中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法
【专利摘要】本发明公开了一种中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法，包括：制备中药水煎剂；以色谱柱为C18色谱柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，进行中药水煎剂中抗α?溶血素裂解红细胞的有效成分的分析；以水和乙腈为流动相，C18色谱柱，梯度洗脱，制备中药水煎剂中抗溶血素裂解红细胞的有效成分；将收集的提取液旋蒸，提取液中的物质，?80℃冷冻，置于真空冷冻干燥机中挥干水分。本发明采用水相提取，减少有机溶剂对药物中有效成分的提取物活性的影响，前处理简单，减少了提取所用的时间，能够有效的分离提取出中药方剂中抗溶血活性的有效成分。
【专利说明】
中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法
技术领域
[0001 ]本发明属于中药制备领域，尤其涉及一种中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法。
【背景技术】
[0002]中药凉血方是治疗微生物感染的首选方剂。在中医理论上认为其具有清热解毒，活血化瘀等功效。但是在现代医学理论的解释却不清楚。细菌对机体的致病因子是其在增殖过程中分泌的各种毒力因子，其中以溶血毒素和粘附蛋白的毒力作用最强，当这两类蛋白的分泌被抑制后，细菌的致病作用也明显降低。发明人从现有的方剂中筛选出以牛角地黄方剂为主的对细菌感染性疾病的治疗效果明显组方作为主要的研究方剂。经过发明人前期的研究已经明确该方剂中的有效药物。对于中药有效药物的分析和提取方法，现有的很多中药中的单体有效成分多数都是用有机相提取，具有脂溶性的特点，但是在生物体内脂溶性的物质通常有较大的毒性，且与中药的实际疗效差别较大。用有机相提取虽然能够提出很多的物质，但却失去其生物活性。在中药有效部位和活性成分的离制备方法中，主要采用溶剂极性依次递增分离法、梯度洗脱分析法等。现有技术采用有机溶剂提取方法，虽然能分离到大部分的化学成分，但有些中药中的主要化学成分为极性或半极性，采用有机方法提取出的主要成分如芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚等都不具有抗溶血素活性的作用，与发现的药效不相符。现有高效液相色谱方法中有用到乙腈磷酸为流动相，由于磷酸对该有效成分也会有影响，降低制备产物的活性。
[0003]因此，从中药牛角地黄汤中分离抗溶血素活性有效成分方法属于技术空白。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法，旨在解决从中药牛角地黄汤中分离抗溶血素活性有效成分方法属于技术空白的问题。
[0005]—种中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法，包括:
[0006]步骤一、制备中药水煎剂:用中药饮片制备牛角地黄汤，煎煮至沸后，收集药汤，滤去药渣，合并两次药汤，浓缩药汤；
[0007]步骤二、应用液相色谱仪，以色谱柱为C18色谱柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，进行中药水煎剂中抗α-溶血素裂解红细胞的有效成分的分析；
[0008]步骤三、以水和乙腈为流动相，C18色谱柱，梯度洗脱，制备中药水煎剂中抗溶血素裂解红细胞的有效成分；
[0009]步骤四、将收集的提取液旋蒸，45°C下挥干提取液中的流动相，用纯水复溶旋蒸瓶内的物质，_80°C冷冻，置于真空冷冻干燥机中挥干水分。
[0010]进一步，所述的中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法还包括溶血活性的测定方法，具体方法为:
