新型生物补片的制备方法
【专利摘要】本发明涉及2种生物补片，即肌腱和小肠浆膜补片的制备方法，提供了一种具备良好的生物力学特性和生物相容性的天然生物补片材料。方法为：获取猪的肌腱和小肠浆膜为原料；脱细胞过程中全程使用包含一种保护肌腱和小肠浆膜支架结构的保护液；采用高静压技术预分离肌腱和小肠浆膜组织内的细胞；采用复合核酸酶方法消化残余细胞核；利用去垢剂脱除松散破碎细胞片；使用保护液进行漂洗。本发明在细胞核脱净的基础上，最大限度的降低了肌腱和小肠浆膜组织内的免疫原性，同时保留了组织的正常胶原纤维的三维结构及排列极性，适用于组织缺损修复、组织材料充填等。因其具有生物纤维材料的特性，还可广泛应用于其他生物医学领域。
【专利说明】
新型生物补片的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于组织工程技术领域，具体为新型的肌腱和小肠浆膜组织补片的制备方法。
【背景技术】
[0002]神经、膀胱、血管、肌腱、腹壁及眼的结膜等组织缺损的修复中最大的难题是修复材料。目前国内外用外科补片的材料绝大部分是合成材料，如聚丙烯补片(PP)和聚酯补片(PE)等。其最大的缺陷是抗感染率低，组织相容性差，及物理刺激引起的无菌炎症和慢性排异引起的后遗症，甚至造成修补的器官发生感染和与周围组织发生粘连。近几年发展的半吸收复合材料，如聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)等，常因降解过快导致失去疗效。而使用合成材料和复合材料可能导致诸多临床并发症，均不是理想的组织修补材料。随着生物材料的出现一一寻找具有良好组织屏障作用和抗感染能力强的低细胞毒性、低抗原性的生物材料应用于临床迫在眉睫。
[0003]肌腱和小肠的浆膜是一种天然的细胞外基质生物材料，主要由1、III型纤维胶原蛋白构成，并具有弹性结缔组织复杂的成分结构，是理想的生物支架材料。另外，小肠的浆膜中还含有多种生长因子，即使经过脱细胞处理后依然保留，这些生长因子在组织的修复和重构中有着重要的促进作用，优于目前临床应用的其它细胞外基质材料和人工聚合物。
[0004]国外已经有多种商品化的小肠脱细胞产品，如Surgisis，Restore等产品；在我国也有相关专利如“脱细胞小肠粘膜下层生物材料”(申请号200810150792.5)和“一种脱细胞生物补片及其制备方法和装置”(申请号201310117569.1)等，这些产品的问题在于脱细胞方法不完善，例如处理方法仅使用低浓度过氧乙酸处理，细胞残留较多，脱细胞效果欠佳，使用中会引发机体的免疫排斥反应;或加用乙醇等进行脱细胞;或应用长时间浸泡;或采用超声、反复冻融、核酸酶进行脱细胞处理，这些处理造成被脱组织结构和蛋白质活性破坏，使得脱细胞肌腱和小肠组织材料内所包含的生长因子不能发挥作用。
[0005]因此针对现有技术的不足，本发明采用高静压技术联合少量的酶和去垢剂脱除细胞核，并全程应用保护液进行保护的方法，提供了两种既降低了组织的免疫原性，又保留了其正常胶原结构的优质生物补片。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种快速、全程使用特殊保护液以及适宜高效的物理联合复合生物酶制备肌腱和小肠浆膜的脱细胞支架以用作生物补片的方法。
[0007]本发明的创新处在于:1、肌腱和小肠浆膜的脱细胞过程中全程使用一种肌腱和小肠浆膜结构的保护液;2、采用高静压技术预分离肌腱和小肠浆膜组织内的细胞;3、采用复合核酸酶方法消化残余细胞核;4、利用去垢剂脱除松散破碎细胞片;5、使用保护液进行漂洗。脱细胞步骤设定合适的温度、时间以及去垢剂、消化酶浓度对肌腱和小肠浆膜组织进行处理。
