亲水活性化合物的纳米包封的制作方法

亲水活性化合物的纳米包封的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种包含水溶性蛋白质、葡聚糖和亲水活性剂的纳米颗粒，所述葡聚糖由偏磷酸盐至少部分交联。
【专利说明】
亲水活性化合物的纳米包封
技术领域
[0001] 本发明一般地涉及包含亲水活性化合物的纳米颗粒和用于它们的制备的纳米包 封方法。
[0002] 发明背景
[0003] 大部分肽和蛋白质药物仍然通过每日注射施用，因此伴随有依从性问题、疼痛相 关的问题和对患者的严重不便利。因此，需要用于这样的药物的延长的可注射的递送系统 或非-侵入性递送系统。
[0004] 口服途径提供了高患者接受度和依从性的自身给药的优势。
[0005] 肽和蛋白质的口服和可注射的延长的释放递送仍是富有挑战的并且一直是需要 每日施用的肠胃外常规递送的最有吸引力的代替。尽管在过去二十年间投入大量努力，由 于与这些亲水大分子较差的肠膜渗透性、有限的口服生物利用度、在肠内的不稳定性和广 泛的快速代谢相关的一些缺点和障碍，没有出现用于亲水的有效的大分子的口服递送的可 行的解决方案。
[0006] 出于开发具有显著的生物利用度的口服蛋白质递送系统的目的，可以采用三种方 法：
[0007] (a)大分子的物理化学性质的改性；
[0008] (b)大分子的新的官能化;或者
[0009] (C)使用经由纳米载体的改进的载物递送(cargo delivery)。
[0010] 然而，无论哪种方法，保持蛋白质的初始生物学活性是必要的。口服递送系统将需 要显著地提高此类大分子的肠膜渗透性，以取得被考虑进行进一步临床试验的可能性的机 会。已经使用一些纳米颗粒递送系统和微米颗粒递送系统来改善亲水大分子的口服吸收并 且表现出有前景的结果，但仍受肠吸收和药物稳定性保护的限制。
[0011]已经发现纳米尺寸的系统(例如，脂质体、脂质和聚合物纳米颗粒、胶束等）比用于 蛋白质递送的传统制剂有利。预计生物技术药物将在不久的将来成为治疗剂的主要来源 [1]。然而，此类分子的治疗性利用依赖于开发能够令人满意地克服其使用的内在限制（即 低口服生物利用度和生物学和物理化学不稳定性)的适当的制剂的可能性。然而，由于它们 的蛋白质水解不稳定性和有限的穿过生物屏障的能力，蛋白质药物的口服施用遇到许多障 碍。基于脂质体和胶束的递送系统在肠腔中不稳定，并且不能对敏感的大分子产生足够的 保护。
[0012] 因此，在药物制剂中，已经成功地探索了纳米颗粒用于肽类药物的药物递送[2- 4]。纳米颗粒，更具体地，可生物降解的聚合物纳米颗粒，具有优异的组织生物相容性、可生 物降解性、组成灵活性和小尺寸，使它们适用于多种应用。此外，这些制剂表现出在口服施 用后提高药物生物利用度[5]。
[0013] 尽管用可生物降解的聚合物包封很吸引人，但是对于亲水大分子而言，制造工艺 仍然是复杂且昂贵的。在将蛋白质药物有效包封进这些系统的方法的情况中，使用聚合物 包封可以提供(a)在储存和递送期间保护蛋白质免于降解和(b)当需要时的持续释放特性
[6-8]ο
[0014] 参考文献
[0015] [l]Tsuji,K.,Tsutani,K.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2008,68,496-502
[0016] [2]Joshi,M.D.,Muller,R.H.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2009,71,161-172
[0017] [3]Kluge，J.，Fusaro，F.，Muhrer，G.，Thakur，R.，Mazzotti，Μ·， J.Supercrit.Fluids,2009,48,I76-182
[0018] [4]Mehnert,ff.,Mader,K.Adv.Drug Deliv.Rev.,2001,47,165-196
[0019] [5]Gursoy RN,Benita S.,Biomed Pharmacother.,2004,58,173-82
[0020] [6]Almeida，A.J.，Souto，E.Adv.Drug Deliv.Rev.，2007,59,478_490
[0021] [7]Bilati,U.,Allemann,E.,Doelker,E.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2005,59,375-
[0022] [8]Mundargi，R.C.，Babu，V.R·，Rangaswamy，V.，Patel，P.，Aminabhavi， T.M.J·Control.Release，2008，125，193-209
[0023] [9]W0 2012/101639
[0024] 发明概述
[0025] 本发明提供了用于保护和控制肽类药物释放的亲水生物大分子的纳米包封。此新 的策略允许负载于纳米颗粒内的小肽类药物种类的受控的释放，而不是当在聚合物的混合 物中微米包封时溶解的药物在黏膜附近释放，或可选择地，当使用已经描述的纳米喷雾干 燥技术双重纳米包封时，在肠胃外施用后溶解的药物在黏膜附近释放[9]。此类包封在口服 施用的情况中提供使敏感的大分子免于酸性环境以及无论施用途径如何，免于被蛋白水解 酶降解的保护。
[0026] 因此，在本发明的一个方面，提供了包含水溶性蛋白质、葡聚糖和亲水活性剂的纳 米颗粒，所述葡聚糖由偏磷酸盐至少部分交联。
[0027] 如本文使用的，本发明的"纳米颗粒"是一种颗粒物，为纳米胶囊(NC)或纳米球 (NS)，其是生物相容的并足够耐化学和/或物理破坏，这样使得足够量的纳米颗粒在施用至 人或动物体内后基本上保持完整并持续足够的时间以能够到达期望的靶组织(器官）。通 常，纳米颗粒是球形的形状，具有最高700nm的平均直径。在颗粒的形状不是球形的情况下， 直径指的是颗粒的最长的尺寸。
[0028] 根据与亲水活性剂相关的各种参数(例如，溶解度、分子量、极性、电荷、反应性、化 学稳定性、生物活性及其它），试剂可以包含于(包封于)所述纳米颗粒中，和/或嵌在制成纳 米颗粒的基质中。对于所选择的应用，纳米颗粒可以因此呈核/壳的形式(在下文中还被叫 作纳米胶囊），具有聚合物壳和包含至少一种亲水活性剂的核。
[0029]可选择地，纳米颗粒可以是基本均匀的、不具有明显的核/壳结构特征的组合物。 在本文中，这些纳米颗粒指的是纳米球(NS)。
[0030] 在一些实施方案中，纳米颗粒选自纳米球和纳米胶囊。
[0031] 在其他实施方案中，平均直径在约IOOnm和200nm之间。在其他实施方案中，平均直 径在约200nm和300nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约300nm和400nm之间，平均直 径在400nm和500nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约600nm和700nm之间。
[0032] 在一些其他实施方案中，平均直径在约50nm和700nm之间。在其他实施方案中，平 均直径在约50nm和500nm之间。在其他实施方案中，平均直径在约50nm和400nm之间。在另外 的实施方案中，平均直径在约50nm和300nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约50nm 和200nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约50nm和IOOnm之间。