[0011]将中药水煎剂用pH7.2的磷酸盐缓冲液进行1:1倍比稀释，然后加入终浓度500ng/ml的溶血素和终浓度1%的兔红细胞混合均匀，37°C保温处理45min，3000rpm离心1min，取上清置于96孔板中，酶标仪测定，OD 490值越大说明红细胞裂解率越高。
[0012]进一步，所述的中药水煎剂中抗α-溶血素裂解红细胞的有效成分的分析的具体方法为:
[0013]应用液相色谱仪，以色谱柱为C18色谱柱，流动相为水-乙腈，水为流动相Α，乙腈为流动相B ；梯度洗脱过程如下:95 % A，1min; 95-90 % A，1min; 90-80 % A，1min; 80-100 % A，5min ；流速lml/mim，柱温25°C，进样量为50μ1，色谱分析时间为60min。
[0014]进一步，所述的制备中药水煎剂中抗溶血素裂解红细胞的有效成分的色谱的具体方法为:
[0015]应用制备液相色谱，以水-乙腈为流动相，水为流动相A，乙腈为流动相B，C18色谱柱，梯度洗脱过程为:95%A，1min，95-90%A，1min，90-80%A，1min，80-60%A，1min，60-95%A，10min;流速10ml/min，柱温25°C，进样量为1000μ1;;按色谱图中的出峰时间进行收集洗脱液，将洗脱液倒入旋蒸瓶用旋转蒸发仪旋蒸浓缩，蒸干溶剂，将旋蒸瓶底部药物用2ml灭菌纯水溶解，收集制备浓缩液，于-80 °C冷冻后，用真空冷冻干燥机进行冻干，得到中药水煎剂中有效成分的干粉。
[0016]本发明是从中药方剂中提取分离具有抗溶血素活性的有效成分方法，该方法以水浸和煎煮的传统方法处理药物，避免了有机醇类溶剂对提取物活性的影响。本发明建立的液相色谱分析方法采用有机相为低含量的乙腈的梯度洗脱法，该方法能有效分离水煎粗提物，目标峰与杂峰无干扰，分离效果好，变异系数在10%之内。在成功建立色谱分析方法的基础上，本发明建立了制备抑制溶血素活性物质的液相制备色谱法，并成功获得了抑制溶血素活性的有效物质，制备产量可达5-8%。
【附图说明】
[0017]图1是本发明实施例提供的中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法流程图。
[0018]图2是本发明实施例提供的牛角地黄汤与红细胞、α-溶血素共同孵育0.5?2h后对α-溶血素溶血活性的抑制作用的示意图。
[0019]图3是本发明实施例提供的牛角地黄汤各中药单方与红细胞、α-溶血素共同孵育
0.5h后对α-溶血素溶血活性的抑制作用的示意图。
[0020]图4是本发明实施例提供的牛角地黄汤水煎液分析色谱图。
[0021 ]图5是本发明实施例提供的赤芍水煎液分析色谱图。
[0022]图6是本发明实施例提供的芍药苷标准品色谱图。
[0023]图7是本发明实施例提供的制备色谱图。
[0024]图8是本发明实施例提供的制备产物的分析色谱图。
[0025]图9-1和9-2是本发明实施例提供的制备产物的活性检测示意图。
[0026]图10是本发明实施例提供的芍药苷标准品抗溶血活性的检测示意图。
【具体实施方式】
[0027]以下结合附图对本发明做进一步描述:
[0028]请参阅图1，本发明实施例的中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法，包括:
[0029]SlOl、制备中药水煎剂:用中药饮片制备牛角地黄汤，煎煮至沸后，收集药汤，滤去药渣，合并两次药汤，浓缩药汤；
[0030]S102、应用液相色谱仪，以色谱柱为C18色谱柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，进行中药水煎剂中抗α-溶血素裂解红细胞的有效成分的分析；
[0031 ] S103、以水和乙腈为流动相，C18色谱柱，梯度洗脱，制备中药水煎剂中抗溶血素裂解红细胞的有效成分；
[0032 ] S104、将收集的提取液旋蒸，45 °C下挥干提取液中的流动相，用纯水复溶旋蒸瓶内的物质，-80 0C冷冻，置于真空冷冻干燥机中挥干水分。
[0033]所述的中药方剂牛角地黄汤分离中抑制溶血素活性有效成分方法还包括溶血活性的测定方法，具体方法为:
