从cho细胞培养物中制备抗体用于偶联的制作方法

从cho细胞培养物中制备抗体用于偶联的制作方法
【专利摘要】本发明部分基于以下观察，即CHO细胞氧化酶，尤其是QSOX1可在看似严苛的抗体纯化过程中留存以随后降低抗体与药物的偶联效率。氧化酶是否在纯化过程中留存取决于采用哪些纯化技术，这可在抗体之间不同。已知CHO细胞氧化酶的污染是后续偶联的潜在问题，可针对任意抗体设计将CHO氧化酶消除或至少减少至可接受水平的合适的纯化方案。
【专利说明】从CHO细胞培养物中制备抗体用于偶联
[00011 本申请要求2013年11月25日提交的美国临时申请号61/908，568的权益，该申请通 过引用全文纳入本文用于所有目的。
[0002] 序列表
[0003] 名称为3100-001 llPC-ST25.txt的IlKB的序列表于2014年11月21日生成，其通过 引用纳入本文。
[0004] 背景
[0005] 在数百次临床试验之后，迄今为止大约30种单克隆抗体已经被Π)Α批准用于治疗 多种病症，包括癌症、自身免疫疾病和感染因子。更多抗体尚未被批准的一个原因是抗体单 独提供的作用机制，如效应物功能或阻断受体-配体相互作用可能不够有力以具有充分的 治疗效果。抗体-药物偶联物(ADC)提供了其它机制，尤其是向细胞内部递送与抗体偶联的 毒性部分，从而杀死细胞或者抑制其增殖。现有2种ADC在售:布妥昔单抗和曲妥珠单抗。许 多其它ADC处于研发的不同阶段。ADC的产生包括抗体表达和纯化，之后是通常通过接头将 抗体化学偶联至药物。
【附图说明】
[0006] 图1:氧化性杂质对载药量的影响。在所示时间处，样品被还原并偶联。偶联水平随 着时间降低的趋势表明存在氧化性杂质。
[0007] 图2a-2c: SEC分离后组分中抗体制备物(批号DEVNKB-I)中的氧化活性（图2a)。用 抗-ALR(肝再生的活化剂）和抗-QSOXl抗体染色的SEC组分的Western印迹(分别是图2b和 2c) 〇
[0008] 图3a-c:抗体制备物(批号DEVNKB-I)在Poros蛋白A柱上的分级分离（图3a);各组 分中的氧化活性（图3b);和显示汇集的组分3和4的蛋白质内容物的SDS-PAGE凝胶图像（图 3c)。箭头指示与70kDa QSOXl和76kDa QS0X2-致的分子量。
[0009] 定义
[0010] 分离的抗体或ADC对于生产或纯化过程中产生的干扰蛋白和其他污染物通常是至 少50%w/w纯的，但不排除单克隆抗体与过量的药学上可接受的运载体或旨在促进其使用 的其他载剂混合。有时，单克隆抗体或ADC对于生产或纯化过程中产生的干扰蛋白和污染物 是至少60 %、70 %、80 %、90 %、95或99 % w/w纯的。
[0011]单克隆抗体单独或作为ADC的组分与其目标抗原的特异性结合指亲和力为至少 106、107、108、109或1011 1。特异性结合在幅度上可检测地高于与至少一个不相关靶标之间 的非特异性结合并可与之区分。特异性结合可以是特定空间拟合(如锁和钥匙类型)或特定 官能团之间键形成的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合并不 必然表示单克隆抗体结合一个且仅结合一个靶标。
[0012]基础抗体结构是亚基的四聚体。各四聚体由两对多肽链构成，各对有一条"轻链" (约25kDa)和一条"重链"（约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包含约100-110或更多氨基酸 的可变区，主要负责抗原识别。该可变区初始表达连接至可切割信号肽。不含信号肽的可变 区有时称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区是不含轻链信号肽的轻链可变区。各 链的羧基端部分界定恒定区。重链恒定区主要负责效应物功能。
[0013] 轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，并确定了抗体的同种型，分别为 IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的 "J"区连接，重链也包括约10个或更多个氨基酸的"D"区。（通常参见，《基础免疫学》 (Fundamental Immunology) (Paul，W.编，第2版，纽约拉文出版社（Raven Press，Ν· Υ.)， 1989，第7章，通过引用全文纳入本文以用于所有目的）。
[0014] 各轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体有两个结合位 点。除了双功能或双特异性抗体的情况之外，这2个结合位点是相同的。链均显示由三个高 变区接合的相对保守框架区(FR)的相同通用结构，所述高变区也称为互补决定区或CDR。来 自各对的两条链的CDR通过框架区比对，能结合特定表位。从N-端到C-端，重链和轻链都包 含结构域?1?1、0)1?1^1?2、001?2、？1?、0)1?和?1?4。各结构域氨基酸的分配与1( &&&丨，《免疫学感 兴趣蛋白的序列》（Sequences of Proteins of Immunological Interest)(马里兰州贝塞 斯达的国立卫生研究院（National Institutes of Health)(1987和1991))或Chothia和 Lesk J.Mol.Biol .196:901-917( 1987);Chothia等，Nature 342:878-883( 1989)的定义一 致。Kabat还提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号），其中为不同重链之间或不同轻链之 间相应的残基分配了相同的编号。
[0015] 术语"抗体"包括完整抗体及其结合片段。一般而言，抗体片段与衍生它们的完整 抗体竞争以特异性结合靶标，包括分开的重链，轻链Fab、FaV、F(al/ )2、F(ab) c、双抗体、 Dab、纳米抗体和Fv。可通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离来产生 片段。术语"抗体"也包括双抗体(同二聚体Fv片段)或小抗体(Vl-V h-Ch3)、双特异性抗体等。 双特异性或双功能抗体是具有2个不同重链/轻链对和2个不同结合位点的人工杂交抗体 (参见，例如，Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp. Tmmunol . ,79:315-321(1990) ；KosteIny 等，J. Immunol·，148:1547-53(1992))。术语"抗体"包括抗体本身(裸抗体)或与细胞毒性药 物或细胞生长抑制性药物偶联的抗体。
[0016] 术语"表位"是指抗原上抗体与之结合的位点。表位能够由连续的氨基酸来形成或 由于一个或多个蛋白三级折叠而并列的不连续的氨基酸来形成。当接触变性溶剂时，由连 续氨基酸形成的表位通常保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。 表位通常包含在独特空间构象中的至少3个或更常见的至少5个或8-10个氨基酸。确定表位 空间构象的方法包括，例如X-射线晶体法和二维核磁共振。参见，例如《表位作图方案》，刊 于《分子生物学方法》（Epitope Mapping Protocols，in Methods in Molecular Biology)，卷66，Glenn E.Morris编（1996)。
[0017] 可以在简单的免疫实验中鉴定识别相同表位或重叠的抗体，显示一种抗体与另一 种抗体竞争结合目标抗原的能力。也可通过对与抗原结合的抗体进行X射线结晶以鉴定接 触残基，从而定义抗体的表位。或者，如果抗原中导致一个抗体的结合能力减弱或消失的 所有氨基酸突变导致另一个抗体的结合能力减弱或消失，则说明这两个抗体拥有相同的表 位。如果一些导致一个抗体的结合能力减弱或消失的氨基酸突变导致另一个抗体的结合能 力减弱或消失，则说明这两个抗体拥有重叠的表位。
[0018] 可通过试验确定抗体之间的竞争，其中一个受测试的抗体抑制了参考抗体与共同 抗原的特异性结合(参见例如Junghans等，Cancer Res.50:1495,1990)。如果在竞争性结合 试验中，过量的测试抗体(例如至少2x、5x、IOx、20x或IOOx)抑制了参考抗体至少50 % (优选 75%、90%或99%)的结合，则说明测试抗体与参考抗体之间产生竞争。竞争试验鉴定到的 抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合同一表位的抗体和所结合的表位与参考抗体结合的 表位距离足够靠近而产生位阻的抗体。
[0019] 术语"患者"包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物对象。
[0020] 出于将氨基酸取代分类为保守性或非保守性的目的，氨基酸分类如下：组1(疏水 性侧链）:11161：、313、￥31、1611、；[16;组11(中性亲水性侧链）：05^、861'、1：111';组111(酸性侧链）： 38口、8111 ;组1￥(碱性侧链）阳11、8111、11丨8、178、3坪;组￥(影响链取向的残基）：817、口1'0 ;以及 组VI(芳族侧链）：丨印、丨7^?1^。保守性取代包括相同类别的氨基酸之间的取代。非保守取 代指将一种类型的成员更换为另一种类型的成员。