[0033] 纳米颗粒的每一个可以基本上具有相同的形状和/或尺寸。在一些实施方案中，纳 米颗粒具有这样的直径分布，使得不超过〇. 01 %至10 %的颗粒具有大于以上提及的平均直 径之上10%或小于平均直径之下10%的直径，并且在一些实施方案中，使得不超过0.1%、 0·2%、0·4%、0·6%、0·8%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%或 9%的纳米颗粒具有大 于上述提及的平均直径之上10%或小于平均直径之下10%的直径。
[0034] "水溶性蛋白质"是一种属于具有允许与溶解介质（即水)形成偶极子-偶极子相互 作用、使蛋白质可溶于水的结构的一类蛋白质。蛋白质可以是线性的，或具有球状结构（即， 具有球状四级结构，其中疏水氨基酸被定向为朝向结构的内侧，而亲水氨基酸被定向为朝 向外侧）。
[0035] 在一些实施方案中，水溶性蛋白质是白蛋白。
[0036] 在其它实施方案中，白蛋白可以选自人血清白蛋白（HSA)和牛血清白蛋白（BSA)。
[0037] 如本文使用的，"葡聚糖"意指包括由糖苷键连接在一起的糖单体的多糖。葡聚糖 可以是或葡聚糖，并且可以是天然的、合成的或半合成来源的。
[0038] 在一些实施方案中，葡聚糖是α-葡聚糖。
[0039] 该至少一种葡聚糖可以是两种或更多种葡聚糖的组合(例如，混合物）。该至少一 种葡聚糖可以是本领域已知的一种或更多种葡聚糖。该至少一种葡聚糖的非限制性实例为 氧化的纤维素、普鲁兰糖(pullulan)、淀粉、糖原、右旋糖酐、地衣多糖、甘露聚糖、半乳甘露 聚糖、阿拉伯木聚糖、半乳聚糖(galacton)及其任何衍生物。
[0040] 在一些实施方案中，该至少一种葡聚糖是右旋糖酐。
[00411在其他实施方案中，葡聚糖可以具有在约5KDa(千道尔顿）和2000KDa之间的分子 量。
[0042]在本发明的纳米颗粒中，葡聚糖是"至少部分交联的"；至少一些葡聚糖分子经由 交联剂相互连接以形成三维结构。葡聚糖可以是至少1%交联的（即，葡聚糖的全部-OH基团 的1 %与交联剂键合），至少2 %交联的，至少5 %交联的，至少10 %交联的，至少20 %交联的， 或甚至至少30%交联的。
[0043]交联可以由任何已知的交联剂进行。在一些实施方案中，交联通过使用偏磷酸盐 实现。在一些实施方案中，交联可以通过使用交联剂的组合实现，其至少一种是偏磷酸盐试 剂。
[0044] 在一些实施方案中，一种或更多种偏磷酸盐被用作交联剂以至少部分地交联葡聚 糖。术语"偏磷酸盐"意指包括具有经验式P〇3_的含氧阴离子，并且可以被描述为具有由PO 4 结构单元组成的结构。在一些实施方案中，偏磷酸盐选自三偏磷酸钠（STMP)、三磷酸五钠 (STPP)和氯化氧磷(POCl 3)。
[0045] 在一些实施方案中，偏磷酸盐是三偏磷酸钠(STMP)，其具有以下式：
[0046]
[0047] 不希望囿于理论，STMP仅与葡聚糖的羟基(-OH)基团反应。与用于类似的系统的典 型的交联剂诸如戊二醛不同，STMP不与-NH 2基团结合。从而防止由于不期望的结合所致的 亲水活性剂活性的妨碍，同时保持用作活性化合物的载体和/或保护容器的交联的纳米颗 粒的形成。因此，交联的葡聚糖形成用于携带蛋白质（即白蛋白）的特定结构;而蛋白质继而 来充当亲水活性剂载体和保护层。
[0048] 在一些实施方案中，葡聚糖(例如，右旋糖酐)和偏磷酸盐(例如，STMP)之间的比在 1:10和3:4(w/w)之间。在其他实施方案中，此比可以为1: 1、1:2、1:4、1:10、2:1和3:4(w/w) 的葡聚糖(例如，右旋糖酐)比偏磷酸盐(例如，STMP)。
[0049] 如上所述，本发明的纳米颗粒还包括至少一种"亲水活性剂"。亲水活性剂可以在 用于在受试者(人或非人）中治疗或预防疾病或紊乱的活性亲水药物中选择。活性药物可以 以非限制性的方式选自，维生素、蛋白质、抗氧化剂、肽、多肽、脂质、碳水化合物、激素、抗 体、单克隆抗体、疫苗、预防剂、诊断剂、造影剂、核酸、营养剂、分子量小于约l，〇〇〇Da或小于 约500Da的小分子、电解质、药物、免疫剂和前述的任何组合。
[0050] 在一些实施方案中，亲水活性剂可以在激素中选择。
[0051]在一些实施方案中，亲水活性剂选自胰岛素、艾塞那肽(exenatide)、生长激素(例 如，生长素 （somatotropin ))、醋酸奥曲肽、醋酸兰瑞肽、goserol inacetate、copaxone、依那 西普或单克隆抗体，诸如西妥昔单抗、曲妥珠单抗、阿达木单抗、贝伐单抗和其他。
[0052] 在一些实施方案中，亲水活性剂具有-NH2末端部分或-NH2悬挂部分。由于STMP不与 此类亲水活性剂的-NH2基团反应，在交联过程期间在STMP和活性剂之间不发生交联或任何 化学反应。这导致活性剂包封于纳米颗粒内，而不破坏或影响其活性和/或结构。
[0053]本发明的纳米颗粒可以被用作递送媒介物，所述递送媒介物用于将宽范围的亲水 活性剂局部地、经眼地、经口地、通过吸入、经鼻地或胃肠外地递送至循环系统。本发明的纳 米颗粒递送系统有利于靶向的药物递送和受控的释放应用，还由于清除率的降低提高在作 用位点的药物生物利用度、降低给药频率和最小化副作用。本发明的纳米颗粒可以以干粉 的形式使用（以原样施用，例如，用于可吸入的组合物），或可以在水性介质中重构以形成可 注射的制剂。
[0054]当需要时，为了提供活性化合物抗不同环境的另外的保护和稳定，本发明的纳米 颗粒可以进一步被包封成更大的颗粒，即，用于胃肠外施用的纳米胶囊或用于口服施用的 微米颗粒。
[0055]因此，在本发明的另一个方面，本发明提供了一种包含疏水聚合物和多个如本文 定义的本发明的纳米颗粒的载体，所述多个纳米颗粒(i)被疏水聚合物例如PLGA包封(即形 成双层纳米包封）；或（ii)被嵌入在基质中，诸如由疏水聚合物混合物形成的基质。此类聚 合物混合物可以是Eudragi t: HPMC混合物，其中Eudragi t具有依赖pH的溶解度，而无论pH如 何HPMC是水溶的。
[0056] 此类进一步包封可以导致包含纳米颗粒的多种结构。例如，当纳米颗粒是纳米球 时，疏水聚合物可以通过形成外壳包封纳米球，即，形成包括纳米球的纳米胶囊(一级NS于 二级NC中）。可选择地，疏水聚合物可以呈纳米球被嵌入在其中的基质的形式(一级NS于二 级微米球中）。
[0057]类似地，当纳米颗粒是纳米胶囊时，疏水聚合物可以包封纳米胶囊(一级NC于二级 NC中），或可以呈基质的形式(一级NC于二级微米球中）。
[0058]在一些实施方案中，药物载体可以呈选自纳米胶囊、纳米球及其混合物的形式。
[0059] 术语"疏水聚合物"指具有很小或没有吸收水的倾向的聚合物材料。不希望囿于理 论，此类聚合物充当在水性环境中的亲水活性剂的保护层或递送基质。疏水聚合物还可用 于赋予本发明的载体缓慢释放或控制释放特性，以预定方式释放亲水活性剂。
[0060] 在一些实施方案中，疏水聚合物选自聚(乳酸羟基乙酸）（PLGA)、聚甲基-丙烯酸甲 酯(PMMA)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚（乳酸）（PLA)、聚(乳酸羟基乙酸共聚物）（PLG)、聚 (丙交酯）、聚羟基乙酸(PGA)和聚(羟基丁酸）。
[0061 ] 在一些实施方案中，疏水聚合物选自聚(乳酸羟基乙酸）(PLGA)、聚(乳酸）（PLA)和 聚(乳酸羟基乙酸共聚物）(PLG)。
[0062] 载体通常可以是一般的球形的形状，在一些实施方案中，具有在约200nm至900nm 之间的直径。在其他实施方案中，载体的直径可以在约200nm和800nm之间、在约200nm和 700nm之间、在约200nm和600nm之间或在200nm和500nm之间。在一些其他实施方案中，载体 的直径可以在约300nm和900nm之间、在约400nm和900nm之间、在约500nm和900nm之间、在约 600nm和900nm之间或在约700nm和900nm之间。
