用于诊断和治疗肿瘤的病毒样颗粒缀合物的制作方法

用于诊断和治疗肿瘤的病毒样颗粒缀合物的制作方法
【专利摘要】本公开内容涉及使用与光敏分子缀合的病毒样颗粒来诊断和/或治疗肿瘤(例如眼肿瘤)的方法和组合物。
【专利说明】
用于诊断和治疗肿瘤的病毒样颗粒缀合物
[0001] 相关申请
[0002] 本申请依据351^.(：.§119(6)要求于2013年9月18日提交的美国临时申请号61/ 879,627的权益，其通过引用整体并入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容涉及肿瘤诊断和治疗的领域。
【背景技术】
[0004] 尽管有许多治疗可用于癌症，但是很多形式的癌症仍无法治愈、不可治疗或者变 得对标准治疗具有抗性并且用于很多癌症的有效治疗具有不期望的副作用。眼癌(ocular cancer)(例如眼黑素瘤和成视网膜细胞瘤）的治疗特别具有挑战性。诊断为患有眼黑素瘤 的患者根据肿瘤大小具有很少治疗选择，包括：（1)外科手术，例如切除术(resection)、摘 出术(enucleation)或摘除术(exenteration )，其全部是高度侵入性的并且主要涉及移除 眼和视神经部分（在外科手术后，患者通常安装人工眼）；和（2)斑块近程治疗（plaque brachytherapy)，其为一种放射治疗，其中将用放射性粒子(radioactive seed)覆盖一侧 的薄金属(例如，金)片缝合到眼的外壁上且所述粒子以肿瘤为目标。在治疗结束时，将该薄 金属片移除，所述治疗通常持续数天。放射性相关的严重并发症包括:最常见的白内障形 成，继之为玻璃体出血。其他的并发症包括干眼、角膜炎、放射诱发性虹膜新血管形成 (radiation-induced iris neovascularization)、新生血管性青光眼、放射诱发性视网膜 病、放射诱发性视神经病变、巩膜外沉积(ep i sc I era I depos i t)、巩膜坏死和/或眼外肌改 变。已报道，在用斑块近程治疗进行治疗的10%至63%的患者中发生放射性视网膜病，并且 从治疗到发生黄斑病变的平均时间为约25.6个月。
[0005] 发明概述
[0006] 本公开内容至少部分地提供了用于检测和/或选择性地靶向肿瘤细胞(例如用于 诊断和/或治疗癌症(例如，眼癌））的方法和组合物。在一些情况下，本文中提供的方法和组 合物可用于选择性地杀伤癌性肿瘤细胞而不损伤健康细胞。例如，可选择性地向肿瘤细胞 递送包含光敏分子(例如，与光敏分子缀合）的病毒样纳米颗粒，并通过暴露于光来对其进 行光活化。当光活化时，光敏分子吸收光子，并且所吸收的能量导致引起毒性(例如，细胞毒 性）的分子改变。"光敏病毒样纳米颗粒"（在本文中还称为"光敏病毒样颗粒"）指与光敏分 子缀合的病毒样纳米颗粒。令人惊奇的是，光敏分子与病毒样纳米颗粒的缀合不干扰该纳 米颗粒的组织/肿瘤向性(tropism)(例如，病毒样纳米颗粒对特定宿主肿瘤组织或肿瘤细 胞的特异性）。
[0007] 本公开内容的病毒样纳米颗粒(还称为病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)) 一般由LI衣壳蛋白或LI和L2衣壳蛋白的组合装配，并且在一些实施方案中，所述光敏分子 与形成病毒样纳米颗粒的衣壳蛋白缀合。因此，本公开内容的多个方面提供了靶向肿瘤的 病毒样纳米颗粒，其包含与衣壳蛋白缀合的光敏分子。
[0008]本公开内容的一些方面还提供了靶向肿瘤的病毒样颗粒，其每个颗粒包含约50至 约500、约50至约600、约50至约700、约50至约800、约50至约900或约50至约1000个光敏分 子。在一些实施方案中，靶向肿瘤的病毒样颗粒每个颗粒包含约400、约500、约600、约700、 约800、约900或约1000个光敏分子。在一些实施方案中，靶向肿瘤的病毒样颗粒每个颗粒包 含500个光敏分子或1000个光敏分子。
[0009]在一些实施方案中，所述衣壳蛋白是乳头瘤病毒(papilloma virus)衣壳蛋白。例 如，在一些实施方案中，所述乳头瘤病毒衣壳蛋白为非人乳头瘤病毒（non-human papilloma virus)衣壳蛋白，例如牛乳头瘤病毒(bovine papilloma virus)衣壳蛋白。在 一些实施方案中，所述病毒样颗粒包含人乳头瘤病毒(human papilloma virus)衣壳蛋白 并且不与人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)16、HPV 18或对HPV具有特异性的已 有(pre-existing)抗体交叉反应。
[0010] 在一些实施方案中，所述病毒样颗粒包含乳头状瘤Ll或L1/L2蛋白（例如，人、牛或 其他物种）。在一些实施方案中，所述Ll或L1/L2 VLP不与针对人乳头瘤病毒(HPV)16、HPV 18的中和性抗体或对其他HPV具有特异性的已有抗体交叉反应。然而，在一些实施方案中， 所述病毒样颗粒包含HPVl 6的人乳头瘤病毒衣壳蛋白。
[0011] 在一些实施方案中，所述光敏分子与衣壳蛋白的表面暴露的肽缀合。
[0012] 在一些实施方案中，所述病毒样颗粒包含Ll衣壳蛋白或Ll和L2衣壳蛋白的组合。 在一些实施方案中，所述病毒样颗粒由Ll衣壳蛋白组成。
[0013] 在一些实施方案中，病毒样颗粒包含BPV Ll衣壳蛋白（例如，SEQ ID N0:2)，BPV LI和BPV L2衣壳蛋白的组合。在一些实施方案中，病毒样颗粒包含HPV LI衣壳蛋白或HPV Ll和HPV L2衣壳蛋白的组合。在一些实施方案中，HPV Ll衣壳蛋白是具有经修饰的免疫原 性和/或抗原性的变体HPV16/31 Ll蛋白（例如，SEQ ID N0:1)。因此，在一些实施方案中，病 毒样颗粒包含变体HPV16/31 Ll衣壳蛋白或变体HPV16/31 Ll衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO: 1)和HPV L2衣壳蛋白的组合，或者由其组成。