[0021] 通过Kabat编号惯例对抗体序列进行最大程度的比对以确定序列相同性百分比。 比对后，如果比较的是对象抗体区域(如重链或轻链的整个成熟可变区）与参考抗体的相同 区域，则对象和参考抗体区域之间的序列相同性百分比为对象和参考抗体区域中被相同氨 基酸所占据的位置数目除以两个区域经排列位置的总数，不计算缺口，乘以100以转化为百 分数。
[0022] "包含"一种或多种所列元素的组合物或方法可包含未特别列出的其他元素。例 如，包含抗体的组合物可含有单独的抗体或与其他成分联用。
[0023] 数值范围的指定包括范围内或限定该范围的所有整数。
[0024] 抗体效应物功能（effector function)指由Ig的Fc结构域所贡献的功能。这类功 能可以是例如抗体依赖的细胞毒性、抗体依赖的细胞吞噬作用或补体依赖的细胞毒性。发 挥这类功能的方式可以是例如Fc效应结构域与带有吞噬或裂解活性的免疫细胞上的Fc受 体结合，或Fc效应结构域与补体系统的组分结合。通常，由Fc结合细胞或补体组分介导的作 用导致靶向的细胞的抑制和/或消耗。抗体的Fc区可招募表达Fc受体(FcR)的细胞并使其与 抗体包被的目标细胞并列。表达IgG的表面FcR的细胞包括Fc γ RIII (CD16)、Fc γ RII (CD32) 和Fe γ RI(CD64)，其能够作为效应细胞破坏IgG包被的细胞。这类效应细胞包括单核细胞、 巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞活性、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。Fc γ R通过IgG的参与激 活了抗体依赖的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP) JDCC由CD16+效应细 胞通过分泌膜孔形成蛋白和蛋白酶介导，而吞噬作用由CD32+和CD64+效应细胞介导（参见 Fundamental Immunology (《基础免疫学》），第4版，Paul编，林普科特瑞文出版社 (Lippincott-Raven)，纽约，1997，第3、17和30章；Uchida等，2004，J.Exp.Med· 199:1659-69 ; Akewan Iop等，2001，Cancer Re s.61:4061-65 ; Watanabe等，1999, Br east Cancer Res. Treat. 53:199-207)。除ADCC和ADCP外，细胞结合抗体的Fe区也可以激活补体经典通路 以引发补体依赖的细胞毒性(CDC)。当补体系统的Clq与抗原形成复合物时，其结合抗体的 Fc区。Clq与细胞结合抗体的结合能够起始涉及C4和C2蛋白水解激活的多个事件以生成C3 转化酶。由C3转化酶将C3切割为C3b的过程激活了包括C5b、C6、C7、C8和C9的终端补体组分。 总体来说，这些蛋白质在抗体包被的细胞上形成了膜攻击复合物孔。这些孔破坏了细胞膜 的完整性，从而杀死目标细胞(参见《免疫学》（Immunobiology)，第6版，Janeway等，加兰德 科学出版社(Garland Science)，纽约，2005,第2章）。
[0025]术语"抗体依赖的细胞毒性"或ADCC指一种诱导细胞死亡的机制，该机制依赖抗体 包被的目标细胞与带有裂解活性的免疫细胞(也称为效应物细胞)之间的相互作用。这类效 应物细胞包括自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞。效应物细胞通过其抗原 结合位点与结合在目标细胞上的Ig的Fc效应结构域连接。抗体包被的目标细胞的死亡是效 应物细胞活性的结果。
[0026]术语"抗体依赖的细胞吞噬作用"或ADCP指由与Ig的Fc效应结构域结合的吞噬免 疫细胞（如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)将抗体包被的细胞全部或部分内化的过 程。
[0027] 术语"补体依赖的细胞毒性"或CDC指一种诱导细胞死亡的机制，其中结合目标的 抗体的Fc效应结构域激活了一系列酶促反应，最终使得目标细胞的细胞膜上出现穿孔。通 常，抗原-抗体复合物(如在抗体包被的目标细胞上的复合物)结合并激活补体组分Clq，Clq 转而激活补体级联反应导致目标细胞死亡。补体的激活还会导致补体组分在目标细胞表面 的沉积，通过结合白细胞上的补体受体(如CR3)促进ADCC。
[0028] "细胞毒性作用"指靶标细胞的缺失、消除和/或死亡。"细胞毒剂"指对细胞有细胞 毒性效果的试剂。细胞毒剂可与抗体偶联或与抗体共同给予。
[0029] "细胞生长抑制作用"指细胞增殖的抑制。"细胞生长抑制剂"指对细胞具有细胞生 长抑制效果，从而抑制细胞的特定子集生长和/或扩增的试剂。细胞生长抑制剂可与抗体偶 联或与抗体共同给予。
[0030] 术语"药学上可接受的"指被联邦或州政府管理机构批准或可被批准，或美国药典 或其它通常接受的药典所列的用于动物，更具体是用于人的。术语"药学上相容的成分"指 与抗体或ADC共同配制的药学上可接受的稀释剂、辅料、赋形剂或载剂。
[0031] 短语"药学上可接受的盐"指抗体或其偶联物或与抗体共同给药试剂的药学上可 接受的有机或无机盐。示例性盐包括:硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、 碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸 盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙 胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸 盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐（即1，Γ -亚甲基-双_(2-羟基3-萘甲酸 盐））盐。药学上可接受的盐可以包含例如乙酸根离子、琥珀酸根离子、或其他抗衡离子的另 一个分子。该抗衡离子可以是稳定母体化合物上电荷的任何有机或无机部分。另外，药学上 可接受的盐可在结构中具有超过一个的带电原子。其中多个带电原子是药学上可接受的盐 的一部分的示例能有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子 和/或一个或多个抗衡离子。
[0032] CHO细胞是指中华仓鼠卵巢细胞并且包括各种品系，包括，例如，DG44、Dxb11、CHO- K、CHO-K ^CHO-S0
[0033]短语"载药量"或"偶联率"是指ADC溶液或组合物或反应混合物中每个抗体的平均 药物数量。
[0034]除非本文中另有明确说明，术语"约"包括所述值的标准偏差内的值。
[0035] 发明详述
[0036] I ·概述
[0037] 本发明部分基于以下观察：CHO细胞氧化酶，尤其是quiescin Q6巯基氧化酶I (QSOXl)可在看似严苛的抗体纯化过程中留存，并以足够降低抗体与药物的后续偶联加载 效率的量存在于抗体制备物中。虽然纯化过程似乎产生具有对于抗体可接受的低比例的背 景污染物/杂质的抗体，可能仍然存在足量的氧化酶以导致抗体上的巯基在抗体还原之后 被氧化，由此不可供于偶联至药物。虽然，本发明的实践并不依赖于对机制的理解，QSOXl在 纯化的抗体产品中的持续存在可能由一些纯化条件下抗体与QSOXl之间的相互作用导致。 氧化酶是否在纯化过程中留存取决于采用哪些纯化技术，这可在抗体之间不同。在鉴定具 有小但显著的量的CHO细胞氧化酶的看似纯的抗体制备物的存在的可能性之前，弱的偶联 加载效率（由不足的药物与抗体平均比所反映）可能已经被错误地归因于多种原因中的任 一种。然而，已知CHO细胞氧化酶的污染是后续偶联的潜在问题，可针对任意抗体设计将CHO 氧化酶消除或至少减少至可接受水平的合适的纯化方案。
[0038] II. CHO细胞氧化酶
[0039] QSOXl是人QSOXl ,Swiss-Prot 000391的中华仓鼠同源物。该酶催化巯基氧化成二 硫键，同时还原氧。述及QSOXl是指全长QSOXl酶(带或不带信号肽)及其任意片段，包括其天 然产生的变体，无论是由CHO细胞天然释放或因抗体纯化过程而释放均保留巯基氧化能力。 CHO细胞培养基中的QSOXl产生表观大小范围65-75kDa，或更具体地68-72kDa的条带。示例 性的QSQXl片段可包括胞外结构域、硫氧还蛋白结构域和/或ERV/ALR疏基氧化酶结构域。预 测的QSOXl同种型Xl蛋白质序列先前已被鉴定为SEQ ID NO: 1并具有GenBank登录号XP_ 003500174.1。从此即已更新了QXOXl预测的同种型Xl蛋白质序列。更新的序列示于SEQ ID N0:2并且具有GenBank登录号XP_007639037.1。在一些方面中，QS0Xl是指与SEQIDN0 :2具 有 90% 或更高（91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列相同性 并且保留巯基氧化能力的CHO细胞氧化酶。在一些方面中，QSOXl是指包括以下氨基酸序列 并保留巯基氧化能力的CHO细胞氧化酶:SEQ ID NO:2的第94个氨基酸至第571个氨基酸。
