肉桂油及其主成分桂皮醛的应用
【专利摘要】本发明提供肉桂油及其主成分桂皮醛作为制备辣椒素受体TRPV1拮抗剂、或制备具有镇痛作用的药物的用途，还提供了包括有效量的桂皮醛或肉桂油的辣椒素受体TRPV1拮抗剂或具有镇痛作用的药物。本发明的肉桂油及其主成分桂皮醛作为辣椒素受体TRPV1拮抗剂,具有显著的镇痛作用，制备成本低，工艺简单，毒副作用小，顺应市场需求。
【专利说明】
肉桂油及其主成分桂皮醛的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药理学领域，具体涉及肉桂油及其主成分桂皮醛的应用。
【背景技术】
[0002] 疼痛(pain)是一种复杂的生理心理活动，是临床上最常见的症状之一。疼痛经常 困扰着人们的健康和生活质量，长期的剧烈疼痛(如癌性疼痛、顽固性疼痛等)是一种难以 忍受的折磨。1970年，发现内源性脑啡肽、外源性吗啡具有强大的镇痛作用，此后5-羟色胺 等神经递质及其相应的受体也被报道参与控制内源性疼痛系统。除非麻醉性镇痛药(如阿 司匹林）和麻醉性镇痛药（如吗啡）等用于止痛外，一些非固醇类抗炎药也已开始应用。但 是，迄今仍然缺乏疗效显著和可靠、副作用少、长期使用无依赖(成瘾)性的镇痛药物。
[0003] 神经病理性疼痛是由中枢或外周神经系统的病理损伤造成的痛觉过敏。神经病理 性疼痛又可分为自发性或诱发性疼痛。自发性疼痛常表现为持续的烧灼感，也可为间断的 刺痛、撕裂样痛、触电样疼痛。糖尿病、病毒感染、神经创伤以及自身免疫性疾病等都是引起 神经病理性疼痛的病因。炎症性疼痛是由外周的创伤、灼烧、低温、免疫系统疾病、感染等因 素造成的神经炎症反应所致。诱发性疼痛由机械、温度或化学刺激所引发，常表现为痛觉过 敏。外周或中枢敏化被认为是神经病理性疼痛的重要机制。外周敏化是指初级伤害感受性 神经元尤其是其外周末梢发生的超敏感化。外周神经敏化时诱导初级神经元可塑性变化， 释放多种细胞因子和神经递质，导致神经元功能稳态失衡，引起疼痛的发生。伤害性感受器 的辣椒素受体TRPV亚型I (transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)，是非选 择性阳离子通道型受体。TRPVl主要表达在伤害性感觉神经元，如背根神经节、三叉神经节 和脊髓背角。TRPVl由838个氨基酸组成，6个跨膜区，可被辣椒素、H + (pH〈6.0 )、机械、热刺激 (>43°C )、重金属等激活。TRPVl参与炎性痛、内脏痛、热痛觉过敏和癌性疼痛的发生。在完全 弗氏佐剂(CFA)致炎的动物模型，TRPVl受体表达量升高。
[0004] 肉桂是棒科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥树皮。肉桂油亦称桂皮 油，为肉桂的干燥皮、叶经水蒸气蒸馏得到的挥发油，为黄色或棕黄色的澄清液体，有肉桂 的特异香气，味甜，相对密度1.055-1.070，折光率1.602-1.614。肉桂油经GC-MS分析研究证 实，其中的化学成分主要有桂皮醛、乙酸桂皮酯、水杨醛和桂皮酸等，而桂皮醛的相对含量 高达87%以上；肉桂油具有较强的挥发性，遇光和热不稳定，对挥发油的药理作用有明显影 响。桂皮醛又名肉桂醛、苯基丙烯醛等，化学名为3-苯基-2-丙烯醛，英文名为Cinnamic aldehyde;具有强烈的肉桂香气且持久。桂皮醛难溶于水、甘油和石油醚，易溶于乙醇、乙醚 中，能随水蒸气挥发;在强酸性或者强碱性介质中不稳定，易导致变色，在空气中易氧化;桂 皮醛在体内发生氧化反应转化成桂皮酸(亦称为肉桂酸）。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了肉桂油及其主成分桂皮醛的应用，作为辣椒素受体TRPVl拮抗剂，具 有显著的镇痛作用，制备成本低，工艺简单，适于工业化生产。
[0006] 本发明的一个方面，提供肉桂油和/或其主成分桂皮醛作为制备辣椒素受体TRPVl 拮抗剂的用途。
[0007] 本发明的再一个方面，提供肉桂油和/或其主成分桂皮醛作为制备具有镇痛作用 的药物的用途。