[0063] 本发明的纳米颗粒和/或载体可以被配制成药物组合物。因此，在另一方面，本发 明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文描述的本发明的纳米颗粒和/或载 体。
[0064] 在另一方面，提供了亲水活性剂的递送系统，所述递送系统包括疏水聚合物以及 包封于所述疏水聚合物中的多个如本文描述的纳米颗粒。
[0065] 本发明的另外的方面提供了亲水活性剂的递送系统，所述递送系统包括形成基质 的疏水聚合物以及嵌入在所述基质中的多个如本文描述的纳米颗粒。
[0066]本发明的递送系统适合于以允许在诸如至少约12小时内，或在一些实施方案中， 至少约24小时内、至少7天或甚至至少2周的时间段内药剂的控制释放的速率来递送活性 剂。这样，递送系统可被用于多种应用，诸如，不限于，药物递送、基因疗法、医学诊断及用于 例如皮肤病理、癌症、病原体传播疾病、激素相关疾病、与器官移植相关的反应副产物及其 他异常的细胞或组织生长的医学治疗。
[0067]纳米颗粒和/或载体在药物组合物中的浓度，可以被选择以使量是足以递送期望 有效量的亲水活性剂至受试者，并根据所选择的特定的施用方式被选择。如已知的，用于本 文目的的"有效量"可通过如本领域已知的此类考虑事项来确定。量必须是有效的以获得期 望的治疗效果，除其他以外，取决于待治疗的疾病的类型和严重程度和治疗方案。通常在合 理设计的临床试验(剂量范围研究）中确定有效量，并且本领域技术人员将了解如何适当地 进行此类试验以确定有效量。如众所周知的，有效量取决于多种因素，除其他以外，其在体 内的分布概况、多种药理学参数诸如在体内的半衰期；取决于不期望的副作用（如果有的 话）；取决于因素诸如年龄和性别以及其他。
[0068] 药物组合物可以还包含药学上可接受的添加剂，所述添加剂可以为，例如媒介物、 佐剂、赋形剂或稀释剂，并且是本领域技术人员众所周知的并且是公众容易得到的。应注意 到，药学上可接受的添加剂对与活性剂化学惰性的并且在使用条件下不具有有害的副作用 或毒性。此外，组合物可以包含其他标准的添加剂，诸如软化剂(emollient)、湿润剂、增稠 剂、乳化剂、中和剂、着色剂、香料、吸收剂(absorber)或填充剂、防腐剂和/或胶凝剂。
[0069] 在一些实施方案中，药物组合物适合于所述亲水活性剂的局部、口服、吸入、经鼻、 透皮、经眼或胃肠外施用。在其他实施方案中，药物组合物适合于所述亲水活性剂的口服施 用。在一些其他实施方案中，药物组合物适合于所述亲水活性剂通过注射的施用。
[0070] 添加剂的选择将部分地由特定活性剂以及用于施用组合物的特定方法或递送系 统确定。
[0071] 适于口服施用的药物组合物可以由以下组成：（a)液体溶液，诸如溶解于稀释剂诸 如水、生理盐水或橙汁中的有效量的化合物；（b)胶囊、小袋、片剂、锭剂(lozenge)和糖锭剂 (troch)，每个包含预定量的作为固体或颗粒的活性成分;和（c)粉末;胶囊形式可以是包 含，例如，表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂，诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉的一般的 硬壳或软壳明胶类型。片剂形式可包含乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻 酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂 酸锌、硬脂酸，以及其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和 药理学上相容的载体中的一种或多种。锭剂形式可包含于调味剂(通常是蔗糖和阿拉伯树 胶或黄蓍胶）中的活性成分，以及包含于惰性基质(诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶） 中的活性制剂的软锭剂，除活性成分之外包含如载体的乳剂、凝胶以及类似物，此类载体是 本领域已知的。
[0072] 本发明的纳米颗粒，单独地或与其他适当的组分组合，可以被制成经由吸入施用 的气溶胶制剂。这些气溶胶制剂可以被放置于加压的可接受的推进剂中，诸如二氯二氟甲 烷、丙烷、氮气及类似物。它们也可以被配制为用于非加压的制剂的药物，诸如在喷雾器或 雾化器中。
[0073] 适于肠道外施用的组合物包括水性等渗无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲 剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳 定剂和防腐剂的水性无菌悬液。胃肠外制剂通常将在溶液中含有以重量计约0.5%至约 25%的活性成分。适合的防腐剂和缓冲剂可在此类制剂中使用。为了最小化或消除在注射 部位的刺激，此类组合物可以包含具有约12至约17的亲水-亲油平衡值(HLB)的一种或更多 种非离子型表面活性剂。此类制剂中表面活性剂的量的范围为以重量计约5%至约15%。适 合的表面活性剂包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯和环氧乙 烷与通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成的疏水性基质的高分子量加合物。胃肠外制剂可以 存在于单位剂量或多剂量密封容器中，诸如安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干） 条件下，仅需要在即将使用前加入无菌液体载体，例如注射用水。
[0074] 本发明的组合物可以被制成可注射制剂。对用于可注射组合物的有效药物载体的 要求是本领域普通技术人员熟知的。
[0075] 如本文使用的，术语"局部的"指根据本发明的组合物直接应用在受试者的皮肤 (人或非人的皮肤)的至少一部分上，以在应用部位实现期望的作用，例如，美容作用或治疗 作用。
[0076] 本发明的纳米颗粒、载体和/或递送系统可以在生物相容的水溶液中施用。此溶液 可以包括，但不限于生理盐水、水或药学上可接受的介质。
[0077] 可在某一时间间隔之后以单一的剂量或以重复一次或几次的剂量进行递送系统 制剂的施用。适当的剂量可根据诸如根据被治疗个体口授的和直接取决于被治疗个体的治 疗上有效的剂量、施用方式、治疗剂的独特特征及待实现的特定治疗效果的参数变化。适当 的剂量可以由本领域技术人员确立。
[0078] 在一些实施方案中，递送系统还可以包封于可生物降解的胶囊中，通常用于口服 施用。在此类实施方案中，所述可生物降解的胶囊呈肠衣胶囊的形式。
[0079] 在一些其他实施方案中，递送系统适用于所述亲水活性剂的便利的靶向治疗递送 和控制释放施用。
[0080] 本发明的另一方面提供了如本文描述的本发明的纳米颗粒或载体用于制备用于 治疗疾病、紊乱或慢性状况的药物组合物的用途。慢性状况的非限制性实例是糖尿病、肥胖 症、激素缺乏、蛋白质缺乏等。由于本发明的颗粒提供活性剂(例如，激素或蛋白质）的延长 的释放，本发明的这些纳米颗粒的施用可以降低要求的常规治疗的次数，从而产生改善的 患者的生活质量以及提高的患者对治疗的依从性。