[0034]将中药水煎剂用pH7.2的磷酸盐缓冲液进行1:1倍比稀释，然后加入溶血素(终浓度500ng/ml)和兔红细胞(终浓度1%)混合均匀，37°C保温处理45min，3000rpm离心lOmin，取上清置于96孔板中，酶标仪检测，0D490值越大说明红细胞裂解率越高。
[0035]所述的中药水煎剂中抗α-溶血素裂解红细胞的有效成分的分析的具体方法为:
[0036]将中药饮片各成分用纯水浸泡30min后，加热煎煮至沸，继续煎煮30min，纱布过滤收集药液，重复煎煮一次，合并两次水煎液浓缩致100mg/ml，取浓缩液用0.45μπι水系滤膜过滤于进样瓶中C3HPLC分析色谱工作条件，色谱柱为Ci8色谱柱，流动相为水-乙腈，水为流动相A，乙腈为流动相B ；梯度洗脱过程如下:95 % A，1min ； 95-90 % A，1min ； 90-80 % A，1min;80-100%A，5min ；流速lml/mim，柱温25°C，进样量为50μ1，色谱分析时间为60min。
[0037]所述的制备中药水煎剂中抗溶血素裂解红细胞的有效成分的制备色谱的具体方法为:
[0038]将中药饮片各成分用纯水浸泡30min后，加热煎煮至沸，继续煎煮30min，纱布过滤收集药液，重复煎煮一次，合并两次水煎液浓缩致100mg/ml，取浓缩液用0.45μπι水系滤膜过滤于进样瓶中。制备液相色谱工作条件:以水-乙腈为流动相，水为流动相Α，乙腈为流动相B ； Ci8色谱柱，梯度洗脱过程为:95 %A，1min，95-90 % A，1min，90-80 % A，1min，80-60 % A，1011^11，60-95%厶，101^11;流速101111/1^11，柱温25°(:，进样量为100(^1。按色谱图中的出峰时间进行收集洗脱液，将洗脱液倒入旋蒸瓶用旋转蒸发仪旋蒸浓缩，蒸干溶剂，将旋蒸瓶底部药物用2ml灭菌纯水溶解，收集制备浓缩液，于_80°C冷冻后，用真空冷冻干燥机进行冻干，得到中药水煎剂中有效成分的干粉。
[0039]下面结合具体的实验对本发明的应用效果作详细的描述。
[0040]I牛角地黄汤及其主要成分的抗溶血素的效果，如图2所示。
[0041 ] 牛角地黄汤水煎剂在与HLa同时处理兔RBC后，随着药物浓度的升高，毒素的溶血活性被显著抑制，在2.5mg/mL浓度时溶血毒素的活性抑制率达到了90%以上(图2)，药物与HLa处理rRBC后作用不同时间的差异不显著。该结果显示牛角地黄汤剂具有抑制HLa活性的作用。
[0042]将方剂中各单方药物水煎后用同样的方法进行试验。结果显示，在相同的药物浓度下赤芍水煎液的抑制溶血素活性的作用最强(图3)。在0.08mg/mL时溶血抑制率仍达90%以上，丹皮次之，在0.63mg/mL溶血抑制率达90%以上，而钩藤、牛角和生地水煎液在当前浓度下未检测出明显的抑制溶血素活性的作用。
[0043]2抗溶血素成分色谱分析，如图4?6所示
[0044]从牛角地黄汤、赤芍的水煎提取物和芍药苷标准品色谱图(图4?6)可知，本次建立的牛角地黄汤和赤芍的水煎提取物的检测方法能有效的避免杂峰的干扰，其主峰的保留时间相似均为24min左右。与芍药苷的保留时间相似。
[0045]3制备产物的色谱分析，如图8所示
[0046]用本制备方法得到的制备产物在制备色谱上的出峰时间为40-48min(图7)，目标产物符合分析色谱的特征(图8)。
[0047]4制备产物的抗溶血素活性分析，如图9-1、图9-2和图10所示。
[0048]结果显示，通过制备色谱制备出的目标提取成分虽然与芍药苷出峰时间一致，但是制备产物具有芍药苷没有的抗溶血素活性。