[0008] 以上所述的用途，其中，所述镇痛作用包括对内脏痛、炎性痛及痛经的镇痛作用。
[0009] 本发明的又一个方面，提供一种辣椒素受体TRPVl拮抗剂或具有镇痛作用的药物， 其中，包括有效量的桂皮醛和/或肉桂油。
[0010] 以上所述的拮抗剂或药物，其中，剂型为注射剂、片剂、散剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、 口服液、膏剂、乳液、纳米剂、霜剂或喷剂。
[0011] 以上所述的拮抗剂或药物，其中，包括一种或一种以上药学上可接受的辅料。
[0012] 以上所述的拮抗剂或药物，其中，所述辅料包括药学领域常规的赋形剂、填充剂、 粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂或缓释剂。
[0013] 以上任一所述的肉桂油的制备方法，包括如下步骤：
[0014] 取肉桂的干燥嫩枝，加入肉桂的干燥嫩枝重量2-6%的乙酸乙酯后进行蒸馏，弃去 乙酸乙酯层，获得的挥发油即所述肉桂油。
[0015] 以上任一所述的桂皮醛的制备方法，包括如下步骤：
[0016] (1)将肉桂的干燥嫩枝粉碎至20-60目；
[0017] (2)将（1)中粉碎后获得的肉桂粉末，加入20-30倍量的蒸馏水，再加入KCl，进行蒸 馏提取1.5-2.5h;
[0018] (3)将(2)中肉桂油-水混合液转移至离心机中离心，弃去水层；
[0019] (4)将(3)中产物精馏，精馏条件为160°C，回流比：1:1，真空度:6.65kpa，通过精馏 获得桂皮酸。
[0020] 以上制备的肉桂油的质控方法，所述肉桂油同时满足如下（1)至(7)的条件：
[0021] (1)所述肉桂油在乙醇或冰醋酸中易溶，相对密度为1.055~1.070,折光率为 1.602 ~1.614;
[0022] (2)将所述肉桂油冷却至(TC，加等容的硝酸振摇后析出结晶性沉淀；
[0023] (3)薄层色谱法鉴别所述肉桂油与桂皮醛对照品在相应位置显相同颜色的斑点；
[0024] (4)取所述肉桂油IOml，加水IOml与盐酸1滴，振摇后，通硫化氢气使饱和，水层与 油层均不变色；
[0025] (5)取所述肉桂油Iml，加70 %乙醇3ml，摇匀，现澄清液体；
[0026] (6)色谱检测：以交联5%苯基甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱，柱温为程序升 温，初始温度为100°C，以每分钟5°C的速率升温至150°C，保持5min，再以每分钟5°C的速率 升温至200°C，保持5min;进样口温度为200°C ;检测器温度为220°C ;分流进样，分离比为20: 1，理论塔板数按桂皮醛计算应不低于20000;
[0027] (7)分别精密吸取桂皮醛对照品溶液与供试品溶液各?μL，注入气相色谱仪，测定， 所述肉桂油含桂皮醛(C 9H8O)不少于75.0%。
[0028] 以上制备的桂皮醛的质控方法，所述桂皮醛同时满足如下（1)和(2)的条件：
[0029] (1)色谱检测：用5 %二苯基-95 %二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱;进 样口温度：230°C ;柱温：80°C保持3min，再以20°C/min升至160°C，保持6min;检测器温度： 240°C ;分流进样测定，分流比25:1;柱温：150°C ;载气流速：1.0 ml/min;理论塔板数按桂皮 醛峰计算不低于30000;桂皮醛峰与内标物质峰的分离度大于2;
[0030] (2)精密吸取对照品溶液及供试品溶液各2ul，注入气相色谱仪，测定，桂皮醛含量 在6.5~9.0%之间。
[0031] 本发明在色谱检测方法中采用的色谱柱为石英毛细管色谱柱，相比于传统填充 柱，其具有柱效更高、使用寿命更长、灵敏度更高、分析速度更快的特点。