[0081] 如本文使用的，术语"治疗"或其任何语言的变化形式，指的是施用有效减轻与疾 病相关的不期望的症状的治疗量的本发明的纳米颗粒或递送系统，以在症状发作之前预防 此类症状的表现、减缓疾病的发展、减缓症状的恶化、稳定慢性状况、增强缓解期的开始、减 缓在疾病发展慢性阶段引起的不可逆的损害、延迟所述发展阶段的开始、减轻疾病的严重 程度或治愈疾病、提高存活率或引起更快的恢复，或防止疾病发作，或以上两种或更多种的 组合。
[0082] 在另一方面，提供了用于制备包含水溶性蛋白质、葡聚糖和亲水活性剂的纳米颗 粒的方法，所述葡聚糖由偏磷酸盐至少部分交联，所述方法包括：
[0083]-将有机溶剂递送(例如通过注射)至包含第一水性溶液和第二水性溶液的混合物 中，所述第一水性溶液包含所述水溶性蛋白质，所述第二水性溶液包含所述亲水活性剂;和
[0084]-将所述偏磷酸盐添加至所述混合物，从而至少部分交联的所述葡聚糖用于获得 所述纳米颗粒。
[0085]在一些实施方案中，所述方法包括：
[0086] -获得第一水性溶液和第二水性溶液的混合物，所述第一水性溶液包含所述水溶 性蛋白质和所述葡聚糖，所述第二水溶液包含所述亲水活性剂；
[0087] -将有机溶剂递送(例如，注射)至所述混合物;和
[0088] -将所述偏磷酸盐添加至所述混合物，从而至少部分交联所述葡聚糖用于获得所 述纳米颗粒。
[0089] 在另外的实施方案中，所述方法包括：
[0090] -将第一水性溶液和第二水性溶液混合以获得混合物，所述第一水溶液包含所述 水溶性蛋白质和所述葡聚糖，所述第二水溶液包含所述亲水活性剂；
[0091] -将有机溶剂递送(例如，注射)至所述混合物;和
[0092] -将所述偏磷酸盐添加至所述混合物，从而至少部分交联所述葡聚糖用于获得所 述纳米颗粒。
[0093] 在另外的实施方案中，有机溶剂通过注射被递送至混合物中。
[0094] 附图简述
[0095] 为了更好地理解本文公开的主题和为了例示主题可以如何在实践中实施，现在将 参考附图通过仅非限制性实例的方式描述实施方案，在附图中：
[0096]图IA是用STMP的右旋糖酐的交联机制的示意性说明；图IB是交联的颗粒的示意性 描绘。
[0097]图2示出了白蛋白的交联反应，该交联反应使白蛋白在水溶液中不溶。
[0098]图3示出了不同艾塞那肽制剂(FI-V)和Byetta的体重结果。
[0099]图4示出了来自使用Byetta的预实验的血糖水平。
[0100]图5示出了来自不同艾塞那肽制剂(FI-V)和Byetta的血糖水平。
[0101] 图6示出了不同组在不同天的血浆胰岛素水平。
[0102] 图7A示出了不同组在不同天的糖基化血红蛋白水平；图7B示出了在10天的治疗中 糖基化血红蛋白水平的总平均值。
[0103] 图8A-8B代表DX-50NP制剂（图8A)和DX-150NP制剂（图8B)的冷冻-TEM图像。
[0104] 图 9A-9C 示出了 Glut-IMP 制剂（图 9A)、DX_5〇MP 制剂（图 9B)和 DX-I5OMP 制剂（图 9〇 的XHR-SEM图像。
[0105] 图10示出了以20yg/大鼠（56yg/kg)的剂量皮下注射Byetta?和艾塞那肽溶液后和 以50yg/大鼠（对于DEX50和DEX150，分别为165和65yg/kg)的剂量口服施用不同制剂后大鼠 中艾塞那肽的药物动力学谱。
[0106] 图IIA-IIC是冷冻-保护步骤后双重包封的BSA/胰岛素 NP的冷冻断裂SEM图像。
[0107] 图12示出了在禁食条件下皮下施用不同的负载胰岛素的纳米颗粒制剂后的血糖 水平(N=3)。
[0108] 图13示出了在禁食条件下皮下施用不同的负载h-胰岛素的纳米颗粒制剂后的血 糖水平(N=3)。
【具体实施方式】
[0109] 艾塞那肽是合成形式的exendin-4,是在毒蜥(Gila monster)的唾液中发现的、表 现出与人胰高血糖素样肽-UGLP-I)相似的生物学性质的激素，人胰高血糖素样肽-1是葡 萄糖代谢和胰岛素分泌的调节物。肠促胰岛素激素，GLP-I和葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽 (GIP)，是在食物摄入后由小肠的L和K内分泌细胞产生的。GLP-I和GIP刺激胰岛素从胰腺中 的朗格汉斯氏岛的辟田胞分泌。尽管在糖尿病状态中，仅GLP-I引起胰岛素分泌，但它作为糖 尿病的临床治疗是无效的，因为它在体内具有非常短的半衰期(几分钟）。
[0110]艾塞那肽是一种39个氨基酸的肽、一种具有葡萄糖调节作用的胰岛素促分泌剂。 该药物使用填充笔装置每天两次皮下注射。艾塞那肽与GLP-I具有50%氨基酸同源性，与 GLP-I结构上类似并且在体内具有更长的半衰期(2.4h)。因此，在哺乳动物中测试了它刺激 胰岛素分泌和降低血糖的能力，并且发现它在糖尿病状态中有效。在啮齿动物的研究中，也 示出了它增加胰腺中辟田胞的数目。
[0111] 艾塞那肽快速提高胰岛素水平(在施用约10分钟内），胰岛素水平基本上经过接下 来的1或2个小时下降。已经证明，艾塞那肽作为用于II型糖尿病患者的辅助疗法不能通过 口服抗糖尿病剂实现血糖控制。餐后服用的一剂药比餐前服用的一剂药具有对血糖小得多 的作用。对血糖的作用在6至8小时后消退。药物可以以两种剂量获得:5yg和10yg。治疗经常 以5yg剂量开始，如果不利作用不明显，则增加剂量。根据制造商，在第一次使用前，自动注 射器必须储存在2°C和8°C之间的冰箱中，然后储存在2°C和25°C之间的温度下。因此，在热 天，应当将它持续地冷藏。应该强调，艾塞那肽临床应用中的潜在的缺点是需要频繁的皮下 注射。SC注射可以在注射部位引起疼痛、副作用和可能的感染，这可能不利地影响患者依从 性。
[0112] 已经开发艾塞那肽的长效释放形式用于作为每周一次注射剂使用。此持续释放制 剂由艾塞那肽和聚(D，L-乳酸-羟基乙酸共聚物）的可注射的微米球组成，聚(D，L-乳酸-羟 基乙酸共聚物)是在可吸收的缝合线和延长释放药物方面具有已确定的用途的常见的可生 物降解的聚合物，其允许以受控的速率逐渐递送药物。因此，艾塞那肽延长释放是用于II型 糖尿病的治疗的有用的选择，特别是在其中体重损失是个体患者治疗（individual patient's management)的重要方面的患者中。然而，它仍然是注射剂并且需要每周注射一 次。
[0113]根据在动物中再生的数据外推，艾塞那肽和胰岛素是表现出人的低口服生物利用 度(估计少于2%)的亲水生物大分子，这归因于蛋白水解不稳定性和有限的渗透通过生物 膜的能力。
[0114] 在本发明中，示范了对艾塞那肽和胰岛素的亲水大分子的包封。第一个目标是将 艾塞那肽以合理的水平包埋于纳米颗粒的基质中，目的是增加纳米颗粒在用于口服施用的 微米颗粒中的负载，以确保最终粉末化制剂中的药物含量尽可能的高。
[0115] 本发明还提供将肽类药物并入到一级纳米胶囊或纳米颗粒中，该一级纳米胶囊或 纳米颗粒被进一步嵌入到更大的纳米胶囊中，导致双层包衣的纳米颗粒的递送系统的形 成，该双层包衣的纳米颗粒的递送系统被设计为保护肽免于外环境的有害作用，以用于使 用肠胃外施用途径的延长释放。负载肽的一级纳米胶囊被包封于更大的二级纳米胶囊中。 应注意，在具有直径为400nm或600nm的纳米胶囊中，基于体积计算，理论上可能分别并入至 少64个和216个直径IOOnm的纳米胶囊。
[0116] 二级微米颗粒，即包封本发明的一级纳米颗粒的载体，通过喷雾干燥技术获得。喷 雾干燥是以连续的单一步骤方法将液体或悬浮液转化为干粉的方法。通过使用Buchi实验 室级喷雾干燥器进行喷雾干燥，该喷雾干燥器对于小样品量(数毫克或数毫升)可以以高收 率（>70% )产生尺寸范围为1000 nm至20μηι的微米颗粒，从而以相对高的收率形成微米颗 粒。二级微米颗粒通常具有在1微米和30微米之间的尺寸(直径）。
[0117] 材料