[0040] 可以杂质存在的其它CHO细胞酶包括QS0X2(人Swiss-Prot Q6ZRP7的CHO同源物） 和ALR(肝再生的活化物)巯基氧化酶。简言之，以下说明主要是指QS0X1，但是应理解为替代 性或另外指代QS0X2、ALR或经纯化留存下来的其它CHO细胞氧化酶。
[00411 III.去除QSOXl和其它CHO细胞氧化酶的纯化方法
[0042]本申请提供了可用于鉴定并去除QSOXl和其它CHO细胞氧化酶如QS0X2或ALR的几 种技术(详细内容参见实施例）。一种技术是将抗体制备物加载到蛋白A柱上，并且在中等或 高盐条件下（例如，至少150mMNaCl，或150-500mM NaCl)洗涤。QSOXl从柱中洗脱，而抗体保 持结合。另一种技术是使用例如Millipore XOHC膜的深度过滤。抗体通过滤器，而QSOXl被 滤器捕获。另一种技术是阴离子交换色谱，优选使用带季铵基团的强阴离子交换剂。GE医疗 公司的Capto-Q柱是合适的。在合适的条件下（例如，约8的pH和约5-7mS/cm的电导率），抗体 流过柱而QSOXl保持结合。另一种技术是苯基-膜过滤。这种类型的膜基于疏水性相互作用 分离。在合适条件下(例如，pH 6-8和柠檬酸钠0.35-0.4M)，抗体通过并且QSOXl结合至膜。 [0043] IV.去除测试
[0044]可通过多种试验来检测QSOXl，如实施例中进一步详述，包括使用对QSOXl具有特 异性的抗体的Western印迹。也可通过对从凝胶上切下的合适分子量（约65-70kDa，取决于 糖基化状态）的条带进行肽序列分析或LC-MS/MS来检测QSOXl。也可通过功能试验来检测 QS0XUQS0X1活性生成过氧化氢，其转而通过在二甲酚橙存在下Fe2+氧化导致的简单颜色 变化而被检测到。QSOXl的特征性功能活性被Zn2+(例如，至少90%)而不是EDTA和许多其 它盐(KI、MnS04、NaCl)或尿素特异性抑制。如实施例2所证明，也可通过DTNB试验来检测 QSOXl0
[0045] 如果在下文所述的任何试验或实施例中可在阴性对照水平以上检测到(超过实验 误差），则认为QSOXl存在。在一些方面中，低至lug/ml或66ppm的QSOXl水平可抑制抗体药物 加载效率。因此，在一些方面中，可接受的水平可表示低于〇.5ug/ml或33ppm，并且优选低于 0.1ug/ml或6ppm，或低于0.01ug/ml或0.6ppm。优选地，QSOXl的水平在阴性对照水平内，如 实施例中所述的任意试验模式所确定。
[0046] 或者或另外，QS0X1的可接受水平可定义为等于或低于可得到药物对抗体的可接 受偶联率的水平。合适的偶联率优选在目标偶联率的90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %或99 %以内。可影响偶联率并且可被控制以实现目标偶联率的参数包括， 例如，抗体的还原条件(例如，还原剂类型和相对于抗体浓度的浓度）、药物接头相对于抗体 的浓度、偶联反应时间和偶联反应温度。优选地，QS0X1的水平使得其在抗体还原反应期间 不阻止达到正确的还原程度和/或其在还原后但在偶联之前不立即重新氧化已经还原的巯 基。换言之，优选地，QS0X1的水平使其不干扰抗体的还原或经还原的抗体的稳定性。
[0047]或者或另外，可接受水平的QS0X1可被定义为在DTNB试验或亚铁氧化二甲酚橙试 验中产生0.1或更低吸光度单位的水平。简言之，DTNB试验是这样一种试验，其中测量并比 较了对照样品和测试样品中游离巯基之间的反应。例如参见实施例2。在亚铁氧化二甲酚橙 试验中，测量过氧化氢作为活性指标。例如参见实施例1。
[0048] V ·工作流方案
[0049]用编码待表达的抗体的链的载体转化CHO细胞并经培养以表达该抗体。表达通常 初始在较小培养物体积(例如，1-50L)上进行，目的在于提供足够的抗体来确定纯化方案。 然后，含表达的抗体的培养基经历抗体纯化方案的至少一个步骤以获得适于化学偶联或药 物应用的纯度水平(例如，相对大分子污染物/杂质的至少90、95、97、98或99 % w/w的抗体）。 该纯化方案通常包括至少2个柱色谱步骤、至少一个并且通常多个过滤步骤、病毒灭活步 骤，和浓缩和重悬/稀释步骤。在完成纯化步骤中的任一个或全部之后，可测试抗体制备物 是否存在QS0X1。如果检测到QSOX高阴性对照试验的背景(超过实验误差)或检测到高于被 认为后续偶联不可接受的水平，则用第二(不同）纯化步骤和/或方案重复初始培养基(或另 一种类似培养基，如果初始培养基的量不足）的纯化。第二纯化步骤和/或方案可与第一纯 化步骤和/或方案在纯化类型上(例如，阴离子对阳离子交换色谱，用于过滤的膜类型），或 在用于上样或洗脱的缓冲剂等其它变量上不同。
[0050] 在进行第二纯化步骤/方案之后或期间，可测试所得抗体制备物的QS0X1。如果以 高于背景或高于可接受水平的水平检测到QS0X1，则用含或不含对QS0X1酶的进一步测试的 其它纯化方案进行纯化。无论是在第一纯化方案，还是第二或后续纯化方案之后，最终得到 的抗体制备物中QS0X1不可被检测到在高于背景或被检测到但被认为可接受的水平上。
[0051] 在已经确定能将QS0X1降低至超过检测限或至少降低至可接受的水平的纯化方案 的情况下，进行CHO细胞的第二培养，有时称为生产培养。培养基经历已经确定对纯化抗体 和去除QS0X1有效的纯化步骤/方案。所得的纯化的抗体被还原并随后偶联至试剂，例如，药 物。
[0052]第二或生产培养物一般大于用于确定纯化方案的初步培养物。例如，生产培养物 可以比初步培养物体积大至少100倍或1 〇〇〇倍。一般在至少一年的时间段内（例如，在至少5 年的时间段内）重复(批次培养)或连续进行生产培养，如通过之前确定能够成功纯化不含 QSOXl的抗体的纯化方案来从所述培养纯化抗体。
[0053]在替代的工作流中，来自CHO细胞的培养基经过抗体纯化过程而不必测试QSOXl 酶，并且纯化的制备物经历与药物的化学偶联。如果偶联加载效率(平均药物/抗体)意外地 低（即，药物分子对抗体的数量低于目标），则测试纯化的制备物是否存在QS0X1。如果酶以 高于背景水平或高于被认为可接受的水平存在，则通过不同的纯化方法从CHO细胞培养基 中纯化抗体，之后测试QSOXl酶。然后，如果必要，则将通过不同的方法纯化，之后测试QSOXl 反复进行直至发现一种纯化方法，其同时从一般污染物/杂质中纯化抗体以得到可接受的 纯度并且将QSOXl去除至背景水平或被认为偶联可接受的水平。当找到这种纯化方法时， 其可用于从CHO细胞的第二培养物中制备抗体。然后，纯化的抗体通过一个或多个游离巯基 偶联至药物。
[0054] VI.抗体与药物的偶联
[0055] 抗体可与细胞毒性或细胞生长抑制性部分(包括其药学上可兼容的盐)偶联以形 成抗体药物偶联物(ADC)。抗体可偶联至除药物以外的试剂，例如，稳定剂(例如，PEG部分）。 特别适用于与抗体偶联的部分是细胞毒剂(如化疗药）、前药转化酶、放射性同位素或化合 物或者毒素(这些部分统称为药物）。例如，抗体可与细胞毒剂(如化疗药)或毒素(如细胞生 长抑制剂或杀细胞剂，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉类毒素）偶 联。
[0056] 出于本发明的目的，药物通过抗体上的巯基偶联至所述抗体。该巯基可以是半胱 氨酸侧链上的巯基。半胱氨酸残基可天然存在于抗体中（例如，链间二硫键)或通过其它方 式引入，例如，诱变。将药物偶联至抗体上的巯基的方法是本领域所熟知的（参见，例如，美 国专利号7，659，241、7，498，298、和国际公开号WO 2011/130613)。抗体在偶联之前经还原 以赋予可用于偶联的巯基。可使用本领域已知的条件还原抗体。还原条件是通常不引起任 何抗体的实质变性和通常不影响抗体的抗原结合亲和性的那些条件。一方面，用于还原步 骤的所述还原剂是TCEP(三(2-羧基乙基)膦)并且TCEP在室温下过量加入30分钟。例如，250 yL的IOmM TCEP pH 7.4溶液在室温下30分钟可容易地还原I-IOOyg抗体的链间二硫化物。 然而，可使用其它还原剂和条件。还原条件的示例包括5-8的pH范围的5°C至37°C的温度。本 发明的发明人已经发现，在由还原剂还原之后由氧化酶如QSOXl将巯基氧化成二硫键能够 使巯基不可用于偶联。
[0057]除非从抗体上切除（例如通过水解、通过抗体降解或通过切割剂），否则药物可通 过降低活性的方式偶联至抗体。这类药物可以通过一段可切割的接头与抗体相连，所述接 头对目标细胞胞内环境的切割敏感但对胞外环境基本不敏感，使得目标细胞内化ADC后对 其进行切割(例如在内体中，或者例如凭借pH敏感性或蛋白酶敏感性、在溶酶体环境中或在 胞膜窖环境中）。
[0058] 一般地，ADC包括药物和抗体之间的接头。如上文所述，该接头在胞内环境下是可 切割的，胞内环境中对接头的切割从抗体上释放出药物（例如在溶酶体或内体或胞膜窖 中）。该接头可以是例如被胞内肽酶或蛋白酶(包括溶酶体或内体蛋白酶)切割的肽酰接头。 一般而言，肽酰接头的长度为至少两个氨基酸或至少三个氨基酸。切割剂可包括组织蛋白 酶B和D和纤溶酶（参见例如Dubowchik和Walker，1999，Pharm. Therapeutics 83:67-123) 〇 最常见的是可由目标细胞内存在的酶切割的肽酰接头。例如，可使用可由癌组织中高表达 的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B切割的肽酰接头(如包含Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly肽 的接头）。其它这类接头描述于，例如，US 6，214，345。可由胞内蛋白酶切割的示例性肽酰接 头是Val-Cit接头或Phe-Lys二肽(参见例如美国专利6,214,345,其描述了具有Val-Cit接 头的多柔比星的合成）。使用胞内蛋白水解释放药物的一个优点是该试剂在偶联时通常减 弱，且偶联物的血清稳定性通常较高。