[0049]利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，设计出类似的技术方案，而达到上述技术效果的，均是落入本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法，其特征在于，所述的中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法以水浸和煎煮的方法处理药物，用中药饮片制备牛角地黄汤，煎煮至沸后，收集药汤，滤去药渣，合并两次药汤，浓缩药汤;应用液相色谱仪，以色谱柱为C18色谱柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，进行中药水煎剂中抗α-溶血素裂解红细胞的有效成分的分析；以水和乙腈为流动相，C18色谱柱，梯度洗脱，建立液相色谱分析方法采用有机相为低含量的乙腈的梯度洗脱法。2.如权利要求1所述的中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法，其特征在于，所述的中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法具体包括: 步骤一、制备中药水煎剂:用中药饮片制备牛角地黄汤，煎煮至沸后，收集药汤，滤去药渣，合并两次药汤，浓缩药汤； 步骤二、应用液相色谱仪，以色谱柱为C18色谱柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，进行中药水煎剂中抗α-溶血素裂解红细胞的有效成分的分析； 步骤三、以水和乙腈为流动相，C18色谱柱，梯度洗脱，制备中药水煎剂中抗溶血素裂解红细胞的有效成分； 步骤四、将收集的提取液旋蒸，45°C下挥干提取液中的流动相，用纯水复溶旋蒸瓶内的物质，-80 °C冷冻，置于真空冷冻干燥机中挥干水分。3.如权利要求2所述的中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法，其特征在于，所述的中药方剂中牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法还包括溶血活性的测定方法，具体方法为: 将中药水煎剂用PH7.2的磷酸盐缓冲液进行1:1倍比稀释，然后加入终浓度500即/1111的溶血素和终浓度I %的兔红细胞混合均匀，37°(:保温处理45min，3000rpm离心1min，取上清置于96孔板中，酶标仪检测，0D490值越大说明红细胞裂解率越高。4.如权利要求2所述的中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法，其特征在于，所述的中药水煎剂中抗α-溶血素裂解红细胞的有效成分的分析的具体方法为: 将中药饮片各成分用纯水浸泡30min后，加热煎煮至沸，继续煎煮30min，纱布过滤收集药液，重复煎煮一次，合并两次水煎液浓缩至100mg/ml，取浓缩液用0.45μηι水系滤膜过滤于进样瓶中;HPLC分析色谱工作条件，色谱柱为C18色谱柱，流动相为水-乙腈，水为流动相A，乙腈为流动相B;梯度洗脱过程如下:95%A，10min;95_90%A，10min;90_80%A，10min;80_100 % A，5min ；流速lml/mim，柱温25 °C，进样量为50μ1，色谱分析时间为60min。5.如权利要求2所述的中药方剂牛角地黄汤中分离抑制溶血素活性有效成分方法，其特征在于，所述的制备中药水煎剂中抗溶血素裂解红细胞的有效成分的制备色谱的具体方法为: 将中药饮片各成分用纯水浸泡30min后，加热煎煮至沸，继续煎煮30min，纱布过滤收集药液，重复煎煮一次，合并两次水煎液浓缩至100mg/ml，取浓缩液用0.45μηι水系滤膜过滤于进样瓶中；制备液相色谱工作条件:以水-乙腈为流动相，水为流动相Α，乙腈为流动相B;Ci8色谱柱，梯度洗脱过程为:95%A，1min，95-90%A，1min，90-80%A，1min，80-60%Α，10min，60-95%A，10min;流速10ml/min，柱温25°C，进样量为ΙΟΟΟμΙ;按色谱图中的出峰时间进行收集洗脱液，将洗脱液倒入旋蒸瓶用旋转蒸发仪旋蒸浓缩，蒸干溶剂，将旋蒸瓶底部药物用2ml灭菌纯水溶解，收集制备浓缩液，于_80°C冷冻后，用真空冷冻干燥机进行冻干，得到中药水煎剂中有效成分的干粉。
【文档编号】A61K36/804GK105963413SQ201610294654
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】孙英健, 李增顺, 穆祥
【申请人】北京农学院