[0118]从Sigma-Aldrich(Rehovot，Israel)购买牛血清白蛋白（BSA)和右旋糖酐 12KDa。 艾塞那肽由Teva Pharmaceuticals(Jerusalem, Israel)慷慨地赠予。从Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel)购买在水中的戊二酸8%。从Alfa Aesar(Haverther chemicals and hill，MA,USA)购买三偏磷酸钠（STMP)。从Rohm(Dramstadt .GmbH,Germany)获得聚（甲基丙 稀酸，丙稀酸乙酯）I: I (EudrEgit?:L100_55)。从Dow Chemical Company (Midland ,MI ,USA) 购买轻丙基甲基纤维素 （Methocel E4M Premium)。从Mallinckrodt chemicals (Phi llipsburg，NJ，USA)购买一水合磷酸二氢钠。所有有机溶剂为HPLC级并且购自 J.T.Baker(Deventer,Holland)〇
[0119] -级NP的制备
[0120] 对敏感的生物大分子艾塞那肽的第一道保护通过将肽负载在一级BSA NP中实现。 制备两种不同类型的NP:与戊二醛8%交联的BSA Np和与STMP交联的BSA与右旋糖酐12KDa 组合的NP。
[0121] 与戊二醛交联的BSA NP
[0122] 与戊二醛交联的BSA NP由Weber等人之前描述的已建立的去溶剂化方法[ref-Desolvation process and surface characterisation of protein nanoparticles]制 备。将200mg BSA和4mg或8mg艾塞那肽溶解于20ml双蒸水(DDW)中。0.5小时后，用0.1 M NaOH 将溶液的PH调节至8.5。然后，将40ml丙酮缓慢加至水相。如分散介质中快速形成乳白色证 明的，形成了ο/w乳液。然后用12.5μ1戊二醛8%溶液经2小时交联BSA NP。交联反应完成后， 在空气层流下蒸发丙酮。此制剂被命名为Glut-I。
[0123] 与STMP交联的BSA/右旋糖酐NP
[0124] 通过在20ml DDW中溶解以下化合物类似地制备BSA/右旋糖酐NP:200mg BSA、50mg 右旋糖酐12KDa，以及当需要时，4mg或8mg艾塞那肽。0.5小时后，用0.1 M NaOH将溶液的pH调 节至8.5,以确保右旋糖酐上邻近的羟基基团可用于与STMP交联剂的反应。然后，将20ml丙 酮缓慢加至水相。然后，使用50mg STMP经3小时交联BSA/右旋糖酐NP，并且如上所述蒸发丙 酮。制备预制剂并通过改变工艺参数评价。选择右旋糖酐量不同的两个制剂进行进一步动 物研究：50和150mg。50mg的制剂被命名为DX-50，且150mg的制剂被命名为DX-150。
[0125] 微米球(MP)制备
[0126] 通过使用喷雾干燥技术将含艾塞那肽的NP微米包封来形成微米颗粒(MP)。出于微 米包封的目的，制备100ml NaH2PO4缓冲液。用IM NaOH溶液将缓冲液的pH调节至6.5。将 750mg的量的Eudragit溶解于pH保持在6.5的该溶液中。此外，通过将1000 mg羟丙基甲基纤 维素（HPMC)加至10Om 1预热（~80 °C )的DDW来制备1 % w/V HPMC溶液。然后，经具有gaza band的漏斗（以过滤可能还未溶解的Eudrag i t颗粒)将Eudrag i t溶液加至HPMC溶液。
[0127] 一旦丙酮从NP悬浮液蒸发，将微米颗粒聚合物的合并的溶液加至NP悬浮液。然后， 用Buchi迷你喷雾干燥器B-190装置(Flawil ,Switzerland)在以下条件下喷雾干燥悬浮液： 入口温度160°C;出口温度85°C;吸气量(aspiration)100% ;悬浮液的进料速度为7ml/min; 在旋风分离器中收集粉末并计算出口收率。
[0128] NP和之后的MP的物理化学表征
[0129] NP 表征
[0130] 用MalvernZetasizer (Nano系列，Nanos-ZS，UK)在25 °C并使用水作为稀释剂表征 各NP的平均直径和ζ电势。使用冷冻透射电子显微镜(Cryo-TEM)进行形态评估。在Cryo-TEM 法中，将一滴溶液置于支持于300目Cu格栅(Ted Pella Ltd.，此(1虹即，4，1^4)上的碳-包 被的多孔的聚合物膜上，并且使用Vitrobot(FEI)用在液体乙烷中快速冷激至-170°C使样 本自动地玻璃化。用FEI Tecnai 12G2TEM在120kV用保持在-180°C的Gatan冷冻支架研究样 品，并且在慢扫描冷却电荷耦合装置相机上记录图像。
[0131] MP的超高分辨率扫描电子显微镜(SEM)研究
[0132] 使用超高分辨率扫描电子显微镜（模型：Magellan 400L，FEI ,Germany)进行形态 和尺寸评估。用双面胶带将样品固定在SEM-托柱（SEM-stub)上，并随后在真空下用金溅射 (gold spattering)(Pilaron E5100)法进行标准包衣使之导电。
[0133] 药物含量
[0134] 通过将样品溶解于2ml水中过夜，分析粉末中的艾塞那肽的总量。之后，将混合物 在HOOOrpm离心2min。将来自上清的Iml在以下条件下注射到HPLC中：柱Restek Viva C4(5 μπι)，250/4.6mm。柱温保持在45°C。流动相A为乙腈(ACN)，且流动相B为用磷酸调节至pH 2.5 的磷酸二氢钾(1(册〇4,2〇111111〇1/1)。使用前将1(趾〇4缓冲液过滤通过0^111膜过滤器。对艾塞 那肽使用以下梯度条件：在15min内从30%至45%流动相A，并且重新平衡至30%流动相 A3min。流速为1.5mL/min。注射体积为20yL。在215nm检测UV信号。使用由范围在0至20μg/ml 之间的艾塞那肽浓度建立的、获得线性相关(r2 = 0.999)的校正曲线计算艾塞那肽含量。
[0135] 大鼠中药物动力学研究
[0136] 耶路撒冷的希伯来大学的当地的实验动物管理伦理委员会批准了所有动物研究 (MD-13575-4)。在此研究中使用Sprague Dawley雄性大鼠（300-350g)。将动物安置在SPF条 件下，禁食并自由获得饮用水。随机分为7组，每组3只大鼠，来评价口服吸收和随时间的艾 塞那肽血浆水平。艾塞那肽作为溶液被皮下注射或以65yg/kg(20yg/大鼠）的剂量配制于 Byetta_?中。第三组和第四组大鼠经口施用在外部掺有艾塞那肽的31mg空白MP，或以165μ g/kg(50yg/大鼠）的剂量经口施用艾塞那肽溶液，以确定空白制剂是否有效果。最后，以165 yg/kg(50yg/大鼠）的剂量分别经口施用35mg Glut-l、33mg DX-50和32mg DX-150。所有口 服悬浮液分散于2mL DDW中，而皮下注射的体积为200μ1。
[0137] 在0、0.5、1、2、4、6、8和2处从大鼠的尾巴采集血液样品（50(^1)。将样品收集在含 EDTA和抑肽酶的管中。将样品在10,000印111、4°(：离心1011111，之后将25(^1血浆样品转移到新 管中并在-80 °C保存直至被分析。依照公司建议的方案，使用CEK-0130-0IELISA试剂盒(AB Biolabs，USA)确定艾塞那肽水平。
[0138] 生物利用度计算
[0139] 使用WinNonl in软件计算药物动力学参数，将梯形法则应用于AUC的计算。依据尺 寸-剂量校正调整AUC值。
[0140]使用以下等式计算与皮下注射的标准市售制剂Byetta?湘比的不同口服制剂的 相对生物壬丨丨田_.