[0014]在一些实施方案中，病毒样颗粒的衣壳蛋白具有经修饰的免疫原性和/或抗原性。 这样的衣壳蛋白的非限制性实例是HPV16/31 Ll衣壳蛋白（例如，SEQ ID N0:1)。与野生型 病毒样颗粒相比，本文中可将包含经修饰的衣壳蛋白的病毒样颗粒称为包含经修饰免疫原 性和/或抗原性的病毒样颗粒。
[0015]在一些实施方案中，所述光敏分子与衣壳蛋白共价缀合。在一些实施方案中，所述 光敏分子与衣壳蛋白的氨基酸缀合。在一些实施方案中，所述光敏分子与衣壳蛋白的氨基 酸的胺基团（例如，脂族伯胺)缀合。在一些实施方案中，所述光敏分子与衣壳蛋白的赖氨酸 残基的胺基团（例如，赖氨酸的侧链胺)缀合。在一些实施方案中，所述光敏分子与衣壳蛋白 的精氨酸和/或组氨酸残基的胺基团缀合。本公开内容提供了用于使光敏分子与赖氨酸以 及包含胺基团的其他氨基酸缀合的方法。
[0016] 在一些实施方案中，所述光敏分子不破坏(compromise)(例如，阻止、干扰或抑制） 病毒样颗粒与肿瘤细胞表面的结合。在一些实施方案中，所述光敏分子不破坏(例如，阻止、 干扰或抑制）病毒样颗粒与肿瘤细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulphate proteoglycan)或其他多糖的结合。
[0017] 在一些实施方案中，所述病毒样颗粒包含约10至约1000个光敏分子。在一些实施 方案中，所述病毒样颗粒包含约50至约1000个光敏分子。在一些实施方案中，所述病毒样颗 粒包含约100至约1000个光敏分子。在一些实施方案中，所述病毒样颗粒包含约100至约500 个光敏分子。在一些实施方案中，所述病毒样颗粒包含约500至约1000个或更多个光敏分 子。
[0018] 在一些实施方案中，所述病毒样颗粒包含约10至约1000个光敏分子，所述光敏分 子与Ll衣壳蛋白、L2衣壳蛋白或Ll衣壳蛋白和L2衣壳蛋白之组合的赖氨酸残基或其他氨基 酸残基缀合。
[0019] 在一些实施方案中，所述光敏分子通过红外光、近红外光或紫外光来活化。当如本 文中的其他部分所述，当光敏分子吸收光子并且所述吸收的能量导致引起毒性的分子改变 时，认为所述分子被"活化"。
[0020] 在一些实施方案中，所述光敏分子包含荧光染料、红外染料、近红外染料、扑啉分 子、叶绿素分子或前述任意两种或更多种的组合。
[0021] 在一些实施方案中，所述光敏分子是卟啉分子。根据本公开内容使用的卟啉分子 的实例包括但不限于:HpD(血卟啉衍生物）、基于HpD的分子(HpD-based)、ΒΗ)(苯并卟啉衍 生物）、ALA(5-氨基乙酰丙酸)和德卟啉(texaphyrin)。在一些实施方案中，所述卟啉分子是 维替泊芬(verteporf in，Visudyne@)。
[0022] 在一些实施方案中，所述光敏分子是叶绿素分子。根据本公开内容使用的叶绿色 分子的实例包括但不限于：二氢卟酚（chlor in)、红紫素 （purpur in)和菌绿素 (bacteriochlorin)〇
[0023] 在一些实施方案中，所述光敏分子是染料。用于根据本公开内容使用的染料的实 例包括但不限于酿菁(口111：11&1〇〇5^11；[116)和萘菁(11&口1：11&1005^11；[116)。
[0024] 在一些实施方案中，所述酞菁染料是焚光分子和近红外分子二者。例如，在一些实 施方案中，所述酞菁染料是IR700染料(例如，IRl>ye_7〇〇DX，U-C：OR?hiR7〇〇染料是 一种吸收和发射波长在通常为680nm至800nm的近红外(near-inf rared，NIR)光谱内的焚光 染料。本文中还提供了吸收和发射波长在NIR光谱内的另一些荧光染料。
[0025] 在一些实施方案中，所述光敏分子选自：酞菁染料（例如，IR700染料，例如 IRDyew7〇〇DX)、扑啉分子(例如，维替泊芬，例如Visudyne?)以及酞菁染料和卟啉分子 的组合。
[0026] 本公开内容的一些方面提供了这样的方法，其包括向患有肿瘤的对象施用本文中 提供的任一种病毒样颗粒或光敏病毒样颗粒。在一些实施方案中，所述方法包括在允许光 敏分子可视化的波长下活化病毒样颗粒的光敏分子。因此，在一些实施方案中，本公开内容 的光敏分子用作成像剂和/或诊断剂。在一些实施方案中，所述方法包括在导致光敏分子具 有细胞毒性的光波长下活化所述分子。在一些实施方案中，所述方法包括在这样的光波长 下活化光敏分子，所述光波长在肿瘤细胞内产生造成导致坏死的直接且不可逆的细胞损伤 的能量传递。因此，在一些实施方案中，本公开内容的光敏分子用作治疗剂和/或预防剂。
[0027] 本公开内容的一些方面提供了这样的方法，其包括向患有肿瘤的对象施用靶向肿 瘤的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包含与衣壳蛋白缀合的光敏分子。在一些实施方案中，所 述方法包括在使光敏分子可见的波长下活化病毒样颗粒的所述分子。即，所述光敏分子在 光激发之后重新发射光。在一些实施方案中，所述方法包括在使光敏分子具有细胞毒性从 而杀伤肿瘤细胞的波长下活化所述分子。即，所述光敏分子在光激发之后经历导致光敏分 子变得对细胞具有毒性的分子改变。