[0008]保护液的成分为:DMEM细胞培养基粉末5-10g/L、L-组氨酸盐酸盐2.87-3.83g/L、硫酸软骨素25-30g/L、低分子右旋糖酐20-35g/L、羟丙基甲基纤维素2-8g/L、别嘌呤醇0.5-
0.Sg/UHEPES 缓冲液 20-25ml/L、盐酸地塞米松 l-2mg/L、还原型谷胱苷肽 1.5-3g/L 以及左氧氟沙星0.1-0.2g/L。
[0009]调节保护液的ph值为7.2-8.0，渗透压为300-400m0sm/kgH20。
[0010]高静压压力条件为200-400MP，高静压频率为2_5次，每次为1_2分钟。
[0011 ] DNA酶的浓度为100-10000U/ml，核酸酶的浓度为100-10000U/ml ANA酶或核酸酶的脱细胞核时间为1-4小时，处理温度为15-30度。
[0012]去垢剂条件浓度为0.5-8%的TritonX-100，去垢剂使用时间为1-4小时。
[0013]可选择性的同时或分开进行酶和去垢剂的处理。
[0014]在保护液中漂洗0.5-4小时。
[0015]将制备的肌腱和小肠浆膜补片贴附在硝酸纤维素膜上，放入无水氯化钙分子筛内脱水，经装袋密封并标记，后经钴60照射灭菌，以4°C保存备用；
[0016]在临床使用前将保存的肌腱和小肠浆膜补片放入4000U的妥布霉素生理盐水溶液浸泡1分钟。
【附图说明】
[0017]图1为小肠的结构说明图，最下层为本发明所采用的小肠浆膜
[0018]图2为正常兔小肠的切片HE染色，最上层为浆膜层
[0019]图3为兔小肠浆膜脱细胞切片DAPI染色
[0020]图4为正常猪肌腱切片HE染色
[0021]图5为脱细胞猪肌腱切片HE染色
【具体实施方式】
[0022]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，这些实施例只用于进一步详述说明本发明，不能理解为对本发明保护范围的限定，在本发明保护范围之内做出非本质的调整需本发明方授权。
[0023]为说明采用本发明获得的脱细胞肌腱和小肠浆膜补片的安全和有效性，以下的实施例，在除去对照组条件外，均全部采用下述的条件、步骤与具体实施方案。
[0024]本发明的实施例1
[0025]肌腱和小肠浆膜补片脱细胞保护液的配制:
[0026]1、取DMEM粉末8g加入去离子水500ml，溶解后高压灭菌；
[0027]2、取硫酸软骨素30g加入去离子水275ml加热溶解高压灭菌，制成硫酸软骨素溶液;低分子右旋糖苷35g加入注射用水10ml溶解高压灭菌，制成低分子右旋糖苷溶液;L-组氨酸盐酸盐3.83g，加入注射用水100ml溶解高压灭菌，制成L-组氨酸盐酸盐溶液；
[0028]3、取无菌容器加入DMEM培养液500ml，高压灭菌硫酸软骨素275ml，低分子右旋糖酐溶液100ml，L-组氨酸盐酸盐溶液100ml，Ifepes缓冲液25ml;加入别嘌呤醇0.5g，羟丙基甲基纤维素6g，还原型谷胱苷肽1.5g，地塞米松注射液1.8mg，左氧氟沙星注射液0.1g混勾；
[0029]4、调节PH 值至 7.4，渗透压为 350m0sm/kgH20
[0030]本发明的实施例2
[0031]脱细胞猪肌腱补片的制备。
[0032]1、取新鲜(宰后3小时内取得)猪大腿肌腱组织，必须保证肌腱外膜完整。将肌腱腱膜切开做出I X 3cm的肌腱组织片，密封在盛有保护液的塑料袋中；
[0033]2、于400MP高静压条件下，处理4次，每次时间为2分钟；
[0034]3、将肌腱取出后，置于含2%TritonX-100+600U/ml DNA酶的保护液中，温度为250C，设定摇床速度为100转/分钟，处理2小时；
[0035]4、去垢剂与酶处理完毕后，取出脱细胞肌腱置于保护液中漂洗2小时；
[0036]5、制备的脱细胞肌腱贴附在硝酸纤维素模上，放入无水氯化钙分子筛内脱水，经装袋密封并标记，后经钴60照射，制备成用于脱细胞肌腱材料，以4°C保存备用；
