一种光敏生物胶及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种光敏生物胶，以猪小肠粘膜脱细胞基质作为支架材料，含有核黄素或其衍生物。本发明制得的凝胶与人细胞外基质成分高度接近，含有丰富的生长因子，具有良好的生物相容性，更有利于支持细胞的生长。本发明制作工艺简单，除原材料外，仅需白炽灯作为生产设备，不需要复杂的设备，整个操作过程不含有对细胞有害的成分，且不造成环境污染。
【专利说明】
_种光敏生物胶及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种生物材料，具体涉及一种光敏材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 创面修复是临床面临的一个重要课题，特别是因糖尿病引起的慢性创面的修复， 一直未能得到很好的解决。创面的修复是细胞和细胞外基质相互作用的结果，细胞外基质 为细胞的良好生长提供条件。在慢性创面的局部，其细胞外基质发生病理变化，已不适于细 胞的生长，这也是其长期不愈，反复发作的一个重要原因。此时，为其补充正常的细胞外基 质，将有利于促进其创面的愈合。
[0003] 猪小肠粘膜脱细胞基质（small intestinal submucosa，SIS)作为天然的细胞外 基质成分，其所含的物质化学成分与人细胞外基质成分高度接近，具有良好的生物相容性， 广泛应用于临床各种组织的修复支架。但应用于糖尿病溃疡等不规则的创面，不能与创面 完全贴合，影响愈合效果。为解决这一问题，通常是将胶原等细胞外基质主要成分进行化学 改性，引入双键基团，再加入Irgacure2959等光敏试剂，在特殊波段的光照下形成凝胶。
[0004] 上述方法虽能在原位形成凝胶，解决外源细胞外基质与创面无缝结合的问题，但 存在以下问题：1)需要对胶原等细胞外基质成分进行改性，程序复杂，不可避免的引起改性 物质的残留，且纯化过后终产品的得率低下；2)常用的光敏剂Irgacure 2959有一定的细胞 毒性;3)需要使用特殊波段的光源，使用的便捷性不够。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种能够在创面上原位成胶并对创面无任何损伤的可吸收 生物凝胶;并提供一种简便有效的光敏细胞外基质材料的制备方法。
[0006] 一种光敏生物胶，以猪小肠粘膜脱细胞基质（small intestinal submucosa，SIS) 作为支架材料，含有核黄素(维生素 B2)或其衍生物。
[0007] 本发明以猪小肠粘膜基质为原材料，以核黄素或其衍生物为交联剂，通过可见光 交联诱发，增强分散度很高的基团间键能，有效的将溶液相变为固体凝胶，并保持良好组织 相容性和生物活性。
[0008] 本发明可在创面原位成胶无任何创伤，同时能最大程度的保留SIS中的多种细胞 因子，并具有生物活性，有利于组织重塑和伤口修复。
[0009] 上述的光敏生物胶，核黄素或其衍生物:猪小肠粘膜脱细胞基质质量百分比优选 为1-4:10-40。
[0010] 上述光敏生物胶的制备方法，将核黄素或其衍生物加入猪小肠粘膜脱细胞基质， 白炽灯照射3-5min。
[0011]上述光敏生物胶的制备方法，包括以下步骤:将猪SIS溶解于中性溶液后，加入核 黄素或其衍生物混合，使用普通白炽灯光源照射3_5min形成凝胶。本发明方便简单易操作， 无需额外的化学修饰，且形成的凝胶生物相容性好，细胞可在其表面生长。
[0012] 上述光敏生物胶的制备方法，包括以下步骤：
[0013] USIS原料准备：
[0014] (1)将0.5 % -2 %的猪小肠粘膜基质（SIS)溶解于0.0 lM盐酸或醋酸，溶解后与1/10 体积的〇. IM NaOH混合，调pH值至中性；
[00?5] ⑵配制I OOmg/ml的核黄素原液；
[0016] (3)将核黄素与中性SIS混合均匀，核黄素终浓度为0.05%-0.2% ;
[0017] 2、光敏成胶
[0018]将混合溶液滴入96孔板或其他模具中，用200W的白炽灯泡距离96孔板或模具10-30cm处照射3-5min，溶液即发生相变，形成凝胶。
[0019] 有益效果
[0020] (1)本发明制得的凝胶与人细胞外基质成分高度接近，含有丰富的生长因子，具有 良好的生物相容性，更有利于支持细胞的生长。
[0021] (2)本发明制作工艺简单，除原材料外，仅需白炽灯作为生产设备，不需要复杂的 设备，整个操作过程不含有对细胞有害的成分，且不造成环境污染。
[0022] (3)本发明可用作细胞治疗的载体，原位形成带细胞的凝胶进行组织再生修复。本 发明还可用与3D打印相结合，制备不同形状和含不同类型细胞及不同结构的复杂3D组织工 程产品。
【附图说明】
[0023]图1光敏凝胶；
[0024] 图2光敏组织材料中细胞存活和生长情况;A-体外培养1天后细胞染色情况，B-体 外培养3天后细胞染色情况。