[0059] 该可切割接头可以是pH敏感型的，即在某些pH值下对水解敏感。通常，pH敏感型接 头可在酸性条件下水解。例如，能使用在溶酶体中可水解的酸不稳定性接头(如腙、缩氨基 脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺(cis-aconitic amide)、原酸酯、缩醛、缩酮等）。（参见例如 美国专利号5,122，368;5,824,805;5,622，929 ; Dubowchik 和Walker，1999， Pharm.Therapeutics 83:67-123!Neville等，1989，Biol.Chem.264:14653-14661)。这类接 头在中性pH条件下（例如在血液中）相对稳定，但在低于pH5.5或5.0的条件(接近溶酶体的 pH)下不稳定。
[0060] 其他接头在还原条件下是可切割的（如二硫化物接头）。二硫化物接头包括可用 3八丁六0-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基硫代乙酸酯）、3?〇?0-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫） 丙酸酯）、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基 羰基-?-甲基-?-(2-吡啶基-二硫）甲苯）、SPDB和SMPT形成的接头。（参见例如Thorpe等， 1987，CancerRes. 47:5924-5931; Wawrzynczak等，刊于《免疫偶联物:放射成像和癌症治疗 中的抗体偶耳关物》（Immunocon jugates : Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer)(C.W.Vogel编，牛津大学出版社(Oxford U.Press)，1987。也参见美国 专利号4,880,935)。
[0061 ]接头也可以是丙二酸接头（Johnson等，1995，Anticancer Res · 15:1387-93)、马来 酰亚胺苯甲酰接头(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1299-1304)或3'-N-酰胺类似物 (Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem · 3(10): 1305-12) 〇
[0062] 该接头还可以是不可切割的接头，例如与药物直接连接并通过抗体的蛋白酶降解 释放的马来酰亚胺-亚烷基或马来酰亚胺-芳基接头。
[0063] 该接头是包含可与抗体上存在的基团反应的官能团的接头。在一些方面中，接头 通过接头的硫原子和抗体的硫原子之间的二硫键连接至抗体。在其他方面中，接头通过接 头的马来酰亚胺基与抗体的硫原子成键。在一些方面中，硫原子来自链间二硫键的半胱氨 酸残基或来自引入抗体的半胱氨酸残基(例如，根据EU索引的239位处）。
[0064]可用于偶联至抗体的细胞毒剂的类别包括，例如，抗微管蛋白剂、DNA小沟结合物、 DNA复制抑制剂、化疗敏化剂、吡咯并苯并二氮杂軍二聚体等。其它示例性的细胞毒剂的类 别包括蒽环类抗生素、澳瑞他汀、喜树碱、多卡米星、依托泊苷、美登醇和长春花生物碱。一 些示例性的细胞毒剂包括澳瑞他汀(例如，澳瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小沟结合物(例 如，烯二炔和偏端霉素）、多卡米星、紫杉烷(例如，紫杉酚和多西紫杉醇）、美登木素、苯并二 氮杂萆（例如，吡咯并[1，4]苯并二氮杂草、吲哚并苯并二氮杂草、和噁唑苯并二氮杂草）、长 春花生物碱、多柔比星、吗啉代-多柔比星、和氰基吗啉代-多柔比星。
[0065] 细胞毒剂可以是化疗剂，例如，多柔比星、紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、氨甲蝶 呤、丝裂霉素 C或依托泊甙。试剂还可以是CC-1065类似物、卡奇霉素、美登素、多拉司他汀10 类似物、根霉素或海葵毒素。
[0066] 细胞毒剂也可以是澳瑞他汀。例如，该澳瑞他汀可以是澳瑞他汀E，例如澳瑞他汀E 和酮酸间形成的酯。例如，澳瑞他汀E可与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰戊酸反应，分别产生AEB 和AEVB。其它澳瑞他汀包括AFP、MMAF和MMAE。各种澳瑞他汀的合成和结构描述于，例如，US 2005-0238649和US2006-0074008。
[0067] 细胞毒剂可以是DNA小沟结合物。（参见例如，美国专利6，130，237)。例如，该小沟 结合物可以是CBI化合物或烯二炔(例如，卡奇霉素）。
[0068] 细胞毒剂或细胞生长抑制剂可以是抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的例子包括：紫 杉烷(例如，Taxol? (紫杉醇）、Taxotere? (多西紫杉醇））、T67 (杜拉瑞克(Tular ik))、长春 花生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨），和澳瑞他汀(例如，澳瑞他汀E、 AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其他合适的抗微管蛋白剂包括，例如浆果赤霉素衍生物、紫杉 烧类似物(如埃博霉素 A和B)、诺考达唑(nocodazole)、秋水仙素和秋水仙胺(colcimid)、雌 氮芥、隐花植物素(cryptophycin)、西马多丁、美登木素、考布他汀、淅皮海绵内酯和艾榴塞 洛素（eleutherobin) 〇
[0069] 细胞毒剂可以是美登木素，另一类抗微管蛋白剂。例如，美登木素可以是美登素或 含药物接头如DM-I或DM-4的美登素（ImmunoGen，Inc ·;也参见Chari等，1992，Cancer Res.52:127-131)〇
[0070] 示例性抗体药物偶联物包括以下的vcMMAE和mcMMAF抗体药物偶联物，其中p代表 载药量并且范围是1-20并且Ab是抗体：
[0071]
[0072]
[0073]
[0074] mcMMAF
[0075]或其药学上可接受的盐。
[0076] VII.抗体纯化方法
[0077]已知大量用于从CHO上清中纯化蛋白质的技术。这些技术包括离心、过滤、沉淀、病 毒灭活和多种类型的柱色谱包括蛋白-A、蛋白-G、蛋白-L、阴离子交换、阳离子交换、混合模 式、羟基磷灰石、尺寸排阻色谱，和目标亲和色谱。色谱步骤通常采用至少2种缓冲剂，一种 用于上样，一种用于洗脱。缓冲剂可改变pH和离子强度等因素。示例性的抗体纯化包括至 少一个过滤步骤、至少一个病毒灭活步骤、蛋白A柱和至少一种其它柱。考虑到不同技术，上 样和洗脱溶液中缓冲剂、PH和其它赋形剂的可能性的数量，不同纯化过程的数量非常大。因 此，通常凭经验确定不同抗体的合适纯化过程以鉴定同时将抗体纯化至药物应用可接受的 水平(一般由抗体对大分子污染物/杂质的比率确定），并且其中QSOXl和/或其它CHO细胞氧 化酶减少至低于可检测水平或至少减少至可接受水平的过程。
[0078] 可使用硫酸铵沉淀法来从血清、腹水或细胞培养物上清中富集并浓缩抗体。随着 样品中这种溶致盐浓度增加，蛋白质和其它大分子逐渐溶解性降低直至它们沉淀。抗体比 血清的大多数其它蛋白质和组分在更低的硫酸铵浓度下沉淀。沉淀的选择性、产率、纯度和 重复性取决于多个因素，包括时间、温度、PH和盐含量。
[0079] 也可使用酸性或阳离子聚电解质来使抗体的细胞污染物絮凝。聚电解质通常通过 吸附至颗粒以在表面上产生相反电荷斑片来发挥作用。由于静电吸引，该带然后可粘附于 相反颗粒表面上的裸斑片。
[0080] 在细胞培养液的澄清中可使用深度滤器，以维持膜滤器上的容量或保护色谱柱或 病毒滤器。深度滤器一般由纤维素、多孔过滤助剂如硅藻土和离子带电树脂粘合剂制成。深 度滤器可同时采用尺寸排阻和吸附结合来实现分离效果。
[0081] 膜色谱或膜吸附剂的功能与填充的色谱柱类似，但是以常规过滤模块的形式。膜 色谱利用微孔膜，通常是含有附连至膜结构中的内孔表面的功能性配体的多层。市售的Q膜 包括 ChromaSorb?(密理博公司（Millipore))、Mustang? (波乐公司（Pall))和.Sartobind? (萨托瑞斯公司（Sartorius))。在中性至弱碱性pH和低电导率下，病毒、DNA、内毒素、大群宿 主细胞蛋白质和浸出的蛋白A结合至Q膜，而一般碱性抗体分子则流过膜基质且不结合。