[0028] 本公开内容的一些方面提供了这样的方法，其包括向患有肿瘤的对象施用靶向肿 瘤的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包含约50至约1000、约50至500,或约500至1000个光敏分 子。在一些实施方案中，方法包括向患有肿瘤的对象施用靶向肿瘤的病毒样颗粒，其包含 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多个光敏分子。在一些实施方案中， 所述方法包括在使光敏分子可见的波长下活化所述分子。在一些实施方案中，所述方法包 括在使光敏分子具有细胞毒性从而杀伤肿瘤细胞的波长下活化所述分子。
[0029] 在一些实施方案中，所述光敏分子是激光活化的。在一些实施方案中，所述激光是 红外激光、近红外激光或紫外激光。在一些实施方案中，所述红外激光为5焦耳(J)至100J (或J/cm2)(例如，5J、6J、7J、8J、9J、10J、11J、12J、13J、14J、15J、16J、17J、18J、19J、20J、 21J、22J、23J、24J、25J、26J、27J、28J、29J、30J、31J、32J、33J、34J、35J、36J、37J、38J、39J、 40J,41J,42J,43J,44J,45J,46J,47J,48J,49J,50J,51J,52J,53J,54J,55J,56J,57J,58J, 59J、60J、61J、62J、63J、64J、65J、66J、67J、68J、69J、70J、71J、72J、73J、74J、75J、76J、77J、 78J、79J、80J、81J、82J、83J、84J、85J、86J、87J、88J、89J、90J、91J、92J、93J、94J、95J、96J、 97J、98J、99J或IOOJ(或J/cm 2))。在一些实施方案中，所述激光施加约5秒至约5分钟。
[0030] 在一些实施方案中，在向对象施用病毒样颗粒后约30分钟至约48小时活化光敏分 子。例如，可在向对象施用病毒样颗粒后30分钟活化光敏分子。在一些实施方案中，在向对 象施用病毒样颗粒后1小时、2小时(h)、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10 小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21 小时、22小时、23或24小时活化光敏分子。在一些实施方案中，在向对象施用病毒样颗粒后1 天、2天或3天活化光敏分子。
[0031] 在一些实施方案中，所述肿瘤是眼肿瘤或已转移至眼部的肿瘤。例如，在一些实施 方案中，所述眼肿瘤位于玻璃体(vitreous)、脉络膜腔(choroidal space)、虹膜、睫状体、 巩膜、视网膜中央凹（fovea)、视网膜、视盘或视神经中。
[0032] 在一些实施方案中，所述肿瘤位于肺、胸膜、肝、胰、胃、食管、结肠、乳腺、卵巢、前 列腺、脑、脑脊膜(meninges)、睾丸、胃肠道、肾或膀胱中。
[0033] 在一些实施方案中，所述肿瘤无需外科手术介入即可接近(accessible)。
[0034] 在一些实施方案中，所述肿瘤位于头、颈、子宫颈、喉或皮肤中。
[0035] 在一些实施方案中，所述肿瘤是孤儿病（orphan disease)或罕见病（rare disease)〇
[0036] 在一些实施方案中，所述肿瘤是癌性的。在一些实施方案中，所述肿瘤是转移性 的。在一些实施方案中，所述肿瘤是癌前期的或发育不良性的。
[0037] 在一些实施方案中，所述病毒样颗粒通过注射来施用。例如，所述病毒样颗粒可通 过眼内注射到玻璃体中来施用或者可静脉内施用。在一些实施方案中，所述病毒样颗粒用 空心针(ho 11 ow needle)或包被针（coated needle)、微型针(mini-needIe)或显微操作针 (micro-needle)来施用。在一些实施方案中，所述病毒样颗粒表面(topically)施用。在一 些实施方案中，所述病毒样颗粒通过植入来施用。
[0038] 在一些实施方案中，所述衣壳蛋白是乳头瘤病毒衣壳蛋白。例如，在一些实施方案 中，所述乳头瘤病毒衣壳蛋白为非人乳头瘤病毒衣壳蛋白，例如牛乳头瘤病毒(BPV)衣壳蛋 白。在一些实施方案中，所述病毒样颗粒包含人乳头瘤病毒衣壳蛋白并且不与人乳头瘤病 毒(HPV) 16、HPV 18或对HPV具有特异性的已有抗体交叉反应。在一些实施方案中，所述病毒 样颗粒包含人乳头瘤病毒16型衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述VLP不与对人乳头瘤病毒 (HPV) 16、HPV 18 VLP具有特异性的抗体或由HPV感染特异性地诱导的已有抗体结合。
[0039] 本公开内容的一些方面提供了在对象中监测肿瘤（例如，眼肿瘤和恶性痣 (malignant nevi))的方法，所述方法包括向该对象(例如，向该对象的眼部)施用本文中提 供的任一种病毒样颗粒(例如包含光敏分子(例如，荧光染料或红外染料）的病毒样颗粒）， 并检测肿瘤的位置。在一些实施方案中，所述方法包括通过用激光(例如紫外激光或红外激 光）照射该对象(例如，该对象的眼部)来检测肿瘤的位置。在一些实施方案中，所述方法包 括在施用病毒样颗粒之前鉴别怀疑患有肿瘤的对象。在一些实施方案中，所述方法包括通 过向患有或怀疑患有肿瘤的对象或对象的肿瘤施用光敏病毒样颗粒来诊断和/或治疗肿 瘤。
[0040] 本公开内容的另一些方面提供了选择性地抑制癌细胞增殖或杀伤癌性细胞而不 抑制非癌性(例如，正常、健康)细胞的增殖或生存力的方法，所述方法包括向对象的肿瘤 (例如，向该对象的眼肿瘤)施用本文中提供的任一种靶向肿瘤的病毒样颗粒(例如包含光 敏分子(例如红外染料)的病毒样颗粒），并通过使肿瘤经受红外激光(例如，在约660nm至约 740nm的波长和至少8焦耳的剂量下)来有效地辐照肿瘤的癌性细胞。