[0025] 图3光敏凝胶用于动物创伤原位修复;左侧为对照组，右侧为实验组。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步的描述，并不因此将本发明限 制在所述的实施例范围之中。
[0027] 实施例1
[0028] -种光敏生物胶，其制备方法包括以下步骤：
[0029] 1、原料准备：
[0030] 1)将〇.5%-2%的猪小肠粘膜基质（SIS)溶解于0.OlM盐酸或醋酸，彻底溶解后与 1/10体积的〇. IM NaOH混合，调pH值至中性。
[0031] 2)配制100mg/ml的核黄素原液备用。
[0032] 3)将核黄素与中性SIS混合均匀，核黄素终浓度为0.05%-0.2%。
[0033] 2、光敏成胶
[0034]将混合的溶液滴入96孔板或其他模具中，用200W的白炽灯泡距离96孔板或模具 10-30cm处照射3-5min，溶液即发生相变，形成凝胶，其大体形态如图1所示。
[0035] 3、光敏凝胶的细胞相容性评价
[0036]将小鼠骨髓干细胞以10000/cm2的密度接种于光敏胶的表面，培养1天和3天后分 别进行活死细胞染色分析(活-死细胞染色试剂盒，Invitrogen)，结果如图2所示，可见本凝 胶具有良好的细胞相容性。
[0037]图2-A中，培养1天后活细胞为绿色，死细胞为红色。在图中可以看到，细胞成功的 长在水凝胶上，并且没有任何死细胞，细胞生长良好。这证明光引发的SIS水凝胶对细胞无 任何毒副作用，有良好的细胞相容性。
[0038]图2-B中，培养3天后，与培养一天的照片相比，细胞数量增多，这说明细胞已经开 始繁衍，而且扩散均匀，并无任何死细胞。这表现SIS光引发的水凝胶不仅生物相容性良好， 并且能促进和支撑细胞生殖繁衍，能够锚定细胞，是良好的生物材料支架。
[0039] 4.光敏凝胶中的细胞因子检测
[0040]采用ELISA检测分别原材料猪小肠粘膜基质SIS以及光敏凝胶中细胞因子VEGF，b-FGF，TGF-b，and TNF-a含量如表 1 所示。
[0041]衷1 L 〇〇43 J 5.植入动物体后原位修复买验
[0044] (l)200mgSis粉末，溶解于0.01M HCL IOml中（浓度2%)，用小磁力搅拌子，4摄氏 度溶解48h，中途用棒搅拌一次把上层的sis充分溶解至溶液中，无大颗粒，均质。
[0045] (2)核黄素 IOOmg溶解于10*PBSlml中（浓度10%)，用2ml EP管操作，锡箱纸包裹避 光。
[0046] (3)调节sis溶液至中性：取IOOulO. IM NaOH溶液加入2ml EP管，取Iml溶解好的 sis溶液Iml加入此EP管，轻轻吹打一下，再取IlOul 10*PBS直接加入此溶液中，再次轻轻吹 打。由于材料粘稠度高，吸头操作很容易产生气泡，吹打时移液枪按下一半即可，避免产生 大量气泡。
[0047] (4)取配置好的20uI 10 %浓度核黄素，直接加入到上述调节至中性的sis溶液中。 备注:加核黄素时，枪头从EP管底部由下至上一点点加入，以达到均匀的效果，此时核黄素 终浓度为0.2%。
[0048] (5)小鼠麻醉，背部脱毛，用punch在小鼠背部制作一个直径6mm的皮肤缺损
[0049] (6)取加入核黄素的sis溶液0.1ml滴在小鼠皮肤缺损处，，用200w白炽灯距创面 20cm处照射6min，即可成胶，结果如图3所示，左侧为未做任何处理的创伤对照组，右侧为创 面直接成胶的实验组。
【主权项】
1. 一种光敏生物胶，以猪小肠粘膜脱细胞基质作为支架材料，其特征在于:含有核黄素 或其衍生物。2. 如权利要求1所述的光敏生物胶，核黄素或其衍生物:猪小肠粘膜脱细胞基质质量百 分比为 1-4:10-40。3. 如权利要求1或2所述光敏生物胶的制备方法，将核黄素或其衍生物加入猪小肠粘膜 脱细胞基质，白炽灯照射3_5min。4. 如权利要求3所述光敏生物胶的制备方法，包括以下步骤:将猪SIS溶解于中性溶液 后，加入核黄素或其衍生物混合，使用普通白炽灯光源照射3-5min形成凝胶。5. 如权利要求3所述光敏生物胶的制备方法，包括以下步骤： (1)将0.5%-2%的猪小肠粘膜基质溶解于0.01M盐酸或醋酸，溶解后与1/10体积的0.1M NaOH混合，调pH值至中性； (2 )配制100mg/ml的核黄素原液； (3) 将核黄素与中性SIS混合均匀，核黄素终浓度为0.05%-0.2%; (4) 将混合溶液滴入模具中，用200W白炽灯泡距离模具10-30cm处照射3-5min，溶液即 发生相变，形成凝胶。
【文档编号】A61K47/46GK105963770SQ201610301638
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】曹川 , 朱宁文, 徐金华, 李世荣, 葛良鹏, 刘弓伯, 廖建贵, 姜俊姿, 王量, 刘建兰, 周静, 叶小璐
【申请人】中国人民解放军第三军医大学, 复旦大学附属华山医院