[0082] 超滤是压力驱动的膜过程，其广泛用于抗体离心和缓冲剂交换。超滤是基于尺寸 的分离法，其中大于膜孔的物质保留而较小的物质自由通过。通过不同组分在给定压力驱 动力下穿过膜的过滤速率的差异来实现超滤分离。使用渗滤模式实现缓冲剂交换，其中最 终所需组合物的缓冲剂以与滤出液排出相同的速率加入滞留液体系统，由此保持恒定的 滞留液体积。用范围为l_20nm的膜孔的超滤可提供分子量为500道尔顿至1000千道尔顿范 围的物质的分离。
[0083] 高效切向流过滤(HPTFF)是二维单元操作，其中同时利用尺寸和电荷差异来纯化 和分离。可在相同的单元操作中完成蛋白质浓缩和缓冲剂交换。
[0084] 可通过在低pH下处理来灭活病毒和/或通过各种方法包括过滤来去除病毒。现有 的病毒滞留滤器是具有非常小的孔的超滤器或微滤器。病毒过滤膜由疏水性聚醚砜(PES)、 聚偏二氟乙烯(PVDF)和再生纤维素制成。
[0085] 离子交换色谱使用带正电或带负电的树脂来基于其在给定缓冲系统中的净电荷 来结合蛋白质。可确定结合并释放具有高度特异性的目标抗体的条件（例如，PH和离子强 度）。相反地，可发现结合除了抗体以外接近全部其它样品组分的条件。阴离子交换色谱使 用带正电的基团，其可以是弱碱性的，如二乙基氨基乙基(DEAE)或二甲基氨基乙基(DMAE)， 或强碱性的，如三甲基氨基乙基(TMAE)或季氨基乙基(QAE)。
[0086] 阳离子交换色谱使用经带负电的官能团修饰的树脂。阳离子和阴离子色谱是互补 技术:与一种分子强烈结合，但与其它分子弱结合。
[0087]阳离子交换柱可以是强酸性配体如磺丙基、磺乙基和磺异丁基或弱酸性配体如羧 基。阳离子交换色谱已经用于许多mAb的纯化过程，其pi值范围是约中性或略低(例如，约6) 至碱性。大多数人源化IgGl和IgG2亚型是阳离子交换色谱的良好候选物，其中抗体在上样 步骤期间结合到树脂上并且通过增加洗脱缓冲剂中的电导率或增加 PH来洗脱。在上样和洗 涤组分中去除与带负电的处理相关的杂质如DNA、一些宿主细胞蛋白质、浸出的蛋白A和内 毒素。阳离子交换色谱也可从所需的抗体中分离脱酰胺产物、氧化的物质和N-末端截短的 形式，以及高分子量物质。抗体在阳离子交换树脂上的结合取决于PH和电导率，以及树脂类 型。SP S印harose FF和SP S印harose XL是2种常用的市售树脂。
[0088]疏水性相互作用色谱(HIC)是基于其疏水性分离蛋白质的有用工具，并且与基于 电荷、尺寸或亲和性分离蛋白质的其它技术互补。样品通常在高盐缓冲剂中加载到HIC柱 上。缓冲剂中的盐与水分子相互作用以降低溶液中蛋白质分子的溶剂化作用，从而暴露样 品蛋白质中的疏水性区域，其随后结合至HIC树脂。分子的疏水性越强，促进结合所需的盐 越少。
[0089] 固定的金属螯合物色谱使用螯合物-固定的二价金属离子(例如，铜、钴或镍)来结 合含有三个或更多连续组氨酸残基的簇的蛋白质或肽。该策略最常用于纯化已经工程改造 以含有末端6xHis融合标签的重组蛋白质。IgG是血清(或单克隆杂交瘤细胞培养物上清）中 丰度最低的蛋白质之一，其具有能够被固定的镍结合的组氨酸簇。结合和洗脱的条件可针 对具体样品优化以提供温和且可靠的抗体纯化。
[0090] 蛋白A、蛋白G和蛋白L，包括其重组变体，是通常用于从多种物质中关键抗体类型 的亲和纯化的示例性蛋白质。蛋白A色谱一般包括在pH 6-8下使澄清的细胞培养物上清通 过柱，在该条件下，抗体结合，并且不需要的组分如宿主细胞蛋白质和细胞培养基组分以及 病毒流过柱。可进行任选的中间洗涤步骤以从柱上去除非特异性结合的杂质，之后在PH 2.5-4下洗脱产物。目前存在三种主要类型的蛋白A树脂，其基于树脂主链组成分类:玻璃或 二氧化娃基，例如，Prosep vA、Prosep vA Ultra(密理博公司）；琼脂糖基，例如，蛋白A Sepharose Fast Flow、MabSelect(GE医疗公司）；和有机聚合物基，例如，聚苯乙稀-二乙稀 基苯Poros A和MabCapture(应用生物系统公司(Applied Biosystems))。根据抗体，可使用 几种洗脱缓冲剂组分如乙酸、柠檬酸、磷酸、精氨酸HCl和甘氨酸HCl。洗脱pH的选择也取决 于抗体与树脂的结合亲和性，抗体的结合亲和性越高，则需要越低的洗脱pH。
[0091] 陶瓷羟基磷灰石(Ca5(PO4)3OH)2是一种形式的磷酸钙，其通常与磷酸钠梯度洗脱 联用来从二聚体、聚集体和浸出的蛋白A等其它污染物中分离抗体。
[0092]具体地，本文和实施例部分中描述了用于去除QSOXl的技术，并且其可与任意上述 技术联用或另外使用。
[0093] VIII.示例性抗体
[0094]所述的纯化方法和工作流可用于任意抗体，包括非人、人源化、人、嵌合、镶嵌、纳 米抗体、(^13、8(^￥'8^&13等。本发明的方法最常用于待偶联至试剂的抗体，用于诊断或治疗 用途。例如，该方法可用于待偶联至药物的抗体，用于治疗用途。一些这类抗体对癌细胞抗 原是免疫特异性的，该抗原优选在细胞表面上，其可在抗体结合后在细胞中内化。抗体可指 向的目标包括癌细胞上的受体及其配体或反受体(例如，CD3、CDl 9、⑶20、⑶22、⑶30、⑶33、 CD34、CD40、CD44、CD52、CD70、CD79a、Her-2、VEGF或VEGFR、CTLA-4、LIV-I，和连接蛋白-4)。
[0095]本发明的方法也可用于纯化待用于制备用于自身免疫疾病的治疗或预防的ADC的 抗体。
[0096]本发明的方法也可用于纯化结合至活化的淋巴细胞上表达的受体或受体复合物 的抗体。
[0097]本发明的方法也可用于纯化对病毒或微生物抗原有特异性的抗体。
[0098]市售的抗体及其适用于本发明的方法的靶标的一些示例包括阿来组单抗、CD52、 利妥昔单抗、CD20、曲妥珠单抗Her/neu、尼妥珠单抗、西妥昔单抗、EGFR、贝伐单抗、VEGF、帕 丽珠单抗、RSV、阿昔单抗、GpIIb/II Ia、英利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗 TNF-α、巴昔丽单抗(baci Iiximab )、达丽珠单抗、IL-2、奥马珠单抗、IgE、吉姆单抗、0)33、那 他珠单抗、VLA-4、维多珠单抗α4β7、贝利木单抗、BAFF、奥特力昔珠单抗、特普利珠单抗CD3、 奥法木单抗、奥瑞珠单抗CD20、依帕珠单抗CD22、阿仑单抗CD52、依库丽单抗C5、卡那木单抗 (^1^1^1]1111]^13)11^-10、美泊利单抗11^-5、瑞利珠单抗、托珠单抗11^-61?、乌斯克努单抗，和布 雷奴单抗IL-12。任选地，该抗体不是布妥昔单抗。
[0099] IX.治疗方法和药物组合物
[0100]按照上述方法产生的ADC以表明剂量、给药途径和给药频率的有效方案给予，其延 缓待治疗疾病的发生、降低其严重程度、抑制其进一步劣化，和/或缓解其至少一种迹象或 症状，如癌症、自身免疫疾病或感染，包括任意上述的指示。如果患者已经患有疾病，则方案 可以指治疗有效的方案。如果患者相对于一般群体处于疾病的升高风险中但还未经历症 状，方案可以指预防有效的方案。在一些情况中，可在单个患者中相对于历史对照或同一患 者过去的经历观察治疗或预防有效性。在其他情况中，治疗或预防有效性表现为临床前或 临床试验中治疗后患者的群体相对于未治疗对照群体的状况。
[0101] ADC的剂量一般根据ADC的药物组分变化。示例性剂量可包括，例如1.0yg/kg至 7 · 5mg/kg、或 2mg/kg至7 · 5mg/kg，或 3mg/kg至7 · 5mg/kg 对象体重，或0 · 1-20或0 · 5_5mg/kg 体 重（如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或1011^/1^)或10-1500或200-150011^作为固定剂量。在一些 方法中，给予患者至少1.5mg/kg、至少2mg/kg或至少3mg/kg的剂量，每三周或更久给药一 次。剂量取决于给药频率、患者的状况和对先前治疗的反应(如果有的话），无论该治疗是预 防性的还是治疗性的且无论该疾病是急性的还是慢性的等。
[0102] 给药可以是胃肠外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或 肌肉内。还可使给药直接定位于如肿瘤内。优选通过静脉或皮下给药对全身循环进行给药。 静脉内给药可以是例如输注一段时间（如30-90分钟)或单次推注注射。
[0103] 给药频率取决于ADC在循环中的半衰期、患者的病症和给药途径等因素。该频率可 以是按照患者病症的变化或所治疗癌症的进展进行每天、每周、每月、每季度或不规则间隔 给药。在一段持续治疗过程中，静脉内给药的一个示例性频率为介于一周两次和每季度一 次之间，但也可采用更高或更低频率的剂量。在一段持续治疗过程中，静脉内给药的其他示 例性频率为介于每周一次或每四周三次之间，但也可采用更高或更低频率的剂量。对于皮 下给药，示例性剂量频率为每天至每月，但也可采用更高或更低频率的剂量。
[0104] 所给予的剂量次数取决于疾病的性质（例如是否存在急性或慢性症状)和疾病对 治疗的反应。对于急性病症或慢性病症的急性恶化，1次至10次之间的剂量通常是足够的。 对于急性病症或慢性病症的急性恶化，有时单次推注剂量(任选以分开的形式)是足够的。 对于急性病症或急性恶化的复发，可重复治疗。对于慢性病症，可以规律间隔给予抗体，例 如每周、隔周、每月、每季度、每六个月，持续至少1、5或10年，或患者终身。