[0141]
[0142] 艾塞那肽制剂
[0143] 制剂F-I:用BSA和交联的右旋糖酐的艾塞那肽一级纳米包封
[0144] 将200mg BSA(Sigma-A7906)和50mg右旋糖酐 12KDa(Sigma-31418)溶解于IOml DDW。将4mg艾塞那肽单独地溶解于IOml DDW。将白蛋白/右旋糖酐溶液加至艾塞那肽溶液以 完成肽溶解(溶液A)。用NaOH 0.1 M调节pH 6.8以达到pH为约8.5。在强烈搅拌期间将20ml丙 酮注射至溶液-A，以引起包含大部分艾塞那肽的BSA-右旋糖酐NP的形成。通过加入5% (Iml)三偏磷酸钠（STMP)并将溶液在室温下、在900rpm搅拌超过3小时获得右旋糖酐交联。 制剂F-I的合成的示意图在图1A-1B中示出。
[0145] 制剂F-2:用BSA和交联的戊二醛的艾塞那肽一级纳米包封
[0146] 将200mg BSA(Sigma-A7906)溶解于IOml DDW。将4mg艾塞那肽单独溶解于IOml DDW。将白蛋白溶液加至艾塞那肽溶液以完成肽溶解。用NaOH 0.1 M调节pH以达到pH为8.5。 在强烈涡旋期间，将15ml丙酮注射至溶液-A，以引起包含大部分艾塞那肽的BSA-艾塞那肽 NP的形成。通过加入25μ1戊二醛4%并将溶液在900rpm在室温下经3小时搅拌获得BSA交联。 制剂F-2的交联的示意图在图2中示出。
[0147] 制剂F-3 :艾塞那肽至纳米颗粒表面的缀合
[0148] 通过使4mg艾塞那肽与间隔物硫代-SMCC(硫代琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基 甲基)环己烷-1-羧酸酯)在室温反应2小时进行艾塞那肽活化。
[0149] 为了 制备纳米颗粒，将150mg PLGA(50K)(Resomer RG 504H，Boehr ingen Ingelheim)、150mg PLGA-PEG共聚物（45K和5K)(Resomer RGP d 50105)和IOmg油基半脫氛 酰胺溶解于50ml丙酮。将IOOmg Solutol HS 15(BASF)边搅拌边溶解于100ml DDW。在搅拌 下(900rpm)将有机相加至水相并允许经15min混合。使用旋转蒸发仪在减压下、在37°C将制 剂蒸发至少于IOml。用NaOH 0 . IM将pH调节至6.7-6.8并将体积调节至IOml。将制剂在 4000rpm离心以沉淀大颗粒(3-4% )。只将胶体上清液用于最终制剂。
[0150] 将经活化的艾塞那肽立刻与预先形成的制剂孵育。在磁力搅拌器上，室温，过夜进 行孵育。LC-SMCC的马来酰亚胺基团与油基半胱氨酰胺的巯基基团在pH=6.5-7.5反应以形 成稳定的硫醋键。
[0151] 制剂F-4:艾塞那肽双重包封
[0152] 将IOOmg BSA(Sigma-A7906)溶解于2ml DDW。将5mg艾塞那肽单独地溶解于3ml DDW。将白蛋白溶液加至艾塞那肽溶液以完成肽溶解。用NaOH IM将pH调节至7.4-8。在强烈 搅拌期间，将IOml丙酮注射至该溶液以引起包含大部分艾塞那肽的BSA纳米颗粒的形成。
[0153] 将128mg PLGA(50K)溶解于93ml乙腈。在搅拌期间加入6ml BSA纳米颗粒制剂以形 成双重包封(纳米喷雾条件:4μπι目，温度:50°C)。
[0154] 用Eudragit L和HPMC将制剂Fl-F4微米包封
[0155] 将500mg HPMC溶解于100mL预热的DDW，并将500mgEudragit(阴离子型）溶解于 100ml PBS0
[0156] 向纳米颗粒溶液添加 Eudragi t溶液和HPMC溶液。在500rpm、室温将合并的溶液搅 拌30分钟;将合并的分散物用喷雾干燥器在以下条件下蒸发:入口温度= 160°C;出口温度 = 100°C。获得包含载药纳米颗粒的微米颗粒。
[0157] 载药纳米颗粒的物理化学表征在表1中示出。

[0160] 表1:艾塞那肽制剂的物理化学性质。*将2批合并
[0161] **对于合并的制剂
[0162] 不同制剂(F1-F5)中的艾塞那肽对0Β/0Β小鼠降低葡萄糖作用的评估
[0163] 通过给予葡萄糖并经6小时监测葡萄糖水平使小鼠顺应数天。之后，以20yg/kg的 剂量向所有小鼠注射Byetta(商业的可注射的艾塞那肽制剂)并经6小时监测葡萄糖水平。
[0164] 用n = 8每组动物的组大小进行不同制剂中的艾塞那肽对0Β/0Β小鼠降低葡萄糖作 用的评价。向每组0Β/0Β小鼠提供以下中的一种：
[0165] i)生理盐水+空媒介物(F-5)
[0166] ii)Byetta_ 注射剂
[0167] iii)艾塞那肽(F-I)
[0168] iv)艾塞那肽(F-2)
[0169] iv)艾塞那肽(F-3)
[0170] iv)艾塞那肽(F-4)
[0171] 在第1天，在实验前将所有动物禁食18小时，然后在禁食后监测血糖。通过腹腔注 射向所有动物注射葡萄糖（18mg/kg);葡萄糖注射后60min检查以下参数:血糖测量、血液收 集用于Elisa、体重测量。然后，经口施用制剂F1_F5(通过皮下注射施用Byetta)。施用后，在 施用后30min、l小时、1.5小时、2小时、3小时和6小时监测血糖水平。
[0172] 从第2天至第9天，在时间0时测量体重并收集血液用于ELISA。之后，施用制剂并在 药物施用后1小时内测量血糖水平(并且收集血液用于ELISA)。
[0173] 在第10天，在施用受试制剂的最后的剂量之前，再次给予葡萄糖，随后体重测量并 收集血液用于ELISA。在此之后，以双倍剂量向每只动物施用制剂（以检查这些制剂的增强 作用），然后在药物施用后1小时，测量血糖水平并收集血液用于ELISA。
[0174] 体重测量
[0175] 对于每只小鼠，在相同时间进行体重测量。不同艾塞那肽制剂(F1-F5)和Byetta的 结果在图3中不出。
[0176] 血糖水平测量
[0177] 在第1至第10天收集血液样品。在血糖测量程序前，通过将小鼠转移到洁净的笼底 座(cage base)来使15-19周龄的动物禁食过夜(最高达16h)，该洁净的笼底座具有洁净的 筑巢材料和少量土质垫料和来自它们的旧笼的丰富环境。笼子和垫料的改变避免了小鼠可 以接近洒出的食物的可能性。在整个禁食期间，保持水可被自由获得。在收集最后的血液样 品后归还食物。通过用刀片在尾尖切口从未禁食的小鼠获得一滴血。使用手持血糖仪 (Accu-chek Aviva ,Roche Diagnostics，UK)进行测量。来自使用Byetta的预实验的血糖水 平在图4中示出，而艾塞那肽的不同制剂(F1-F5)和Byetta的血糖水平在图5中示出。
[0178] 血浆胰岛素水平
[0179]对于胰岛素确定，从尾静脉采集150mL血液样品（在离心机中以3000转/min处理血 液IOmin和5min)。将血衆分离到2个肝素包被的管中用于血液参数和胰岛素测量（每管 30mL)。使用小鼠胰岛素酶联免疫吸附测定试剂盒(Mercodia,Sylveniusgatan,Sweden)测 量血浆胰岛素水平。不同组在不同天的血浆胰岛素水平在图6中示出。
[0180] 糖基化血红蛋白水平
[0181] 使用EDTA作为抗凝剂收集血浆。在收集后30分钟内以1000 X g离心样品15分钟。移 除血浆并立即测定，或在-20°C或-80°C以等分试样储存样品。使用小鼠胰岛素酶联免疫吸 附测定试剂盒(Life Science，Inc,Florida,USA)测量糖基化血红蛋白水平。不同组在不同 天的糖基化血红蛋白水平在图7中示出。
[0182] NP和之后的MP的物理化学表征
[0183] 牛血清白蛋白（BSA)是公知的并且是用于口服药物递送(除肽和蛋白质以外）的丰 富的蛋白质载体。其主要优势是生物可降解性、生物相容性、安全性、非-抗原性、良好耐受 性和可得性。此外，将肽和蛋白质并入一级NP是富有挑战的，因为大部分包衣聚合物可溶于 水并且需要被交联以在漏槽条件下在体外产生肽的延长的释放。在广泛接受的纳米载体 BSA NP的情况下，此问题甚至更复杂。白蛋白的任何变性方法，包括用戊二醛交联、通过加 热或使用有机溶剂变性将显然影响肽或蛋白质的化学完整性，如也在本工作中观察到的。