[0032] 本发明提供肉桂油及其主成分桂皮醛作为辣椒素受体TRPVl拮抗剂应用，实验研 究表明，肉桂油及其主成分桂皮醛对TRPVl受体具有拮抗活性，对醋酸引起的内脏痛、甲醛 引起的炎性痛及痛经均有显著镇痛作用，其药学上可以制备成多种剂型，如注射剂、片剂、 散剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、口服液、膏剂、乳液、纳米剂、霜剂或喷剂等剂型，剂型多样便于选 择;并且肉桂油及其主成分桂皮醛原料十分丰富，价格低廉，毒副作用小，制剂成分明确、制 备工艺及其质量标准便于控制，具有良好市场顺应性。
【具体实施方式】
[0033]以下结合实施例，对本发明的【具体实施方式】进行更加详细的说明，以便能够更好 地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的【具体实施方式】和实施例仅 是说明的目的，而不是对本发明的限制。
[0034] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0035] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036] 实施例一肉桂油及其桂皮醛制备及质量控制
[0037] 1.桂枝来源:产地广东肇庆，购买自连云港和兴堂中药材厂，桂枝为樟科植物肉桂 的干燥嫩枝。
[0038] 2.桂枝挥发油提取制备方法
[0039]
[0040]
[0041]
[0042] 4.桂枝挥发油质控标准
[0043] 4. If生状
[0044] 本实施例制备的桂枝挥发油为黄色或黄棕色的澄清液体;有肉桂的特异香气，味 甜、辛。露置空气中或存放日久，色渐变深，质渐浓稠。
[0045] 本实施例制备的桂枝挥发油在乙醇或冰醋酸中易溶。
[0046] 相对密度:应为1.055~1.070。
[0047] 折光率:应为1.602~1.614。
[0048] 4.2鉴别
[0049] 4.2.1取本实施例制备的桂枝挥发油，冷却至(TC，加等容的硝酸振摇后，即析出结 晶性沉淀。
[0050] 4.2.2薄层鉴别应与桂皮醛对照品在相应位置显相同颜色的斑点。
[0051] 4.3检查
[0052] 4.3.1重金属:取本实施例制备的桂枝挥发油10ml，加水IOml与盐酸1滴，振摇后， 通硫化氢气使饱和，水层与油层均不得变色。
[0053] 4.3.2乙醇中不溶物:取本实施例制备的桂枝挥发油Iml，加70%乙醇3ml，摇匀，应 呈澄清液体。
[0054] 4.4含量测定
[0055] 4.4.1色谱条件与系统适应性
[0056]以交联5%苯基甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱(柱长30m，内径0.32mm，膜厚度 0.25μπι)，柱温为程序升温:初始温度为100 °C，以每分钟5 °C的速率升温至150°C，保持5min， 再以每分钟5°C的速率升温至200°C，保持5min;进样口温度为200°C ;检测器温度为220°C ; 分流进样，分离比为20:1。理论塔板数按桂皮醛计算应不低于20000。
[0057] 4.4.2测定法
[0058]分别精密吸取桂皮醛对照品溶液与供试品溶液各?μL，注入气相色谱仪，测定，即 得。
[0059] 本品含桂皮醛(C9H8O)不得少于75.0%。
[0060] 4.5|C 藏
[0061] 遮光，密封，置阴凉处。
[0062] 5.桂皮醛(包合物)质控标准
[0063] 5.1色谱条件与系统适应性
[0064]用5%二苯基-95%二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱（30m X 0.32mm X 0.25μπι);进样 口温度：230°C ;柱温：80°C保持3min，再以20°C/min升至160°C，保持6min;检 测器温度：240°C ;分流进样测定(分流比25:1);柱温：150°C ;载气流速：1.0 ml/min;理论塔 板数按桂皮醛峰计算应不低于30000;桂皮醛峰与内标物质峰的分离度应大于2。
[0065] 5.2测定法
[0066] 精密吸取对照品溶液及供试品溶液各2ul，注入气相色谱仪，测定，即得。