[0105] 用于胃肠道外给药的药物组合物优选为无菌且基本等渗(240-360m0sm/kg)且在 GMP条件下制造。可以单位剂量形式（即单次给药的剂量)提供药物组合物。可使用一种或多 种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂制备药物组合物。制剂取决于所选择的 给药途径。就注射而言，ADC可配制在水性溶液中，优选生理相容性缓冲液，如汉克斯(Hank' s)溶液、林格(Ringer ' s)溶液或生理盐水缓冲液或醋酸缓冲液（以减少注射位点的不舒适 性）。该溶液可包含配制剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体可以是使用前用合适 的载剂（如无菌无热原的水)进行重建的冻干形式。液体制剂中抗体的浓度可以是例如1-100mg/ml，如10mg/ml。
[0106] 使用本发明的ADC进行的治疗可与化疗、放疗、干细胞治疗、手术、抗病毒剂、抗生 素、免疫抑制剂或刺激物，或其他对所治疗病症有效的疗法联用。可与用于治疗癌症或自身 免疫疾病的ADC-起给予的有用的其他试剂的类别包括，例如，针对癌细胞上表达的其他受 体的抗体、抗微管蛋白药剂(如耳他汀）、DNA小沟结合物、DNA复制抑制剂、烧化剂(如铂络合 物，如顺铂、单铂、二铂和三核-铂络合物和卡铂）、蒽环类抗生素、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢 物、化疗增敏剂、多卡米星、依托泊甙、氟化嘧啶、离子载体、脂肪酸释放激素、亚硝基脲、顺 铂、预形成化合物、嘌呤抗代谢剂、嘌呤霉素、放疗增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制 剂、长春花生物碱等。
[0107] 在一些方面中，与不采用ADC的相同治疗(例如，化疗)相比，采用ADC治疗可使肿瘤 患者的中值无进展存活或总体存活时间增加至少30%或40%，但优选50%、60%至70%或 甚至100%或更长，尤其是在复发或难治时。在一些方面中，与不采用ADC的相同治疗(例如， 化疗)相比，治疗(例如，标准化疗)可使具有肿瘤的患者的完全反应率、部分反应率或目标 反应率(完全+部分)增加至少30%或40%，但优选50%、60%至70%或甚至100%。
[0108] 通常，相对于接受单独的标准治疗(或加安慰剂）的患者的对照组相比，在临床试 验(如II期、ΙΙ/ΠΙ期或III期试验）中，前述使用标准治疗加 ADC治疗的患者的中值无进展 存活和/或应答率的提高是统计学上显著的，例如处于P = O.05或0.01或甚至0.001水平。通 过癌症的临床试验中常规使用的客观标准测定完全和部分应答率，例如国家癌症研究所 和/或食品药品管理局接受或列出的那些。 实施例
[0109] 实施例1=QSOXl存在于从CHO细胞培养物纯化的抗体制备物的证据
[0110] 从在CHO细胞中表达的抗体的纯化所得的批号DEVNKB-I意外显示出弱的药物偶 联。相反，批号L22042/E显示所需水平的药物偶联。因为药物与抗体的偶联受游离巯基介 导，怀疑批号DEVNKB-I中存在具有氧化活性的杂质。图1显示氧化性杂质对药物与抗体偶联 功效的影响。来自批号DEVNKB-I的抗体(菱形标记)显示在超过50分钟的时间里随着还原时 间增加而减少的载药量，而来自L22042/E的抗体(方形标记)显示在还原过程中载药量的一 致且预期的水平。
[0111] 因为已经观察到在CHO细胞中产生的其它抗体的某些制备物具有与批号DEVNKB-I 相似的氧化活性，氧化活性的来源是令人感兴趣的。为了确定氧化活性的来源，通过凝胶电 泳和Western印迹以及液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析批号DEVNKB-I是否存在巯基氧 化酶。
[0112] 凝胶电泳和WesternEp迹
[0113] 在通过SDS-PAGE分离和银染后比较批号DEVNKB-I和L22042/E没有揭示明显对应 于氧化活性的任何蛋白质条带(数据未显示）。为了实现更好的分辨率，通过尺寸排阻色谱 分离批号DEVNKB-1。如实施例2所述，测试组分的氧化活性。参见，图2a。对应于峰值活性的 组分通过SDS-PAGE分离，印迹，然后用针对候选巯基氧化酶蛋白质(包括QSOXl、QS0X2和ALR (肝再生的增强因子））的抗体染色。图2b和2c分别显示了使用抗-ALR和抗-QSOXl-抗，之后 采用兔抗-山羊IgG二抗的Western印迹分析的结果。印迹显示二抗和许多产物相关物质之 间的广泛交叉反应性。不过，在抗-QSOXl印迹中检测到对应于65kD至70kD的分子量的峰值 组分27-29中的条带（图2c)，其与仓鼠 QSOXl的预测重量相一致(70，356道尔顿）。
[0114] LC-MS/MS 分析
[0115] 为了鉴定在抗-QSOXl Western印迹中检测到的65_70kD蛋白质，通过在Poros蛋白 A柱上的亲和色谱来分离批号DEVNKB-1。参见，图3a。如实施例2所述，测试组分的氧化活性。 参见图3b。基本上，所有的氧化活性都来自组分3和4。来自一系列三次运行的组分3和4经汇 集并通过SDS-PAGE分析。参见图3c。最明显的条带在65-70kD范围并且形成弥漫的单个条带 或双峰，与Western印迹一致。使用凝胶消化和LC-MS/MS，该条带被鉴定为QSOXl阳性。
[0116] 氧化剂表征
[0117] 除了在批号DEVNKB-I中表征氧化活性，使用亚铁氧化二甲酚橙(FOX)试验来测试 该批号的巯基氧化活性。巯基氧化酶催化以下反应：
[0118] 2R-SH+〇2^R-S-S-R+H2〇2
[0119] 随着反应进行，氧被消耗并且产生过氧化氢。可容易并可靠地检测到过氧化氢副 产物，并且因此用作巯基氧化酶活性的代表物。在FOX试验中，过氧化氢氧化亚铁离子(Fe 2+) 以产生铁离子(Fe3+)。然后，亚铁离子与二甲酚橙复合以形成吸收560nm光的化合物。因此， 通过监测560nm光的吸收(例如，使用分光光度计），可确定样品中巯基氧化活性的量。通过 确定560nm读数的差，将阴性对照的值与测试样品的值比较。如果所得的值超过0.1吸光度 单位，则样品对氧化性杂质而言是阳性的。如表1所示，DEVNKB-I的存在产生0.70-0.80的 560nm吸光度。然而，同时加入DEVNKB-I和ImM Zn2+，吸光度仅为0.008。数据显示，ImM Zn2+ 可基本上消除批号DEVNKB-I中的氧化活性。这与具有黄素依赖性巯基氧化酶结构域，如 QSOXl的氧化剂相一致。
[0120] 表1
[0122] 进行其它试验来观察EDTA能否逆转批号DEVNKB-I中氧化酶活性的Zn2+-依赖性消 除。在这些实验中，向含或不含Η)ΤΑ的试验缓冲剂中加入Zn 2+。另外，评价了具有EDTA的试验 缓冲剂。如表2所示，相对于含额外EDTA的试验缓冲剂，由于存在Zn 2+，与批号DEVNKB-I相关 的氧化活性降低了 95%。然而，同时加入Zn2+和额外的EDTA仅仅降低了 6%的氧化活性。因 此，EDTA有效逆转了氧化活性的Zn2+-依赖性抑制。同样地，这是对于具有黄素依赖性的巯 基氧化酶结构域的氧化剂(如QS0X1)所预期的。
[0123] 表2
[0125] 基于Western印迹数据、LC-MS/MS数据（未显示）和氧化活性的表征，确定批号 DEVNKB-I中的氧化活性是QSOXl巯基氧化酶。
[0126] 实施例2:检测CHO细胞培养物中QSOXl的试验
[0127] 为了提供对抗体制备物中氧化活性的检测（例如，当抗体预期与药物偶联时），开 发了利用部分还原的SGN-30(cAC10抗体，其是布妥昔单抗的抗体组分作为底物)的试验。选 择SGN-30作为底物，因为cACIO抗体已被一致性地纯化而没有QSOXl污染。可代替SGN-30使 用其它具有游离巯基的充分表征的底物。
[0128] 该试验包括用测试样品孵育底物（例如，SGN-30) -段固定的时间，然后使用DTNB (5，5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸），也称为埃尔曼试剂)检测底物中游离巯基的量。
[0129]
[0130] 底物中的游离巯基与DTNB相互反应，切割二硫键并且产生2-硝基-5-硫代苯甲酸 根(NTBJ，其在中性和碱性pH下在水中经离子化成NTB2'NTB2^为黄色并且可使用分光光度 计并测量412nm处的可见光吸光度来快速定量。如果测试样品中存在氧化性杂质，则底物上 的游离巯基(例如，在未已经包括在二硫键中的半胱氨酸残基中）被氧化成二硫键，产生较 少的游离巯基。因此，底物和DTNB之间有较少的反应，导致样品产生较少的黄色和相应的 412nm光处较低的吸光度。
[0131] DTNB和游离巯基之间的反应是快速并且符合化学计量的。因此，如果需要，可使用 14, ISOir1Cnf1的摩尔消光系数对底物中游离巯基的量进行定量(适用于稀释缓冲剂溶液）。
[0132] 试验中使用的材料包括分光光度计(例如，Agilent型号8453);石英比色皿(例如， Starna，16.50-Q-10/Z15);1M Tris HCl，pH 7·4;0·5Μ EDTA，pH 8.0;磷酸二氢钾；磷酸氢 二钾；聚山梨酯80;DTNB(例如，Sigma D218200)。
