nm?15nm。3.根据权利要求1所述的具有pH响应的CpG核酸药物输送系统，其特征在于: 其中，所述CpG核酸药物含有24?72个碱基。4.根据权利要求1所述的具有pH响应的CpG核酸药物输送系统，其特征在于: 其中，所述醛基硅烷偶联剂为三乙氧基甲硅烷正丁醛硅烷。5.—种制备如权利要求1所述的具有pH响应的CpG核酸药物输送系统的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一，将表面活性剂和助溶剂完全溶解于一定温度的水中，搅拌30分钟?2小时，得到水溶液，将硅源和有机溶剂混合均匀，加入该水溶液中，缓慢搅拌6小时?24小时，产生白色胶体颗粒，将该白色胶体颗粒用乙醇洗涤3?5次后干燥，干燥后的产物在酸性溶液中回流，去除有机溶剂，得到介孔氧化硅纳米颗粒； 步骤二，将所述醛基硅烷偶联剂和步骤一中得到的所述介孔氧化硅纳米颗粒以0.5mL:1g?1.5mL:1g的比例加入到无水甲苯中，在隔绝空气、80 °C?110°C的条件下，冷凝回流12小时?36小时，离心、洗涤、真空干燥，得到所述载体； 步骤三，将步骤二中得到的所述载体分散于缓冲液中得到悬浮液，将浓度为lyg/yL?3PgAiL的所述CpG核酸药物按质量比1:2?1:50的比例，加入到该悬浮液中，在振荡器中室温振荡4小时?8小时，离心分离，用缓冲液洗涤，得到所述CpG核酸药物输送载体系统。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 其中，在步骤一中，表面活性剂:助溶剂:水:硅源:有机溶剂的摩尔比为0.8?1.2:0.35?0.53:986?I480:2.6?3.9:55?83。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 其中，在步骤一中，所述一定温度为60 °C?80 0C。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 其中，所述表面活性剂为十四烷基三甲基卤化铵、十六烷基三甲基卤化铵、十八烷基三乙基卤化铵中的任意一种或几种的混合物； 所述助溶剂为三乙醇胺、丙三醇中的任意一种或二者的混合物； 所述硅源为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯中的任意一种或二者的混合物； 所述有机溶剂为环己烷、正己烷中的任意一种或者二者的混合物； 所述酸性溶液为浓盐酸-乙醇溶液，浓盐酸与乙醇的体积比为4:100?8:100; 所述缓冲液为pH 8.1的磷酸盐缓冲液。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 其中，在步骤一中，所述酸性溶液中回流的次数为3?5次，每次的时间为24小时?48小时。
【文档编号】A61P35/00GK105944113SQ201610450081
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】朱钰方, 徐怡
【申请人】上海理工大学