[0041] 在一些实施方案中，本公开内容提供了病毒样纳米颗粒(还称为病毒样颗粒），其 包含与乳头瘤病毒Ll蛋白（例如，牛乳头瘤病毒Ll蛋白）缀合的光敏分子。在一些实施方案 中，所述病毒样纳米颗粒的直径为20至60纳米（例如，10、25、30、35、40、45、50、55或60纳 米）。在一些实施方案中，病毒样纳米颗粒包含300至500个Ll(例如，BPV LI)衣壳蛋白，例如 360个Ll衣壳蛋白（例如，基于二十面体对称）。应认识到，在一些实施方案中，病毒样纳米颗 粒各自包含约 300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、 460、470、480、490或500个1^1(例如，8?￥1^1)衣壳蛋白。然而，在一些实施方案中，病毒样纳 米颗粒包含少于300个Ll (例如，BPV Ll)衣壳蛋白。
[0042] 在一些实施方案中，本公开内容提供了与100至1000个光敏分子(例如，100、200、 300、400、500、600、700、800、900或1000个分子)共价缀合的牛乳头瘤病毒病毒样纳米颗粒。 在一些实施方案中，牛乳头瘤病毒(BPV)病毒样纳米颗粒的衣壳蛋白包含BPV Ll衣壳蛋白 或BPV Ll和BPV L2衣壳蛋白的组合，或者由其组成。在一些实施方案中，光敏分子与病毒样 纳米颗粒(或者与病毒样纳米颗粒的衣壳蛋白）通过如下形成的共价键缀合:光敏分子中的 酯基团与衣壳蛋白中的胺基团反应，从而形成酰胺键。因此，在一些实施方案中，本公开内 容的病毒样纳米颗粒的衣壳蛋白与光敏分子通过酰胺键缀合。
[0043] 在一些实施方案中，本公开内容提供了包含300至500个BPV Ll衣壳蛋白并且/或 者直径为20至60nm的病毒样纳米颗粒，其中至少一些（例如，10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%或100%)与1至5个（例如，1、2、3、4或5个)光敏分子（例如，11?700染 料，例如lRDveK7〇〇DX)共价缀合(例如，通过酰胺键）。本公开内容还提供了产生病毒样纳 V 米颗粒的方法和将病毒样纳米颗粒作为诊断剂、治疗剂或预防剂施用于对象的方法。
[0044] 附图简述
[0045] 图1示出了使用与光敏分子缀合的病毒样颗粒(VLP)诱导细胞死亡的机制。
[0046] 图2示出了二价靶向（例如，通过抗体)和多价靶向（例如，通过VLP)的比较。
[0047]图3示出了显示VLP与细胞结合的特异性由硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG)相互作用介导并且受肝素抑制的图。其还示出了仅当光敏 VLP与细胞结合并且使细胞经受红外辐照时肿瘤细胞才被特异性杀伤。
[0048]图4示出了显示细胞死亡依赖于红外辐射的剂量以及所递送VLP和光敏分子（例 如，染料)的量的图。
[0049]图5示出了显示在与IR700缀合的VLP(在该图中指定为PsV)下在辐照之后的体外 卵巢癌细胞(SK0V-3)死亡的图。
[0050] 图6A示出了对对照VLP的电喷雾电离-飞行时间（electrospray ionization- time-of-f light，ESI-T0F)分析。图6B示出了对与1000个分子的IR700缀合的VLP(在该图中 指定为PsV)的ESI-TOF分析。
[0051 ] 图7A至70不出了人表皮生长因子受体阴性（human epidermal growth factor receptor 2 negative，HER2-)眼黑素瘤细胞系（92 · I)的细胞死亡的图，其对二价剂(例如， 抗体)和多价剂(例如，光敏VLP，还称为VLP缀合物，在该图中指定为PsV)的有效性进行比 较。
[0052] 图8A至80不出了人表皮生长因子受体阳性（human epidermal growth factor receptor 2 negative，HER2+)卵巢癌细胞系（SK0V-3)的细胞死亡的图，其对二价剂（例如， 抗体)和多价剂(例如，光敏VLP，还称为VLP缀合物，在该图中指定为PsV)的有效性进行比 较。
[0053] 图9示出了显示疫苗诱导的抗HPV16中和性抗体不阻断BPV*IR700 VLP与眼黑素 瘤细胞系92.1结合的图。
[0054] 图10A示出了lRJDye?7〇〇DX NHS酯的化学结构。图10B示出了Visudyu#的化学 结构，其中反应性羧基用圆圈标出。
[0055] 图11示出了反应方案，其涉及（1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐） (EDC)和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)介导的Visudy 116#和VLP的连接。在该方案 中，①代表'Visudyne'%并且②代表VLP。注意，有两条途径到达期望的终产物。磺基-NHS的 存在易于稳定反应并且增提高望产物的产生。
[0056] 图12示出了病毒样纳米颗粒与多种类型癌细胞结合之HSPG依赖性结合的代表性 样品的直方图，所述病毒样纳米颗粒包含HPV16衣壳蛋白、变体HPV16/31衣壳蛋白和BPVl衣 壳蛋白（L1，或Ll和L2蛋白）。
[0057] 图13A和13B示出了切除肿瘤组织在明视野（图13A)和荧光（图13B)中的图像，所述 切除肿瘤组织来自注射后12小时之经I 3BS注射的阴性对照小鼠、注射后12小时之经光敏病 毒样纳米颗粒注射的小鼠（#3和#4)和注射后24小时之经光敏病毒样纳米颗粒注射的小鼠 (#1和#2)。