[0184] 为避免此缺点，如图8中示出的，将BSA基质与多糖右旋糖酐结合，右旋糖酐可以经 由其反应性羟基基团交联[**多糖作为纳米治疗剂的组成单元(building block)]。为实现 稳定的纳米颗粒系统，在合适的pH条件下，使用TSMP交联右旋糖酐的反应性羟基基团。
[0185] 通过改变不同参数，诸如pH、交联分子的类型、TSMP量、右旋糖酐量制备不同制剂。 用戊二醛作为交联剂制备的包含艾塞那肽的BSA NP表现出基于三次测量的平均直径尺寸 为59.34±0.32nm，多分散性指数(PDI)值为0.138(反映窄尺寸范围），并且ζ电势值为-50.3 ± 3.03mV。包括BSA:右旋糖酐混合物的NP制剂的性质在表2中示出。基于表2中描绘的数据， 如之前提及的，选择右旋糖酐量为50mg和150mg的右旋糖酐量不同的两个制剂。无论制剂如 何，NP的平均直径的范围从190nm至210nm，具有相对窄的分布范围，如观察到的相对低的 PDI值反映的。
[0187] 表2:从BSA和右旋糖酐的混合物制备的不同NP制剂的组成和性质
[0188] 包含BSA/右旋糖酐混合物的一级NP的可视化使用冷冻TEM进行（图1A-B)。图像示 出了无论组成差异如何NP为球状的形态，直径尺寸的范围值与Zetasizer测量观察到的范 围相似。
[0189] 多种负载NP的MP的表征主要由XHR SEM分析可视化（图9A、B、C)。微米包封的NP，示 出了MP的包衣是光滑的，定性地尺寸的范围从Ιμπι至15μπι，并且由于为了 SEM可视化而应用 了真空，MP是瘪的。
[0190] Glut-1、DX-50 和 DX-150 中最终艾塞那肽含量分别为0 · 147、0 · 153 和0 · 158%w/w， 无论制剂如何均导致约40%的包封产率。
[0191] 大鼠药物动力学和吸收研究
[0192] 对于每个处理，来自3只大鼠的艾塞那肽血浆水平在图10中示出。在8和24小时时， 无论制剂如何，艾塞那肽血浆浓度低于试剂盒的检出限，因此数据未示出。此外，从图10中 示出的结果可以注意到，经口施用的掺入艾塞那肽溶液的空白MP制剂（用不具有艾塞那肽 的DX-50NP制备）、Glut-l制剂和游离艾塞那肽溶液不引起任何可检测的艾塞那肽血浆水 平。还观察到，实际的艾塞那肽引起与商业的Byetta?产品的血浆谱接近的谱，而制剂DX-50 引起比DX-150更高的药物动力学谱，但二者都以比可注射的制剂高得多的剂量施用（分别 为165yg/kg对65yg/kg)。
[0193] 的确，在计算药物动力学参数后，可以清楚地注意到，在将剂量归一化后，最高的 AUC值由Byetta注射剂引起，接着是注射的艾塞那肽溶液、DX-50制剂和DX-150制剂。此外， 无论剂量如何，所有制剂引起高于l，〇〇〇ng/ml的(："^值，并且在T max值没有差异。更重要的 是，ANOVA分析指出，在Byeatt和艾塞那肽溶液之间的归一化的AUC值和DX-50 口服悬浮液之 间没有显著的差异。仅有的显著差异是DX-150,其引起46.5%的相对口服生物利用度。
[0194]
[0195] 表3:以65yg/kg的剂量皮下注射Byetta和艾塞那肽溶液(Exe.Sol.)和以165yg/kg 的剂量口服施用DX-50和DX-150后的平均PK参数值(平均值土SE)，N=3
[0196] 纏
[0197] 此研究中与动物操作、护理和处理相关的所有程序根据遵守国际实验动物评估和 认可委员会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)的机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee，IA⑶C)批准的指导方针进行。
[0198] 图和正本中的所有值以η个观察的平均值的标准差(s.e.m)表示。对于体内研究，η 代表被研究的动物数目。在涉及组织学的实验中，示出的数值代表在不同实验日在从每组 的所有动物收集的组织切片上进行的至少3个实验(组织染色）。用单因素方差分析或双因 素方差分析检查数据组，并且然后比较单独的组平均值和Student's非配对t检验。P-值小 于0.05被认为是显著的。
[0199]
[0200]在0Β/0Β小鼠中评价艾塞那肽的不同制剂(Fl -F5)的治疗功效和安全性。特别地， 在艾塞那肽(F1-F5)和Byetta的施用后，在体重上不存在显著差异（图3)。
[0201 ]在用Byetta的预实验中，在葡萄糖注射后Ih，向小鼠施用Byetta，如图4中所示;直 至Ij6h，展示了血糖水平的降低。此结果支持这样的观点:Byetta代表糖尿病的治疗中的目标 标准。另外，比较艾塞那肽的不同制剂(F1-F4)和Byetta治疗。注意到艾塞那肽制剂(F1-F4) 被经口施用，而Byetta组合物通过注射施用。结果示出了，每日口服施用F-I和F-2能够在 0Β/0Β小鼠中减少血糖水平的增加（图5)。在此基础上，推测这两种制剂表现出最令人感兴 趣的结果。
[0202]图6中的数据证明了不同组在不同天的血浆胰岛素水平。如可以观察到的，用艾塞 那肽的不同制剂(F1-F5)治疗以及Byetta治疗能够增加胰岛素水平。
[0203]此外，在10天治疗期间，发现Byetta注射剂降低0Β/0Β小鼠中的糖基化的血红蛋白 (HbAlc)的水平（图7-11)。如与图5比较的，糖基化血红蛋白澄清(clarified)的速率，示出 了只有两种艾塞那肽的制剂F-I和F-2表现出糖基化血红蛋白水平降低的作用。
[0204] 从此得出结论，每日口服施用艾塞那肽F-l(并且口服施用F-2达显著较低的程度， 因为肽被戊二醛交联并且失去其部分活性），可以在糖尿病的症状治疗中具有有益效果。
[0205] h_胰岛素的双重纳米包封
[0206] 制备包含h_胰岛素的双重纳米包封的样品用于获得用于在体内引起肽的延长的 释放的可注射的干粉。
[0207] 使用HSA的h-胰岛素一级纳米包封:
[0208] 在搅拌下，将200mg人血清白蛋白（HAS)溶解于5ml DDW。单独地，将20mg人或牛胰 岛素溶解于5ml DDW并涡旋30秒。然后将h-胰岛素溶液加至HSA溶液并搅拌30分钟以完成肽 溶解。用NaOH 0.1 M将所得溶液的pH调节至7.4-8。然后，在剧烈搅拌(900rpm)下，快速注射 (在20秒内）20ml丙酮，以引起负载h-胰岛素的HSA纳米胶囊(溶液A)的形成。将溶液A用铝箱 覆盖以避免丙酮蒸发并以900rpm经1小时搅拌。在搅拌1小时后吸取样品（50-100μ1)用于ζ 电势和尺寸测量。单独的，将PLGAlOOK的溶液(50:50)溶解于80ml乙腈并加至溶液A。
[0209] 使用纳米喷雾干燥器将HSA/h-胰岛素纳米颗粒纳米包封进PLGA-有机模式
[0210] 通过在以'闭环'模式运行的NSD B-90上喷雾干燥来制备纳米胶囊，因此，N2(g)和 C02(g)代替空气在该系统中流动。在所有实验中，气流为约1201/min。将浸有挥发性蒸气和 湿气的空气转移到除湿单元，用于干燥和凝聚，然后在圆形路径中干燥返回至系统。在低温 下(T in = 30 °C-60 °C)用4μπι网孔尺寸的膜进行喷雾干燥。制备不同HSA/h-胰岛素/PLGA比的 多种制剂。与基于紊流运行的常规喷雾干燥器不同，NSD B-90基于层流运行；因此，温和的 加热是可实现的，从而使系统与对热敏感的生物制药产品相容。
[0211] 载药的一级纳米胶囊的物理化学表征
[0212] 一级纳米胶囊内的胰岛素含量
[0213]在以下条件开发适当的HPLC分析方法：
[0214] 使用c4柱分离和分析h_膜岛素 （RESTEK viva 4 · 6mm X 250mm，i · d ·，5μηι颗粒， Bellefonte ,PA.USA)。柱温保持在45°C。流动相A为乙腈(ACN)，且流动相B为用磷酸调节至 pH 2.5的磷酸二氢钾(KH2P〇4,20mmol/L)。使用前，将流动相过滤通过0.45μπι膜过滤器并由 真空排气。
[0215] 对h-胰岛素使用以下梯度条件:在15min内从30%至45%流动相Α，并且重新平衡 至30%流动相A3min。流速为1.5mL/min。注射体积为20yL。在215nm检测UV信号。
[0217]表4:不同制剂中h-胰岛素含量
[0219]表5:不同制剂的一级纳米胶囊的ζ电势和粒径 [0220] 纳米胶囊的液体界面处的冷冻断裂SEM图像