[0067] 本品含桂皮醛(C9H8O)应为6.5~9.0%。
[0068]实施例二肉桂油及其桂皮醛对TRPVl受体拮抗作用研究
[0069]实验目的：研究肉桂油及其桂皮醛对辣椒素(Capsaicin)激动TRPVl通道Ca2+释放 影响，研究肉桂油及其桂皮醛对TRPVl受体拮抗活性。
[0070] 1.材料
[0071] 1.1细胞:hTRPVl-HEK293细胞，转染细胞系，公众可从中国药科大学购买获得。
[0072] I. 2药物及试剂：肉桂油及其桂皮醛，由江苏康缘药业股份有限公司制备，具体制 备方法见实施例一；DMEM培养基（粉末，高糖），购自Gibco公司，12800-017;丙酮酸 (Pyruvate)，购自Gibco 公司，12800-017;胎牛血清(FBS)，购自Gibco 公司，10099-141;选择 性抗生素(G418sulfate，Geneticin)，购自 Gibco公司，11811-031;多聚赖氨酸(Poly-D-lysine，PDL，27964-99_4)，购自 Sigma公司；青链霉素混合液（双抗，Penicillin-Streptomycin， Li quid， 100 X )，购自Gibco公司， 15140-122 ;4_ 轻乙 基哌嗪乙横酸 （HEPES) ， 购自美国Sigma公司，H3375-25G;二甲亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMS0,0231)，购自 Biosharp公司，Calcium5 Kit，Molecular Devices公司；辣椒素（Capsaicin，CAP)，购自美 国 Sigma 公司，360376-1G。
[0073] 2.方法
[0074] 2· 1药物配制：肉桂油10mg，溶于200yLDMS0溶液中，涡旋溶解，配成50mg/mL储备 液;称量桂皮醛1.32mg，溶于200yLMS0溶液中，涡旋溶解，配成50mM储备液;作为母液放入-80°C冰箱中保存。进行细胞筛选时配成系列母液用Lock's缓冲液稀释千分之一倍用于试 验。
[0075] 2.20.01M PBS 缓冲液配制：称取下列试剂：NaCl 8g，KCl 0.2g，KH2P〇4〇.24g， Na2HPO4 · 12H203.64g置于IL烧杯中，加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解，滴加HCl将pH 值调至7.4，加入去离子水定容至lL，0.22μm滤膜过滤后于4°C保存备用。
[0076] 2.31^〇^^'8缓冲液配制：称取下列试剂：此口68 2.1448，他(：19.(^、1((：10.4178、 CaCl2〇 · 256g、MgCl2 · 6H2O 0.204g、葡萄糖 l.Og、甘氨酸0· 0075mg，用去离子水配制成 1000 mL，将 pH 值调至7.4。
[0077] 2.4药物筛选:将对数生长期的hTRPVl-HEK293细胞以1.5 X IO4个/孔接种96孔板 (96 孔板预包被 Poly-D-lysine，50yl/孔，10yg/mL)，细胞接种体积 150μ1/孔，置于 37°C、5% CO2培养箱孵育培养，培养过夜待细胞长至80 %进行试验。从培养箱中取出96孔板，吸出培 养基，加入70μ1/孔Calcium5进行负载染料后放入培养箱中孵育45分钟，另取出一块96孔透 明尖底板，设置溶媒对照(DMS0的Lock' s稀释液）、激动剂Capsaisin(DMS0的Lock' s稀释液） 及8X各个受试药物(Lock's缓冲液稀释125倍），加入体积100μΙ/孔，另取出一块96孔板，设 置溶媒对照(DMS0的Lock's稀释液)及激动剂Capsaisin组(终浓度30ηΜ)，加入体积100μΙ/ 孔，设置双复孔或者三复孔。45分钟后从培养箱中取出负载染料的96孔板，加入Lock's缓冲 液130μ1，吸出150μ1，再加入150μ1，反复3次，最后加入lOOylLock's缓冲液，使终体积150μ 1/孔。三块96孔板按照顺序放入FLIPR TETRA高通量实时荧光成像分析仪中进行检测。检测 前进行黄板板底检测及待测细胞板板底检测，使待测板底值在500左右。荧光值的大小代表 细胞内钙离子多少。