[0058] 图14示出了对离体TC-I肿瘤样品中的肿瘤相关的总病毒样纳米颗粒相关荧光的 定量表示，所述样品切除于静脉内注射VLP后12和24小时(与图13相同的肿瘤）。
[0059]图15示出了实施例14的实验设计的示意图。
[0060] 图16A和16B示出了皮下92 · 1眼黑素瘤(ocular melanoma，0M)细胞在体内施用光 敏病毒样纳米颗粒(在该图中指定为NP)和光滴定后的细胞死亡百分比的图（光处理后24小 时测量的细胞生存力）。
[0061 ]图17A至17C示出了图16A和16B中所示的数据的原始直方图。
[0062] 图18(上面的组图）示出了从经皮下接种100μΙ PBS中的2 X IO5个TC-I肿瘤细胞并 经如下施用的动物获得的组织样品：（1)不处理；（2)100yg病毒样纳米颗粒(在该图中指定 为NP)，所述纳米颗粒由变体HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白装配且标记有丨RDye'jOODX [无光];(3汗83与501/〇112光；（4)20(^8病毒样纳米颗粒与501/〇112光；（5)10(^8病毒样纳米 颗粒与50J/cm 2光;和(6)50yg病毒样纳米颗粒与50J/cm2光。图18(下面的组图）示出了六种 测试条件各自的死亡细胞百分比。
[0063]图19A示出了实施例15中所述的实验的示意图。图19B示出了注射有病毒样纳米颗 粒(在该图中指定为纳米颗粒）的动物相对于对照(具有光）中的存活百分比的图。图19C示 出了各小鼠中的肿瘤体积(上面的组图）、"E7四聚体+CD8+T细胞"和"INF- γ分泌CD8+细胞"。 [0064]图20示出了来自效力测定的结果的图，所示效力测定比较了光敏BPV病毒样纳米 颗粒和光敏HPV病毒样纳米颗粒对细胞存活力的作用。
[0065]图21示出了来自结合测定的结果的图，所述结合测定比较了光敏BPV病毒样纳米 颗粒和光敏HPV病毒样纳米颗粒与细胞的结合。
[0066]图22示出了在用光敏病毒样纳米颗粒(在该图中指定为PsV)处理之后头颈癌细胞 的肿瘤生长曲线的图。
[0067]图23Α和23Β描绘了本公开内容的光敏病毒样纳米颗粒产生过程的实例（例如，如 实施例20中所述）。
[0068] 发明详述
[0069] 光动力学治疗（photodynamic therapy，PDT)是使用无毒的光敏分子的一种光治 疗形式，所述光敏分子当选择性地暴露于光时，变得具有毒性并且靶向和/或杀伤恶性细胞 以及其他患病细胞。PDT在治疗癌症中面临的挑战是将高浓度的光敏分子排他性地递送至 肿瘤细胞。为了实现靶向递送，可使用抗体，但是抗体由于其每个抗体2至8个光敏分子的递 送能力而受到的限制。此外，有重要的肿瘤缺乏鉴别出的肿瘤受体分子，并且因此不能用抗 体来靶向。因而，很多肿瘤仍然无法治疗(例如，眼黑素瘤）。另外，还在非肿瘤细胞的表面上 发现很多被抗体/染料缀合物靶向的分子(例如，EGFR)，从而导致不想要的脱靶效应。
[0070] 本公开内容部分地基于以下出人意料的发现:可将病毒样颗粒(VLP)(例如，乳头 状瘤VLP)(在本文中还称为病毒样纳米颗粒)化学修饰成携带很多光敏分子(例如，IR700) 而不丧失其靶向肿瘤的能力或结构稳定性。例如，在一些实施方案中，可将VLP化学修饰成 携带多于50个分子、多于100个分子，或多于1000个分子(或约1000个光敏分子）。由Ll，或Ll 和L2衣壳蛋白装配的病毒样颗粒可选择性地与癌细胞结合并感染癌细胞而不影响非癌性 细胞，从而使治疗的细胞毒性最小化(参见美国专利申请公开No. US20100135902A1，其整体 通过引用并入本文）。此外，在一些实施方案中，递送高量光敏分子/颗粒能够实现用极少量 的药物(例如，皮摩尔浓度)在光辐射之后选择性地杀伤肿瘤细胞。
[0071] VLP的关键细胞结合特征是衣壳蛋白（例如，LI)上存在大量的肝素结合位点。令人 惊奇地，光敏分子与表面氨基酸的缀合(例如，通过酰胺键与表面氨基酸例如表面赖氨酸残 基、精氨酸残基或组氨酸残基缀合)不破坏VLP与肿瘤细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG)的结合。尽管，本公开内容描述了光敏分子与衣壳蛋白的表面暴露肽的缀合，但是应 理解光敏分子可与衣壳蛋白的任何肽缀合。即，光敏分子可仅与Ll蛋白缀合或者与Ll和L2 蛋白的组合缀合。与光敏分子缀合的蛋白质和氨基酸残基可取决于病毒样颗粒的组成。
[0072] 前述发现对开发新的靶向癌症治疗具有重要的启示。例如，本公开内容的光敏VLP (还称为VLP缀合物)相对于具有非常有限递送能力的其他靶向分子(例如抗体)而言提供一 定的优势。另外，本公开内容的光敏VLP可用于靶向由于尚未鉴定到合适的肿瘤表面特异性 决定簇而不能通过抗体或其他革G向分子革El向的广泛多种肿瘤(例如，眼肿瘤）。此外，所述光 敏VLP可用于治疗远端转移。另外，所述光敏分子可用于诊断和治疗早期恶性或癌前期病变 (例如，转化性、恶化前或恶性眼痣）。
[0073] 本文中使用的"病毒样颗粒"（VLP)指有组织的衣壳样结构(例如，形状为大致球形 或圆柱形），其包含Ll或Ll和L2壳粒(capsomer)的自装配有序排列并且不含病毒基因组。病 毒样颗粒在形态和抗原性上类似于真正的病毒体(viron)，但是其缺乏病毒遗传物质（例 如，病毒核酸），从而使颗粒不具感染性。VLP可用于向接受者细胞递送药剂(例如，预防剂、 治疗剂或诊断剂）或者闭合的环状或线性DNA或RNA分子。应理解，术语"病毒样颗粒"或 "VLP"和"假病毒"或"PsV"在本文中可互换使用并且还可与术语"病毒样纳米颗粒"互换使 用。