[0221]在冷冻前将样品悬浮于超纯水+涡旋，并然后摇动至少30分钟。将1.5yL悬浮液体 积夹在两个扁平铝片之间，该两个扁平铝片具有200目的TEM网格被用作它们之间的间隔 物。然后将样品在HPM010高压冷冻机(Bal-Tec，Liechtenstein)中高压冷冻。然后将冷冻的 样品装在支架上并转移到使用VCT 100真空冷冻转移装置(Bal-Tec)的MF 60冷冻断裂装 置（Bal-Tec)。在-120Γ的温度断裂后，样品在-IUTC蚀刻5分钟并通过双轴旋转投影 (double axis rotary shadowing)用3nm Pt/C包被。将样品用VCT 100转移到Ultra 55SEM (Zeiss,Germany)并用二次电子透射检测器（secondary electrons in-lens detector)在 1.5kV在-120 °C的温度观察。SEM图像在图IIA-IIC示出。
[0222] 糖尿病(DM)的诱导
[0223]通过静脉注射稀释于0.05M柠檬酸缓冲液的链脲菌素(STZ)(50mg/kg体重)在大鼠 中诱导DM。两周后，被选作患糖尿病的动物是表现出空腹血糖高于250mg/dL的那些。使用临 床血糖仪（Contour ?,BAYER)用葡萄糖氧化酶法（Bergmeyer and Bernt, 1974)测量糖血 症。
[0224] 然后患糖尿病的大鼠被用于评价在不同条件下（禁食和未禁食的）以5IU; IOIU/ (175;350yg)/动物经口服喂料的和以5IU(175yg)/动物皮下注射的包含胰岛素的纳米胶囊 的不同制剂降低血糖的作用。
[0225] 图12-13分别示出了在禁食的和非禁食条件下皮下施用不同的负载胰岛素的纳米 颗粒制剂后的血糖水平(N=3)。
[0226] 从SEM图像可以看出，h-胰岛素的一级HSA纳米胶囊被纳米包封于更大的PLGA纳米 胶囊中。这些一级纳米胶囊也在内部被聚合物PLA包被，这表明胰岛素释放可以在肌肉内或 皮下注射时控制。此假设被证实(如可以在图12-13中看到），因为双重纳米胶囊中的两种类 型的胰岛素注射都在禁食条件下引起超过24h的明显延长的血糖降低，而在非禁食条件中 此作用较短。可以得出结论，新的技术至少不显著影响胰岛素的药理学活性。
【主权项】
1. 一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含水溶性蛋白质、葡聚糖和亲水活性剂，所述葡聚糖 由偏磷酸盐至少部分交联。2. 权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述水溶性蛋白质是白蛋白。3. 权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述白蛋白选自人血清白蛋白（HSA)和牛血清白蛋 白(BSA)04. 权利要求1至3中任一项所述的纳米颗粒，其中所述葡聚糖是α-葡聚糖。5. 权利要求4所述的纳米颗粒，其中所述α-葡聚糖选自右旋糖酐、糖原、普鲁兰糖、淀 粉、糖原、地衣多糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖、阿拉伯木聚糖和半乳聚糖。6. 权利要求1至4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述葡聚糖具有在约5KDa和2 ,OOOKDa 之间的分子量。7. 权利要求1至6中任一项所述的纳米颗粒，其中所述偏磷酸盐选自三偏磷酸钠 (STMP)、三磷酸五钠(STPP)和氯化氧磷(POCl 3)。8. 权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述偏磷酸盐是三偏磷酸钠。9. 权利要求1至8中任一项所述的纳米颗粒，其中所述亲水活性剂包含-NH2末端部分或-Mfe悬挂部分。10. 权利要求1-9中任一项所述的纳米颗粒，其中所述亲水活性剂选自维生素、蛋白质、 抗氧化剂、肽、多肽、脂质、碳水化合物、激素、抗体、单克隆抗体、疫苗、预防剂、诊断剂、造影 剂、核酸、营养剂、分子量小于约I，OOODa或小于约500Da的小分子、电解质、药物、免疫剂及 其任何组合。11. 权利要求10所述的纳米颗粒，其中所述亲水活性剂选自胰岛素、艾塞那肽、生长激 素、醋酸奥曲肽、醋酸兰瑞肽、goserolin acetate、copaxone、依那西普和单克隆抗体。12. 权利要求10或11所述的纳米颗粒，其中所述亲水活性剂选自胰岛素和艾塞那肽。13. 权利要求1至12中任一项所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒具有至多500nm的直径。14. 权利要求13所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒具有在约50nm和250nm之间的直径。15. 权利要求1至14中任一项所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒是纳米球或纳米胶囊。16. -种载体，所述载体包括疏水聚合物和多个权利要求1至15中任一项所述的纳米颗 粒，所述多个纳米颗粒（i)被所述疏水聚合物包封或（ii)被嵌入在所述疏水的聚合物形成 的基质中。17. 权利要求16所述的载体，其中所述疏水聚合物选自聚(乳酸羟基乙酸）（PLGA)、聚甲 基-丙烯酸甲酯(PMMA)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚(乳酸）（PLA)、聚(乳酸羟基乙酸共聚 物）(PLG)、聚(丙交酯）、聚羟基乙酸(PGA)和聚(羟基丁酸）。18. 权利要求16或17所述的载体，其中所述纳米颗粒具有在约200nm至900nm之间的直 径。19. 权利要求18所述的载体，其中所述纳米颗粒被嵌入在具有在1微米和30微米之间的 直径的纳米胶囊中。20. -种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至15中任一项所述的纳米颗粒 和/或权利要求16至19中任一项所述的载体。21. 权利要求20所述的药物组合物，所述药物组合物适合于所述亲水活性剂的局部、口 月艮、吸入、经鼻、透皮、经眼或肠胃外施用。22. 权利要求21所述的药物组合物，所述药物组合物适合于所述亲水活性剂的口服施 用。23. 权利要求21所述的药物组合物，所述药物组合物适合于所述亲水活性剂通过注射 的施用。24. -种亲水活性剂的递送系统，所述递送系统包括： 疏水聚合物，和 包封在所述疏水聚合物内的多个权利要求1至15中任一项所述的纳米颗粒。25. -种亲水活性剂的递送系统，所述递送系统包括： 形成基质的疏水聚合物，和 被嵌入在所述疏水聚合物内的多个权利要求1至15中任一项所述的纳米颗粒。26. 权利要求24或25所述的递送系统，所述递送系统还包封在可生物降解的胶囊内。27. 权利要求26所述的递送系统，其中所述可生物降解的胶囊呈肠衣胶囊的形式。28. 权利要求24至27中任一项所述的递送系统，其中所述递送系统适合于所述亲水活 性剂的便利的靶向的治疗剂递送及控制释放的施用。29. 权利要求1至15中任一项所述的纳米颗粒或权利要求16至19中任一项所述的载体 用于制备用于治疗疾病、紊乱或慢性状况的药物组合物的用途。30. 权利要求29所述的用途，其中所述药物组合物适合作为递送系统，所述递送系统用 于局部地、口服地、通过吸入、经鼻地、透皮地、经眼地或肠胃外地运送治疗剂进入受试者的 循环系统的递送系统。31. 用于制备包含水溶性球状蛋白质、葡聚糖和亲水活性剂的纳米颗粒的方法，所述葡 聚糖由偏磷酸盐至少部分交联，所述方法包括： -将第一水性溶液与第二水性溶液混合以形成混合物，所述第一水性溶液包含所述水 溶性球状蛋白质和所述葡聚糖，所述第二水性溶液包含所述亲水活性剂； -将有机溶剂注射到所述混合物中；和 -将所述偏磷酸盐添加至所述混合物，从而至少部分交联的所述葡聚糖用于获得所述 纳米颗粒。
【文档编号】A61K47/34GK105960232SQ201580005925
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2015年1月26日
【发明人】S·贝妮塔, T·纳萨尔, 利亚特·柯查威-桑德莱
【申请人】耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司