[0078] 3.结果
[0079]与溶媒组比较，模型组荧光峰面积显著增加（ρ〈0.01);与模型组比较，肉桂油组 (30μg/ml)、肉桂油组（15μg/ml)、桂皮醛组(30μΜ)、桂皮醛组（15μΜ)荧光峰面积显著减少(ρ 〈0.01)。结果见表1。
[0080]表1肉桂油及其桂皮醛对TRPVl抑制活性(^bsd.n = 4)
[0082] 与溶媒组比较，p〈0 · 01;与模型组比较:林p〈0 · 01。
[0083] 实施例三肉桂油及其桂皮醛对醋酸扭体反应影响
[0084] 研究目的:通过腹腔注射0.6 %醋酸溶液致小鼠疼痛模型，观察肉桂油及其桂皮醛 镇痛作用。
[0085] 1.材料
[0086] 1.1动物：ICR小鼠，清洁级，18_22g，雌性，购自扬州大学比较医学中心，质量合格 证号：SCXK (苏）2012-0004。
[0087] 1.2药物与试剂
[0088]肉桂油及其桂皮醛，由江苏康缘药业股份有限公司制备，具体制备方法见实施例 ，
[0089]布洛芬缓释胶囊：中美天津史克制药有限公司，规格:0.3g/粒，批号：1409081; [0090] 冰醋酸(AR):广州市南骏贸易有限公司，批号：150121;
[0091]乙醇，南京化学试剂有限公司，批号：13051510689;
[0092]羧甲基纤维素钠 (CMC-Na)，中国医药(集团）上海化学试剂公司，批号:20140720。 [0093] 2.方法
[0094] 60只雌性小鼠随机分成6组，每组10只，即模型组、阳性组(布洛芬，100mg/kg )、肉 桂油组(30mg/kg)、肉桂油组（15mg/kg)、桂皮醛组(30mg/kg)、桂皮醛组（15mg/kg)。各给药 组灌胃给予相应药物，模型组灌胃给予0.5%CMC-Na，给药体积均为20ml/kg。每日1次，连续 5日，末次灌胃给药Ih后，各鼠腹部注射0.6%醋酸溶液，0.4ml/只，观察记录注射后25min内 小鼠扭体次数(腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高），计算各组抑制率百分率（％)。
[0095] 抑制率百分率（％ )=(模型组扭体次数平均值-各给药组扭体次数平均值)/模型 组扭体次数平均值X 100%。
[0096] 3.结果
[0097] 与模型组比较，阳性组(布洛芬，100mg/kg)、肉桂油组(30mg/kg)、肉桂油组（15mg/ kg)、桂皮醛组（30mg/kg)、桂皮醛组（15mg/kg)均能显著减少小鼠扭体反应（p〈0.01，p〈 0.05)。结果见表2。
[0098]表2肉桂油及其桂皮醛对醋酸致小鼠扭疼痛模型影响(：士sd，n = 10)
L0100J 与模型组比较:*p〈0 · 05，#p〈0 · Ol。
[0101] 实施例四肉桂油及其桂皮醛对催产素引起小鼠痛经影响
[0102] 实验目的：通过腹腔注射缩宫素注射液致小鼠痛经模型，观察肉桂油及其桂皮醛 对催产素引起小鼠痛经影响。
[0103] 1.材料
[0104] 1.1动物：ICR小鼠，清洁级，18-22g，雌性，购自扬州大学比较医学中心，质量合格 证号：SCXK (苏）2012-0004。
[0105] 1.2药物与试剂
[0106] 肉桂油及其桂皮醛，由江苏康缘药业股份有限公司制备，具体制备方法见实施例 ，
[0107] 布洛芬缓释胶囊：中美天津史克制药有限公司，规格:0.3g/粒，批号：1409081;苯 甲酸雌二醇注射液:宁波第二激素厂，规格:2ml: 4mg，批号：150202;
[0108] 缩宫素注射液:上海禾丰制药有限公司，规格:Iml: IOIU，批号：141212;
[0109] 生理盐水：山东长富洁晶药业有限公司，批号：150229;
[0110]乙醇，南京化学试剂有限公司，批号：13051510689;