[0074] 本文中使用的"祀向肿瘤的病毒样颗粒"指靶向肿瘤(例如，癌性)细胞但不靶向非 肿瘤(例如，非癌性，或正常、健康的)细胞的VLP(例如，在完好组织中）。
[0075]根据本公开内容的VLP相对于野生型乳头瘤病毒VLP而言可具有经修饰的免疫原 性和/或抗原性。所述VLP可例如由具有经修饰免疫原性和/或抗原性的变体衣壳蛋白的壳 粒装配。具有"经修饰免疫原性和/或抗原性"的变体衣壳蛋白是这样的衣壳蛋白，对其氨基 酸进行了天然或合成修饰(例如，突变、替换、缺失、聚乙二醇化或插入）以降低或阻止衣壳 蛋白被已有(例如，内源性)病毒血清型特异性抗体识别。变体衣壳蛋白可以是人乳头瘤病 毒(HPV)Ll变体、非人乳头瘤病毒Ll变体或基于来自不同HPV血清型之氨基酸组合的乳头瘤 病毒Ll变体。例如，具有经修饰免疫原性和/或抗原性的Ll变体可以是基于HPV血清型16和 HPV血清型31(在本文中称为"变体HPV16/31 Ll蛋白"-SEQ ID N0:1)的重组蛋白，其在国际 公布No.W0/2010/120266(其整体通过引用并入本文）中进行了描述。
[0076]在一些实施方案中，VLP是乳头瘤病毒VLP。所述VLP可以是人乳头瘤病毒VLP(例 如，来自于可感染人的病毒），然而在另一些实施方案中，所述VLP为非人乳头瘤病毒VLP。非 人VLP的实例包括由但不限于来自于以下的那些：牛乳头瘤病毒、鼠乳头瘤病毒、棉兔 (cotton-rabbit)乳头瘤病毒和猕猴或恒河猴乳头瘤病毒颗粒。在一些实施方案中，所述 VLP是牛乳头瘤病毒病毒样纳米颗粒(例如，1型病毒样纳米颗粒）（例如，由BPV Ll衣壳蛋白 或BPV Ll和BPV L2衣壳蛋白的组合装配）。
[0077]本文中使用的"衣壳蛋白"指其中一些形成壳粒低聚体的蛋白质单体。本文中使用 的"壳粒"指病毒衣壳的基本低聚体结构单位，其为保护病毒(例如，人乳头瘤病毒(HPV))的 遗传物质的外部蛋白质覆盖物。本公开内容的衣壳蛋白包括乳头瘤病毒Ll主要衣壳蛋白 (major capsid protein)和乳头瘤病毒L2次要衣壳蛋白（minor capsid protein)。在一些 实施方案中，本公开内容的VLP仅包含LI衣壳蛋白，而在另一些实施方案中，所述VLP包含LI 和L2衣壳蛋白的混合物(或组合）。
[0078]在一些实施方案中，病毒样颗粒中Ll衣壳蛋白的百分比大于该病毒样颗粒中L2衣 壳蛋白的百分比。例如，在一些实施方案中，病毒样颗粒中Ll衣壳蛋白的百分比为(病毒样 颗粒中的总衣壳蛋白数量的）80%至100%。在一些实施方案中，病毒样颗粒中Ll衣壳蛋白 的百分比为 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。 在一些实施方案中，病毒样颗粒中L2衣壳蛋白的百分比为(该病毒样颗粒中的总衣壳蛋白 数量的H %至25%。例如，在一些实施方案中，病毒样颗粒中L2衣壳蛋白的百分比为1 %、 2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、 19%或 20%。
[0079]在一些实施方案中，病毒样颗粒包含12至72个L2蛋白。在一些实施方案中，病毒样 颗粒包含360个Ll蛋白和12至72个L2蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白装配成直径为20至 60nm的病毒样纳米颗粒。例如，衣壳蛋白可装配成直径20、25、30、35、40、45、50、55或6011111的 病毒样纳米颗粒。
[0080] 本文中使用的"外衣壳蛋白"指暴露在VLP表面的衣壳蛋白。在一些实施方案中，外 衣壳蛋白（例如，Ll蛋白）与(例如，至少1个)光敏分子缀合。
[0081] 本文中使用的"光敏分子"指当选择性地暴露于光时变得"活化"（还称为"光活 化"）的无毒分子。在一些实施方案中，活化的光敏分子在光激发之后重新发射光(例如，荧 光团）。在一些实施方案中，活化的光敏分子在光激发之后可变得具有毒性或者可产生毒性 分子。例如，称为光敏剂的一类光敏分子在吸收光之后可跃迀到激发态并发生氧的系间跨 越(intersystem crossing)以产生单线态氧(singlet oxygen)。这种单线态氧迅速攻击其 遇到的任何有机化合物，因此高度细胞毒性的。
[0082]根据本公开内容的多个方面，光敏分子可与VLP的衣壳蛋白（例如，Ll和/或L2衣壳 蛋白）缀合。在一些实施方案中，所述光敏分子与VLP的衣壳蛋白共价缀合。在一些实施方案 中，所述光敏分子与VLP的衣壳蛋白的赖氨酸残基共价缀合。本文中可将与光敏分子缀合的 VLP称为"VLP缀合物"或"光敏VLP"。在一些实施方案中，所述光敏分子包含NHS(N-羟基琥珀 酰亚胺)酯基团，其与衣壳蛋白的胺基团（例如，赖氨酸或其他氨基酸的胺基团）反应以形成 共价酰胺键。
[0083] 光敏分子(photosensitive molecule，PM)与VLP的比例可变化。在一些实施方案 中，VLP:PM的比例为约1:10至约1:1000、约1:10至约1:500、约1:50至约1:500或约1:50至约 1:1000。即，在一些实施方案中，VLP可包含约10至约1000个光敏分子。在一些实施方案中， VLP:PM 的比例为1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:75、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1: 350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或 1:1000。在一些实施方案中，所述￥1^可包含10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、 400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个光敏分子。在一些实施方 案中，所述VLP可包含多于1000个光敏分子或少于10个光敏分子。