[0133] 该试验包括对至少阴性对照样品、阳性对照、测试样品和分光光度计孔板的分光 光度分析。可根据需要分析其它对照和/或测试样品。对照和测试样品的成分示于表3。试验 中使用的缓冲剂是IOmM磷酸钾，0.2mg/mL聚山梨酯80，pH 6.0。然而，根据待分析的测试样 品的缓冲剂，其它稀释缓冲剂也是合适的。待分析样品的终体积是150yL，但也可根据需要 调节。为了简化该试验，可制备含有缓冲剂、EDTA、水和底物(例如，部分还原的cACl 0)的主 混合物，在向I OOyL的主混合物中加入50yL的样品之后开始试验。
[0134] 表3
[0136] 如下进行样品制备和分析。对应于待分析的对照和样品标记微量离心管。将IOOyL 的主混合物置于各管中。向对应的对照/测试样品管中加入50yL的各样品。管通过涡旋混 合。将管置于37°C水浴或孵育器中并孵育2小时。标记各样品的第二微量离心管并且将100μ L的ImM DTNB置于各管中。在2小时孵育结束时，从水浴/孵育器中移出样品并且将IOOyL的 样品转移至含IOOyL的DTNB的相应微量离心管中。管通过涡旋混合。样品在室温下孵育至少 5分钟，然后确定吸光度。在412nm下测量吸光度并且相对于700nm处的吸光度校正（即，确定 A412-A700) 〇可收集200至700nm的光谱。
[0137] 为了评价测试样品中存在氧化性杂质，通过确定412nm读数的差来对阴性对照(缓 冲剂)的值(412nm-700nm)与测试样品的值进行比较。如果所得的值超过0.1吸光度单位，则 样品对氧化性杂质而言是阳性的。
[0138] 当测试来自抗体培养物的培养基时，试验一般产生高的值(约0.5AU)，表明高水平 的氧化剂。然而，试验读数基于颜色，并且细胞培养基中的颜色往往干扰试验读数。因此，难 以使用该试验确切测量澄清的收获物中的氧化性杂质。优选在至少一个纯化步骤，例如，在 至少一个色谱步骤之后(例如，在蛋白A、离子交换或HIC色谱之后)测量氧化性杂质。
[0139] 该试验一般测量巯基氧化酶的活性，包括从QSOXl、QS0X2、ALR和其它酶产生的活 性。也可使用针对具体巯基氧化酶的更具体试验，例如，如实施例1所述。
[0140] 实施例3:去除QSOXl的方法
[0141] 通过在蛋白A上进行盐洗涤来减少氧化性杂质
[0142] 在本文中称为抗体2的第二抗体制备物发现有不可接受的高水平氧化活性(在通 过离心和过滤澄清化之后）。为了去除氧化性杂质，评价了各种强度的盐洗涤的蛋白A色谱。
[0143] 3 · 2cm直径，23 · 2cm床高（193 · 2mL床体积）的MabSelect Sure蛋白A柱用25mM 1^8,50禮似(：1，？!17.5平衡，然后加载至258 11^13/1填充床。在加载之后，用含各种水平的 NaCl的50mM Tris缓冲的溶液洗涤柱，如表4所示。使用25mM乙酸盐，pH 3.4进行抗体洗脱。 流速在4分钟停留时间中保持恒定。
[0144] 使用实施例2的试验分析柱洗脱液中氧化性杂质的水平。数据(参见表4)显示，当 用中等（150mM NaCl)或高（500mM NaCl)浓度的盐洗涤时，蛋白A洗脱液中不含氧化性杂 质。含低浓度的盐(50mM NaCl)的洗涤液在将氧化性杂质的水平降至低于0.1的吸光度阈值 方面是无效的。来自高浓度盐的洗涤液含有高水平的氧化性杂质，证明高浓度盐洗涤液使 杂质从柱树脂或mAb上解吸。
[0145] 该结果一般表明氧化性杂质对蛋白A配体、树脂主链和/或mAb的亲和性被高离子 强度溶液破坏，这与离子相互作用相一致。
[0146] 表4
[0148] 深度过滤
[0149] 也测试深度过滤去除氧化性杂质的能力。深度滤器，Millipore XOHC滤器用50-lOOL/m2的水润湿并且用至少15L/m2的平衡缓冲剂（例如，pH为7.5-8并且NaCl浓度为50-IOOmM)平衡。以230L/m 2/小时进行过滤。在20-60L/V的目标上样系数下的（LMH)。为了回收 产品，用足够体积的平衡缓冲剂冲洗滤器以确保达到目标峰值收集。通过280nm处的吸光度 来收集滤液。使用这类条件，去除氧化性杂质。
[0150] 阴离子交换-Capto Q
[0151] 观察到Capto Q强阴离子交换柱(GE医疗生命科学公司，目录号17-5316)当在用pH 8.0和电导率<8mS/cm(例如，5-7mS/cm)的缓冲剂的流出模式下运行时导致去除氧化性杂 质。这些条件提供了使用Capto Q柱评价氧化性杂质去除的起点。对于抗体1，证明需要具 有低电导率和高pH的缓冲剂来有效清除氧化性杂质。以流出模式运行Capto Q柱。在合适的 条件下，树脂不滞留mAb，而树脂吸附氧化性杂质。之后使用高盐缓冲剂从树脂上提取氧化 性杂质。对于第二抗体，抗体2，如表5所示，在7.5的pH下证明有效清除(7.5-8有效），前提是 缓冲剂的电导率是llmS/cm(需要低于或等于11的电导率）为7并且电导率范围为11-15mS/cm的缓冲剂在以流出模式从mAb分离杂质方面是无效的，如pH 7.5且电导率151115/〇11 的缓冲剂。
[0152]表5
[0154] 苯基膜
[0155] 当以流出模式运行时，还已经发现Sartobind Pheny丨⑧从CHO细胞中产生的抗体制 备物中有效清除氧化性杂质。在合适的条件下，氧化性杂质被膜滞留，而mAb不被滞留。之后 可使用低盐缓冲剂从树脂上提取氧化性杂质。通过将抗体稀释至目标柠檬酸盐摩尔浓度 (一般是0.3-0.4M柠檬酸钠)和pH( -般是6-8)来制备上样物。膜在5倍膜体积(MV)的选择匹 配稀释的抗体上样物的平衡缓冲剂中平衡。然后将稀释的上样物施加到膜上，并且用IOMV 的稀释缓冲剂洗涤膜。不含氧化性杂质的抗体制备物来自流出液。用例如50mM Tris，pH 8 来洗脱结合的材料，并且用例如5MV的pH 6.5的25mM磷酸钠，20 % IPA来再生膜。以IOmL/分 钟或3.3MV/分钟运行该过程。收集流出的整个峰，例如，使用2mm流体路径在280nm下从0.1 至0.1AU。
[0156] 表6提供了来自苯基膜上的纯化步骤的数据。在苯基流出液中测量的氧化性杂质 的水平范围是0.1至0.04吸光度单位。
[0157] 表6
[0159] 为了确定使用苯基膜的操作稳健性，在不同的pH和柠檬酸盐摩尔浓度的条件下应 用苯基膜纯化步骤之后评价抗体2制备物中存在的氧化性杂质。参见表7。为了降低流出液 中氧化性杂质的水平，柠檬酸盐的摩尔浓度优选上限，〇. 4M。
[0160] 表7
[0162] 上文和下文中提到的所有专利申请、网页、其他出版物、登录号等均通过引用全文 纳入本文以用于所有目的，就好像各项均特定和单独表示通过引用纳入本文。如果不同版 本的序列在不同的时间与一个登录号相关，则表示在本申请的有效申请日与该登录号相关 的版本。有效申请日表示早于实际申请日或关于该登录号的一项优选权申请的申请日（如 果适用）。类似地，如果不同版本的出版物在不同时间公开，除非另有说明，否则表示与本申 请的有效申请日最接近时间公开的版本。除非另有特定说明，本发明中的任意特征、步骤、 元件、实施方式或方面均可与任意其他的联用。虽然出于方便和理解的目的，通过阐述和举 例的方式详细描述了本发明，但可明显看出，某些改变和修改应属于所附权利要求书的范 围。
[0163] 序列表：
[0164] SEQ ID NO: 1:
[0165] MATGLRRREYIWLLWALTITVSYLVALFSHLLRILTVKKLQWRPVLNLAVLDCAEETNTAVCRDFNISG FPTVRFFKAFSKNGSGITLPVADASVETLRRKLIDALESHSDMWSSSRPKLKPAKLVEINEFFAETNEDYLVLIFED KDSYVGREVTLDLFQHHIPVHRVLNTERNAVSKFGVVEFPSCYLLFRNGSFSRVPVVMESRLFYTSYLKGMSGPILV DPPTTTISTDAPVTTDVVPTVWKVANHARIYMADLESSLHYIFLVEVGKFSVLEGQRLLALKKLVAVLAKYFPGRPL AQNFLHSIHDWLQRQQRKKIPYKFFRAALDNRKEGIVLTEKVNWVGCQGSKPHFRGFPCSLWILFHFLTVQASRYSE NHPQEPADGQEVLQAMRSYVQWFFGCRDCAEHFENMAASTMHRVRSPTSAVLWLffTSHNKVNARLSGAPSEDPYFPK VQWPLRELCFDCHNEINGREPVWDLEATYRFLKAHFSSENIILDTPVAGLATQRNPQILGATPEPVMDALELETRNS VLGHERAASTESPGATALNVPVGKPEASGPQALYTGQGPPEHMEEPQRVTQGHTQGQQHLSKRDTEVLTLPEVNHLQ GPLELRRGGRSPKQLVNIPEGEPEAPAIRGQGPWLQVLGRGFSHLDISLCVGLYSVSFVCLLAMYTYFRARLRTPKG HLVTQ
[0166] SEQ ID NO:2:
[0167] MRRCGRHSGS PSQMLLLLLP PLLLAVPGAG AVQVSVLYSS SDPVTVLNAN TVRSTVLRSN GAffAVEFFAS WCGHCIAFAP TffKELAYDVR EffRPVLNLAV LDCAEETNTA VCRDFNISGF PTVRFFKAFS KNGSGITLPV ADASVETLRR KLIDALESHS DMffSSSRPKL KPAKLVEINE FFAETNEDYL VLIFEDKDSY VGREVTLDLF QHHIPVHRVL NTERNAVSKF GVVEFPSCYL LFRNGSFSRV PVVMESRLFY TSYLKGMSGP ILVDPPTTTI STDAPVTTDV VPTVffKVANH ARIYMADLES SLHYIFLVEV GKFSVLEGQR LLALKKLVAV LAKYFPGRPL AQNFLHSIHD WLQRQQRKKI PYKFFRAALD NRKEGIVLTE KVNWVGCQGS KPHFRGFPCS LffILFHFLTV QASRYSENHP QEPADGQEVL QAMRSYVQffF FGCRDCAEHF ENMAASTMHR VRSPTSAVLff LffTSHNKVNA RLSGAPSEDP YFPKVQffPLR ELCFDCHNEI NGREPVffDLE ATYRFLKAHF SSENIILDTP VAGLATQRNP QILGATPEPH M
【主权项】
1. 一种产生偶联的抗体的方法，所述方法包括： (a) 进行纯化方案中的至少一个纯化步骤，W从表达所述抗体的C册细胞的培养物中获 得至少部分纯化的抗体制备物； (b) 测试所述制备物是否存在CHO细胞氧化酶； (C)如果检测到步骤(b)的制备物中存在不可接受水平的所述酶，则用不同的纯化步骤 重复步骤(a)和(b); (d)如果检测到步骤(b)的制备物中CHO细胞氧化酶W可接受水平存在或不存在，则对 表达所述抗体的CH0细胞的同一培养物或第二培养物进行导致可接受水平的CH0细胞氧化 酶或检测不到C册细胞氧化酶的至少一个纯化步骤，W获得至少部分纯化的抗体制备物。2. 如权利要求1所述的方法，所述方法还包括步骤(e)将所述至少部分纯化的抗体通过 一个或多个琉基基团与药物偶联，W产生偶联的抗体。3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述(?0细胞氧化酶是QS0X1。4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(d)中的第二培养物是在体 积上比步骤(a)中的培养物大的培养物。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(d)中的第二培养物在体积上比步骤(a) 中的培养物大至少1000倍。6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，在至少一年的一段时间中对所述抗体的不同 培养物多次进行步骤(d)和(e)。7. 如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，导致可接受水平的酶或检测不到 酶的纯化方案包括W下步骤中的至少一个:用150-500mM化C1浓度的盐洗涂液洗涂蛋白A 柱、使用深度过滤、用季锭离子柱进行阴离子交换，或苯基膜过滤。8. 如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述测试包括鉴定凝胶上65- 75kDa的条带。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，通过Western印迹或银染来鉴定所述条带。10. 如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述测试包括对QS0X1活性的功 能性测试。11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述功能性测试产生过氧化氨作为所述活 性的指标。12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述活性被锋离子抑制，所述抑制被抓TA 逆转。13. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体不是布妥昔单抗。14. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞毒性药物选自抗微管 蛋白剂、DNA小沟结合物、DNA复制抑制剂、化疗敏化剂和化咯并苯并二氮杂菩二聚体。15. -种确定从(?0细胞培养物中纯化抗体的方法的方法，所述方法包括： (a) 进行纯化方法，W从表达所述抗体的C册细胞的培养物中获得至少部分纯化的抗体 制备物； (b) 测试所述制备物是否存在CH0酶QS0X1; (C)如果检测到步骤(b)的制备物中存在不可接受水平的所述酶，则用不同的纯化方法 重复步骤(a)和(b);16. -种产生偶联的抗体的方法，所述方法包括： 通过纯化方法从CHO细胞的培养物中纯化抗体，所述纯化方法包括W下步骤中的至少 一个:在25-lOOmM化C1浓度下洗涂蛋白A柱、使用深度过滤、用季锭离子柱进行阴离子交 换，或苯基膜过滤，其中所述抗体与培养物中的QS0X1酶分离;并且将纯化的抗体通过一个 或多个琉基与细胞毒性药物偶联W产生所述偶联的抗体。17. -种产生偶联的抗体的方法，所述方法包括： (a) 进行纯化方案中的至少一个纯化步骤，W从表达所述抗体的C册细胞的培养物中获 得至少部分纯化的抗体制备物； (b) 将所述至少部分纯化的抗体通过一个或多个琉基与细胞毒性药物在一定条件下偶 联W产生所述偶联的抗体，其中产生不可接受地低的水平的偶联的抗体； (C)测试步骤(a)的纯化的制备物是否存在(?0细胞氧化酶； (d) 如果在步骤(C)中检测到存在不可接受水平的所述CHO细胞氧化酶，则用不同的纯 化步骤进行步骤(a)和（C)直至步骤(C)中不存在所述CHO细胞氧化酶或存在可接受水平的 所述CHO细胞氧化酶； (e) 对表达所述抗体的CHO细胞的第二培养物进行导致可接受水平QS0X1酶或检不测到 QS0X1酶的至少一个纯化步骤，W获得纯化的抗体;和 (f) 将所述纯化的抗体通过一个或多个琉基基团偶联至细胞毒性药物，W产生所述偶 联的抗体。18. -种产生偶联的抗体的方法，所述方法包括： (a) 获得抗体的制备物； (b) 测试所述制备物是否存在CHO细胞氧化酶； (C)如果检测到步骤(b)的制备物中存在不可接受水平的所述酶，则进行纯化步骤W将 所述C册细胞氧化酶去除至可接受的水平;和 (d)将所述至少部分纯化的抗体通过一个或多个琉基基团偶联至药物，W产生所述偶 联的抗体。19. 一种确定抗体制备物是否适合用作药物的方法，所述方法包括W下步骤： 测试所述制备物是否存在CHO细胞氧化酶； 如果在所述抗体制备物中检测到存在不可接受水平的所述酶，则鉴定所述制备物为不 适于偶联且需要进一步纯化;和 如果所述抗体制备物中检测不到酶或检测到可接受水平的酶，则鉴定所述制备物适于 偶联。20. -种确定抗体制备物是否适合偶联至药物的方法，所述方法包括W下步骤： 测试所述制备物是否存在CHO细胞氧化酶； 如果在所述抗体制备物中检测到存在不可接受水平的所述酶，则鉴定所述制备物为不 适于偶联且需要进一步纯化;和 如果所述抗体制备物中检测不到酶或检测到可接受水平的酶，则鉴定所述制备物适于 偶联。21. -种确定抗体制备物是否适合用作药物的方法，所述方法包括W下步骤： 测试所述制备物是否存在CHO细胞氧化酶。22. -种确定抗体制备物是否适合偶联至试剂(例如，药物）的方法，所述方法包括W下 步骤： 测试所述制备物是否存在CHO细胞氧化酶。23. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体是在CHO细胞中产生 的抗体。24. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体制备物已经经历至少 一个纯化步骤。25. 如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述纯化步骤是色谱纯化步骤。26. -种抗体药物偶联物，其中所述抗体在偶联之前经历是否存在CHO细胞氧化酶的测 试。27. 如权利要求15或17-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述测试包括鉴定凝胶 上65-75kDa的条带。28. 如权利要求27所述的方法，其特征在于，通过Western印迹或银染来鉴定所述条带。29. 如权利要求15或17-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述测试包括对QS0X1活 性的功能性测试。30. 如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述功能性测试产生过氧化氨作为所述活 性的指标。31. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述活性被锋离子抑制，所述抑制被抓TA 逆转。32. 如权利要求1-7、15或17-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述测试设及监测 对照样品和测试样品中游离琉基和DTNB之间的反应，并且比较两者。
【文档编号】A61K39/395GK105979963SQ201480064191
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年11月21日
【发明人】B·海耶斯, K·比姆, D·迈耶, R·莱昂, J·瓦里尔-道格拉斯
【申请人】西雅图基因公司