[0111] 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，中国医药(集团）上海化学试剂公司，批号:20140720。
[0112] 2.方法
[0113] 70只雌性小鼠随机分成7组，每组10只，即正常组、模型组、阳性组(布洛芬，IOOmg/ kg)、肉桂油组(30mg/kg)、肉桂油组（15mg/kg)、桂皮醛组(30mg/kg)、桂皮醛组（15mg/kg)。 正常组小鼠背部皮下注射生理盐水，连续l〇d，第1天、第10天注射0.05ml/只，其余日 0.025ml/只；其余6组各鼠背部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液，连续10天，第UlOd注射 0.05ml/0.1 mg/只，其余日0.025ml/0.05mg/只。正常组和模型组于皮下注射生理盐水第4d 灌胃给予0.5%CMC-Na;阳性2组、药物1组、药物2组和药物3组于皮下注射苯甲酸雌二醇注 射液第4d灌胃给予相应药物，阳性1组与皮下注射苯甲酸雌二醇注射液第8d灌胃给予相应 药物，给药体积均为20ml/kg。末次灌胃Ih后，各鼠腹部注射缩宫素注射液0.2ml/2IU/只。观 察注射缩宫素注射液后30min内扭体次数(腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高），计算各组抑制 率百分率（％)。
[0114] 抑制率百分率（％ )=(模型组扭体次数平均值-各给药组扭体次数平均值)/模型 组扭体次数平均值X 100%。
[0115] 3.结果
[0116] 与正常组比较，模型组小鼠能产生明显的扭体反应；与模型组比较，阳性组(布洛 芬，100mg/kg)、肉桂油组(30mg/kg)、肉桂油组（15mg/kg)、桂皮醛组（30mg/kg)、桂皮醛组 (15mg/kg)扭体次数显著减少。结果见表3。
[0117] 表3肉桂油及其桂皮醛对对缩宫素致小鼠痛经模型影响士 Sd，n = 10)
[0119] 与正常组比较:##ρ〈0·01;与模型组比较:林ρ〈0·01。
[0120] 实施例五肉桂油及其桂皮醛对福尔马林致小鼠炎性痛影响
[0121] 研究目的:通过足底皮下注射5%福尔马林溶液致小鼠疼痛模型，观察肉桂油及其 桂皮醛镇痛作用。
[0122] 1.材料
[0123] 1.1动物：ICR小鼠，清洁级，18_22g，雌性，购自扬州大学比较医学中心，质量合格 证号：SCXK (苏）2012-0004。
[0124] 1.2药物与试剂
[0125] 肉桂油及其桂皮醛，由江苏康缘药业股份有限公司制备，具体制备方法见实施例 ，
[0126] 布洛芬缓释胶囊，中美天津史克制药有限公司，规格:0.3g/粒，批号：1409081;
[0127] 甲醛，南京化学试剂有限公司，批号：12062011019;
[0128] 乙醇，南京化学试剂有限公司，批号：13051510689;
[0129] 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，中国医药(集团）上海化学试剂公司，批号:20140720。
[0130] 2.方法
[0131] 60只雄性小鼠随机分成6组，每组10只，即模型组、阳性组(布洛芬，100mg/kg)、肉 桂油组(30mg/kg)、肉桂油组（15mg/kg)、桂皮醛组(30mg/kg)、桂皮醛组（15mg/kg)。各给药 组灌胃给予相应药物，模型组灌胃给予0.5%CMC-Na，给药体积均为20ml/kg。每日1次，连续 5日，末次灌胃给药Ih后，各鼠右后足足跖底部注射5%福尔马林溶液，20μ1/只，注射后立即 计时，分别记录小鼠在注射后I相(O-IOmin)及Π相（10-60min)两个时相内舔、咬右后足的 累计时间。
[0132] 3.结果
[0133] 与模型组比较，阳性组(布洛芬，100mg/kg)、肉桂油组(30mg/kg)、肉桂油组（15mg/ kg)、桂皮醛组(30mg/kg)、桂皮醛组（15mg/kg)对Π相疼痛反应均有非常显著的抑制作用(p 〈0.01)。结果提示肉桂油、桂皮醛对甲醛致痛模型有一定的镇痛作用，具有一定外周镇痛作 用。结果见表4。