[0084] 1个以上光敏分子可与单个衣壳蛋白缀合。例如，单个衣壳蛋白（例如，Ll或L2衣壳 蛋白）可与1至5个(例如，1、2、3、4或5个)光敏分子缀合。因此，衣壳蛋白的一个以上氨基酸 可与光敏分子缀合。在一些实施方案中，单个衣壳蛋白可与1至2、1至3或2至3个光敏分子缀 合。因此，光敏分子可与单个衣壳蛋白的1、2、3、4或5个不同氨基酸（例如，赖氨酸、精氨酸 和/或组氨酸，或其他氨基酸)缀合。
[0085] 根据本公开内容使用的光敏分子的实例包括但不限于荧光染料、红外染料、近红 外染料、卟啉分子和叶绿素分子。
[0086] 根据本公开内容使用的荧光染料的实例包括但不限于：吖啶橙、吖啶黄、Alexa Fluor、7-氨基放射菌素 D、8-苯胺基萘-1-磺酸、ATTO染料、金胺-罗丹明染色剂、苯并蒽酮、 bimane、9, 10-双（苯基乙炔基）蒽、5，12-双（苯基乙炔基）并四苯、双苯酰亚胺 (bisbenzimide)、黑光漆、钙黄绿素、羧基荧光素、羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯、羧基荧 光素琥珀酰亚胺酯、1-氯-9,10-双(苯基乙炔基)蒽、2-氯-9,10-双(苯基乙炔基)蒽、2-氯-9,10-二苯基蒽、香豆素、DAPI、暗淬灭剂（dark quencher)、Di0C6、DyLight Fluor、Fluo_3、 ?1110-4、？1110?1'(^6、焚光素、异硫氰酸焚光素、焚光素图像引导的外科手术、；^1101'0-」3(16染 色剂、fura-2、fura_2-乙酰氧基甲基酯、GelGreen、GelRed、绿色焚光蛋白、七甲川染料 (heptamethine dye)、印度黄、Indo-I、萤光黄、萤光素、MCherry、部花青(Merocyanine)、尼 罗蓝、尼罗红、光学增白剂、二萘嵌苯（perylene)、焰红染料（phloxine)、藻胆素 (phycobilin)、藻红蛋白、藻红素、碘化丙锭、pyranine、罗丹明、罗丹明123、罗丹明6G、 RiboGreen、RoGFP、红焚稀（rubrene)、（E)-二苯乙稀、（Z)-二苯乙稀、磺基罗丹明101、磺基 罗丹明B、SYBR Green I、synapto_pHluorin、四苯基丁二稀、四钠三（红菲绕啉二磺酸盐）韦了 (Π )、德克萨斯红(Texas Red)、钛黄、TSQ、伞形酮(umbelliferone)、黄色荧光蛋白和YOYO-1〇
[0087] 根据本公开内容使用的光敏染料的实例包括但不限于：HpD、卟吩姆钠 (Photofrin?、Photogera_ V PhotosailHemporfin_)、m - τ H p c、替莫泊芬 (Foscan?)、维替泊芬（Visudyne?)、HPPH( photochlor?)、钯-细菌-脱镁叶绿 酸（Tookad?.)、5-ala、5氨基乙酰丙酸（.Levulan?)、5-ala甲酯（Metvix? )、.5_ ala节酯（Benzvix? )、5-ala己酯（.Hexvix?)、镥（π〗）-德卟啉或莫特沙芬-镥 (Lutex?、LuMn?、Angrin ⑨、Optrin? )、SnET2、本紫红素乙酯锡（IV) (Purlytin⑧、jPliotrex?)、NPe6、单-L-天冬胺酰基二氢卟酚e6、他拉泊芬钠 (Talporfm(i、Laserphyrinii )、B 〇 p p、硼化原卟啉（BOPP?:)、锌酞菁 (CGP5S847? )、硅酞菁（Pc4? )、磺化铝酞菁衍生物的混合物（Photosens? )、 ΑΤΜΡη、乙酰氧基-四（β-甲氧基乙基-)卟啉烯）、ΤΗ9402和二溴罗丹明甲酯。
[0088] 根据本公开内容使用的光敏染料的实例包括可用于荧光成像的那些（例如，近红 夕Knir)荧光染料），例如La JoiiaBluejv 和:IRl)ye、R7〇〇DX。
[0089] 本公开内容还提供了向患有肿瘤的对象施用包含与衣壳蛋白缀合之光敏分子的 靶向肿瘤的病毒样颗粒的方法，或向患有肿瘤的对象施用包含约50至约1000(例如，50、 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或 1000)个光敏分子之靶向肿瘤的病毒样颗粒的方法。
[0090] 在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物，例如人。
[0091] 施用模式可通过注射、输注、植入、表面施用或者通过通常用于递送病毒样颗粒的 任何其他方式。在一些实施方案中，根据注射区域使用空心针、包被针、微型针或显微操作 针。在一些实施方案中，施用模式通过注射到眼内空间中或者注射到眼玻璃体中（例如，以 靶向眼肿瘤或已转移到眼部的肿瘤）。
[0092] 可用于递送本公开内容的病毒样颗粒的试剂的试剂包括但不限于：盐水、MgCl2、 海藻糖、透明质酸钠、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或前述两种或更多种试剂的任意组合。