[0037]6、在临床使用前将保存的脱细胞肌腱放入4000U的妥布霉素生理盐水溶液浸泡10分钟。
[0038]本发明的实施例3
[0039]脱细胞猪小肠浆膜补片的制备。
[0040]1、取新鲜(宰后3小时内取得)猪小肠(包括空肠和回肠)组织用水冲洗干净，切成5cm段;钝性刮除小肠粘膜、粘膜下层和肌层，仅留下纤维浆膜层，用PBS漂洗干净;将小肠纤维浆膜层组织制为I X 3cm的组织片，密封在盛有上述保护液的塑料袋中；
[0041 ] 2、于300MP高静压条件下，处理4次，每次时间为I分钟；
[0042]3、将小肠片取出后，置于含1.5%TritonX-100+500U/ml DNA酶的保护液中，温度为25°C，设定摇床速度为100转/分钟，处理I小时；
[0043]4、去垢剂与酶处理完毕后，取出脱细胞小肠纤维浆膜置于保护液中漂洗2小时；
[0044]5、制备的脱细胞小肠浆膜片贴附在硝酸纤维素膜上，放入无水氯化钙分子筛内脱水，经装袋密封并标记，后经钴60照射，制备成脱细胞小肠浆膜补片材料，以4°C保存备用；
[0045]6、在临床使用前将保存的脱细胞小肠纤维浆膜放入4000U的妥布霉素生理盐水溶液浸泡1分钟。
[0046]本发明的实施例4
[0047]脱细胞肌腱和小肠浆膜补片的结构观察
[0048]将实施例2和实施例3制备的脱细胞肌腱和小肠浆膜补片的组织结构带行染色后，对两组标本给予石蜡包埋，切片(5μπι)、ΗΕ染色观察。观察细胞核成分(苏木素染色)，胶原排列形态(伊红染色)，与正常肌腱和小肠浆膜作比较。快速冷冻切片，常规苏木素-伊红(HE)染色和二脒基苯基吲哚(DAPI) (Invitrogen，美国)荧光染色，检测脱细胞程度。结果:脱细胞肌腱和小肠浆膜的组织切片中无完整的细胞及DAPI阳性染色的细胞。
[0049]本发明的实施例5
[0050]脱细胞肌腱和小肠浆膜补片的免疫原性检测
[0051 ]对实施例2和实施例3制备的脱细胞肌腱和小肠浆膜补片与未处理的肌腱和小肠浆膜组织片作比较，进行新西兰大白兔皮下包埋实验，以检测其是否可引起动物免疫原性反应，分别于植入后第I和第4周后取样，将其制作成组织学切片进行观察，结果表明脱细胞肌腱和小肠浆膜补片不引起明显的免疫原性反应，切片观察可见脱细胞的两种组织周围无明显的炎症及淋巴细胞，有少许纤维母细胞。而未脱细胞肌腱和小肠浆膜组织片，术后I周包埋处充血肿胀，4周出现包块，组织病理见大量纤维包裹肌腱和小肠浆膜，有大量的炎症及淋巴细胞，并发生肌腱和小肠浆膜溶解改变。
[0052]本发明的实施例5
[0053]PCR检测脱细胞肌腱和小肠浆膜补片的DNA残留情况
[0054]用PCR的方法对实施例2和实施例3制备的脱细胞肌腱和小肠浆膜补片的DNA残留情况进行检测并和未处理的组织片检测结果比较。结果表明未处理的肌腱和小肠浆膜组织中均检测到DNA残留；而从所制备的脱细胞肌腱和小肠浆膜中未检测到DNA残留，证明本发明的脱细胞肌腱或韧带的制备方法能彻底脱除细胞残留成分。
[0055]本发明的实施例6
[0056]猪脱细胞肌腱和小肠浆膜补片的生物力学检测
[0057]取10条脱细胞肌腱和小肠浆膜纵向IX3cm的条带补片，作为生物力学检测样本，取相同部位、相同大小的10条新鲜猪大腿肌腱和小肠浆膜作为比较。使用生物力学仪检测生物力学性能，持续牵拉，测试样本中间断裂为准。其中I个脱细胞肌腱在钳夹端断裂，不纳入比较。使用独立样本t-检验分析脱细胞对生物力学的影响。结果见弹性模量、最大位移、最大载荷均没有统计学差异，说明脱细胞前后肌腱和小肠浆膜生物力学无明显改变。
[0058]本发明的实施例7
[0059]猪脱细胞小肠浆膜补片的功能检测