[0134]表4肉桂油及其桂皮醛对福尔马林致小鼠炎性痛影响G±Sd，n = 10)
[0136] 与模型组比较:林ρ〈0·01。
[0137] 实施例六小鼠毒性实验
[0138] 1、实验材料
[0139] 6-8周龄雄性小鼠，130只，体重18~22g克，购自扬州大学比较医学中心，质量合格 证号：SCXK (苏）2012-0004。
[0140] 2、实验方法
[0141] 1)药物的配制
[0142] 肉桂油及桂皮醛用无水乙醇溶解(浓度不超过1%)，用0.5%CMC_Na配制所需的系 列浓度。
[0143] 2) LD5Q 测定
[0144] 取体重ICR小鼠130只，按体重随机分为13个剂量组，每组10只，雌雄各半。其中第 13组为对照组，给予0.5%CMC-Na，1-6组给予不同剂量的肉桂油，组间比值按照1:0.8递减 稀释成系列浓度药液，最大剂量组的药液浓度为8g/k g<37-12组给予不同剂量的桂皮醛，组 间比值按照1:0.8递减稀释成系列浓度药液，最大剂量组的药液浓度为5g/kg。组均按20ml/ kg体重灌胃给药。采用SPSS19.0分别计算小鼠半数致死量(LD 50)。
[0145] 2)评价指标
[0146] 给药后4小时内连续密切观察动物的毒性反应情况，记录动物死亡数目和死亡时 间。给药后第1-14天，每日观察一次，记录动物是否出现毒性反应，毒性症状及其程度，毒性 出现和消失的时间等，记录动物死亡情况。
[0147] 观察指标包括:各组动物死亡数目、死亡时程;动物的一般状况、皮毛与呼吸状况、 行为步态等运动与神经状况、眼耳口鼻状况、粪便、尿液等。给药后以及观察期死亡的动物， 立即剖检;濒临死亡的动物或发现动物有严重痛苦时，出于伦理原则将其处死进行剖检。观 察有无死亡发生，记录死亡发生时间，尸检，观察有无异常现象。
[0148] 在急性毒性试验中，灌胃大、小鼠的毒性分级依据LD5q分为五级:LD5Q〈 lmg/kg为极 毒，LD5Q 在 l-50mg/kg 之间为剧毒，LD5Q在 51_500mg/kg 为中等毒，LD5Q在 501-5000mg/kg 之间 为低毒，大于5000mg/kg为实际无毒。
[0149] 3、实验结果
[0150] 3.1中毒反应情况
[0151 ] (1)中枢运动系统:第3、9组给药后2小时内静伏少动，动物出现昏睡，之后正常;第 1、7组持续6小时，第2、8组持续5小时;第4、5、6、10、11、12组未见此现象发生。（2)神经系统： 第1、7组给药后24小时内对刺激的反应迟钝，之后正常;第2、8组给药18小时内对刺激的反 应迟钝，之后正常；第3、4、5、6、9、10、11、12组未见此现象发生。（3)呼吸系统：均未见分泌 物，也未见呼吸频率和深度改变。（4)胃肠系统:大便均为黑色固体。（5)皮肤和皮毛:给药后 均出现皮毛松散，颜色发黄。第1、7组持7天后恢复正常，第2、8组持续5天后恢复正常，第3、9 组持续3天后恢复正常，第4、5、6、10、11、12组持续2天后恢复正常。
[0152] 3.2LD5q 计算结果
[0153] 肉桂油的LD5q为4.724g/kg，桂皮醛LD5q为2.937g/kg，结果见表5。
[0154]表5肉桂油及桂皮醛对小鼠毒性反应情况
[0156] 本发明的肉桂油及其桂皮醛LD5q均在501-5000mg/kg之间，说明本发明的肉桂油及 其桂皮醛属低毒。
[0157] 最后应说明的是:显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并 非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做 出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引 申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 肉桂油和/或其主成分桂皮醛作为制备辣椒素受体TRPV1拮抗剂的用途。2. 肉桂油和/或其主成分桂皮醛作为制备具有镇痛作用的药物的用途。3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述镇痛作用包括对内脏痛、炎性痛及痛经 的镇痛作用。4. 一种辣椒素受体TRPV1拮抗剂或具有镇痛作用的药物，其特征在于，包括有效量的桂 皮醛和/或肉桂油。5. 如权利要求4所述的拮抗剂或药物，其特征在于，剂型为注射剂、片剂、散剂、颗粒剂、 丸剂、胶囊、口服液、膏剂、乳液、纳米剂、霜剂或喷剂。6. 如权利要求5所述的拮抗剂或药物，其特征在于，包括一种或一种以上药学上可接受 的辅料。7. 如权利要求6所述的拮抗剂或药物，其特征在于，所述辅料包括药学领域常规的赋形 剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂或缓释剂。8. 如权利要求1至3中任一所述的肉桂油的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 取肉桂的干燥嫩枝，加入肉桂的干燥嫩枝重量2-6 %的乙酸乙酯后进行蒸馏，弃去乙酸 乙酯层，获得的挥发油即所述肉桂油。9. 如权利要求1至3中任一所述的桂皮醛的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将肉桂的干燥嫩枝粉碎至20-60目； (2) 将（1)中粉碎后获得的肉桂粉末加入20-30倍量的蒸馏水，再加入KC1，进行蒸馏提 取1.5-2.5h; (3) 将(2)中肉桂油-水混合液转移至离心机中离心，弃去水层； (4) 将(3)中产物精馏，精馏条件为160 °C，回流比：1:1，真空度:6.65kpa，通过精馏获得 桂皮醛。10. 如权利要求8中制备的肉桂油的质控方法，其特征在于，所述肉桂油同时满足如下 (1)至(7)的条件： (1) 所述肉桂油在乙醇或冰醋酸中易溶，相对密度为1.055~1.070,折光率为1.602~ 1.614； (2) 将所述肉桂油冷却至0°C，加等容的硝酸振摇后析出结晶性沉淀； (3) 薄层色谱法鉴别所述肉桂油与桂皮醛对照品在相应位置显相同颜色的斑点； (4) 取所述肉桂油10ml，加水10ml与盐酸1滴，振摇后，通硫化氢气使饱和，水层与油层 均不变色； (5) 取所述肉桂油lml，加70%乙醇3ml，摇勾，现澄清液体； (6) 色谱检测：以交联5%苯基甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱，柱温为程序升温，初 始温度为100°C，以每分钟5°C的速率升温至150°C，保持5min，再以每分钟5°C的速率升温至 200°C，保持5min;进样口温度为200°C ;检测器温度为220°C ;分流进样，分离比为20:1，理论 塔板数按桂皮醛计算应不低于20000; (7) 分别精密吸取桂皮醛对照品溶液与供试品溶液各?μL，注入气相色谱仪，测定，所述 肉桂油含桂皮醛不少于75.0%。11. 如权利要求8中制备的桂皮醛的质控方法，其特征在于，所述桂皮醛同时满足如下 (1)和(2)的条件： (1) 色谱检测：用5%二苯基-95%二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱;进样口 温度：230 °C ;柱温：80 °C保持3min，再以20 °C /min升至160 °C，保持6min;检测器温度：240 °C ; 分流进样测定，分流比25:1;柱温：150°C ;载气流速：1 .Oml/min;理论塔板数按桂皮醛峰计 算不低于30000;桂皮醛峰与内标物质峰的分离度大于2; (2) 精密吸取对照品溶液及供试品溶液各2ul，注入气相色谱仪，测定，桂皮醛含量在 6.5~9.0%之间。
【文档编号】C07C45/83GK105963352SQ201610424863
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】萧伟, 孙兰, 宗绍波, 李家春, 周军, 曹亮, 王振中
【申请人】江苏康缘药业股份有限公司