[0060]新西兰大白兔结膜缺损实验模型，A、新西兰大白兔结膜缺损模型组，即剪去兔1/4睑和球结膜，2周后出现缺损的眼球表面糜烂。B、新西兰大白兔结膜缺损，羊膜移植组实验模型组，即剪去兔1/4睑和球结膜后，同时在结膜缺损面行羊膜移植覆盖创面，2周后出现羊膜组的羊膜组织已开始溶解，而破损组并未有新的结膜组织长出，创面暴露。C、新西兰大白兔结膜缺损、脱细胞小肠浆膜补片移植组实验模型，即剪去兔1/4睑和球结膜后，同时在结膜缺损面行脱小肠浆膜移植覆盖创面，2周后移植的脱细胞浆膜补片在位，创面修复。
[0061 ]本发明的实施例8
[0062]猪脱细胞肌腱补片的功能检测
[0063]新西兰大白兔腹壁缺损实验模型，A、新西兰大白兔腹壁缺损模型组，即切除3cmX3cm兔腹壁的纤维膜和相对应的腹肌，仅保留表层皮肤，2周后出现缺损的腹壁膨出。B、新西兰大白兔腹壁缺损模型组，即切除3cmX3cm兔腹壁的纤维膜和相对应的腹肌，仅保留表层皮肤，同时应用与腹壁缺失大小相同的脱细胞的肌腱补片进行修补，2周后移植脱细胞肌腱补片的部位未见腹壁膨出，创面修复良好。
[0064]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种脱细胞肌腱和小肠浆膜组织作为新型生物补片的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)取猪的肌腱，清除肌腱表面的外膜和滑膜组织；取猪的空肠和回肠用水冲洗干净，钝性刮除小肠粘膜、粘膜下层和肌层，仅留下浆膜纤维层，用PBS漂洗干净； (2)肌腱和小肠浆膜纤维层脱细胞过程中全程使用一种保护肌腱和小肠浆膜结构的保护液； (3)采用高静压技术预分离肌腱和小肠浆膜组织内的细胞，通过物理的方法将肌腱和小肠浆膜结构内的细胞松解和破碎； (4)采用复合核酸酶方法消化残余细胞核； (5)利用去垢剂脱除松散破碎细胞片； (6)用保护液对肌腱和小肠浆膜进行漂洗。2.如权利要求1所述的制备方法，获取的成年猪肌腱和小肠浆膜，经处理清洗，制为I?3cm X 3?5cm大小的补片备用。3.如权利要求1所述的制备方法，其中所述混合保护液的成分为:DMEM细胞培养基粉末5-10g/L、L-组氨酸盐酸盐2.87-3.83g/L、硫酸软骨素25_30g/L、低分子右旋糖酐20_35g/L、羟丙基甲基纤维素2-8g/L、别嘌呤醇0.5-0.8g/L、HEPES缓冲液20-25ml/L、盐酸地塞米松l-2mg/L、还原型谷胱苷肽l.5-3g/L以及左氧氟沙星0.1-0.2g/L。4.如权利要求1所述的制备方法，其中所述混合保护液的ph值为7.2-8.0，渗透压为300-400m0sm/kgH20。5.如权利要求1所述的制备方法，高静压技术所采用的条件为200-400MPa，高静压频率为2-5次，每次为I?2分钟。6.如权利要求1所述的制备方法，其中所述复合核酸酶，DNA酶的浓度为100-2000U/ml，核酸酶的浓度为100-2000U/ml，DNA酶或核酸酶的脱细胞核时间为1-4小时，处理温度为15-30摄氏度。7.如权利要求1所述的制备方法，其中所述去垢剂TritonX-100的浓度为0.5_8%，去垢剂使用时间为1-4小时。8.如权利要求1所述的制备方法，于肌腱和小肠浆膜的保护液中漂洗的时间为0.5?4小时。9.如权利要求1所述的制备方法，制备完成的肌腱和小肠浆膜补片需贴附在硝酸纤维素膜上，放入无水氯化钙分子筛内脱水，再装袋密封并标记后经钴60照射灭菌，以4°C保存备用。10.在临床使用前将保存的肌腱和小肠浆膜补片放入4000u的妥布霉素生理盐水溶液浸泡1分钟。
【文档编号】A61L27/50GK105963787SQ201610511579
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】史真, 史伟云
【申请人】拜欧迪赛尔（北京）生物科技有限公司