[0093] 本公开内容的光敏分子可在合适的波长下被活化。在一些实施方案中，所述光敏 分子的活化使其具有细胞毒性或者能够产生细胞毒性分子。合适的波长包括但不限于：紫 外波长、可见波长、红外波长或近红外波长。在一些实施方案中，所述光敏分子在600nm至 800nm或660nm至740nm的波长下被活化并且变得具有细胞毒性。在一些实施方案中，所述光 敏分子在以下波长下被活化并且变得具有细胞毒性：约600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、 650nm、660nm、670nm、680nm、690nm、700nm、710nm、720nm、730nm、740nm、750nm、760nm、 770nm、780nm、790nm或800nnu在一些实施方案中，所述光敏分子在小于600nm或大于800nm 的波长下被活化。用于光敏分子活化的合适波长将取决于所使用的具体分子。
[0094] 本公开内容的光敏分子根据所述分子的类型可通过红外光、近红外光或紫外光来 活化。例如，在一些实施方案中，可使用红外激光、近红外激光或紫外激光来活化VLP缀合物 的光敏分子。通过所述激光递送的能量的范围可以是约5J至约100J、约5焦耳(J)至约50J， 或约8J至约36J。在一些实施方案中，通过所述激光递送的能量为8J、9J、10J、11J、12J、13J、 14J、15J、16J、17J、18J、19J、20J、21J、22J、23J、24J、25J、26J、27J、28J、29J、30J、31J、32J、 33J,34J,35J,36J,37J,38J,39J,40J,41J,42J,43J,44J,45J,46J,47J,48J,49J,50J,51J, 52J、53J、54J、55J、56J、57J、58J、59J、60J、61J、62J、63J、64J、65J、66J、67J、68J、69J、70J、 71了、721、731、7封或751。在一些实施方案中，通过所述激光递送的能量为10几2(^、30了、 40J、50J、60J、70J、80J、90J或100J。
[0095] 可向光敏分子(或光敏VLP)施加光或激光约5秒至约5分钟。例如，在一些实施方案 中，向光敏分子施加光或激光5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55秒以活化所述分子。在 一些实施方案中，向光敏分子施加激光1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5分钟，或者更久。应理 解，向光敏分子施加光或激光的时间长度可根据例如该激光的能量(例如，瓦特数)而变化。 例如，可向光敏分子施加具有较低瓦特数的激光较长的时间以活化所述分子。
[0096] 可在施用VLP缀合物后约30分钟至约48小时向光敏分子(或VLP缀合物)施加光或 激光。例如，在一些实施方案中，在施用VLP缀合物后30、35、40、45、50或55分钟向光敏分子 施加光或激光。例如，在一些实施方案中，在施用VLP缀合物后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时向光敏分子施加光或激光。在一些实施 方案中，在施用VLP缀合物后36或48小时向光敏分子施加光或激光。
[0097]可直接向肿瘤部位施加光或激光。例如，可通过照射眼部来活化靶向眼肿瘤的VLP 缀合物。
[0098] 根据本公开内容，任何类型的肿瘤均可以是靶标。肿瘤的实例包括但不限于位于 眼部、肺、胸膜、肝、胰、胃、食管、结肠、乳腺、卵巢、前列腺、脑、脑脊膜、睾丸、肾、膀胱、头、 颈、子宫颈和/或皮肤的那些。
[0099] 在一些实施方案中，所述肿瘤是眼肿瘤。所述眼肿瘤可位于玻璃体、脉络膜腔、虹 膜、睫状体、巩膜、视网膜中央凹、视网膜、视盘或视神经。
[0100]在一些实施方案中，所述肿瘤是癌性或恶性的。在一些实施方案中，所述肿瘤是转 移性的。还可靶向其他肿瘤。例如，本申请提供了用于靶向子宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、黑素 瘤癌细胞、肺癌细胞、头和/或颈癌细胞以及膀胱癌细胞的方法和组合物。
[0101] 组合物
[0102] 在一些实施方案中，本公开内容的病毒样颗粒(病毒样纳米颗粒)是光敏分子缀合 的病毒样纳米颗粒。所述病毒样纳米颗粒包含来自乳头瘤病毒的一种或两种类型的衣壳蛋 白。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白是经修饰的。衣壳蛋白通常自装配成直径为约55nm的 "空"原衣壳(proto-capsid)(例如，包含空核心的类球形颗粒）。在原衣壳成熟形成病毒样 纳米颗粒(病毒样颗粒)之后，随后使病毒样纳米颗粒与光敏分子(例如，IR700染料，例如 m.[)yew)700DX，由U-COlf制造的红外染料)化学缀合。
[0103] 在一些实施方案中，所述光敏病毒样纳米颗粒提供在一次性使用小瓶(例如，硼硅 酸盐玻璃小瓶）中的无菌溶液(例如，1或2ml)中。在一些实施方案中，所述光敏病毒样纳米 颗粒在无菌水溶液中提供，所述无菌水溶液任选地包含似(：1、1((：1、他册〇4.2!1 20、1(趾〇4或者 前述两种或更多种的任意组合。在一些实施方案中，NaCl可以以400至600mMol(例如， 500mMol)的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，KCl可以以2至6mMol(例如，2.7mMol)的 浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，Na 2HP〇4.2H20可以以5至15mMol (例如，IOmMol)的浓 度存在于溶液中。在一些实施方案中，KH2PO4可以以1至3mMol (例如，2mMol)的浓度存在于溶 液中。
[0104] 在一些实施方案中，光敏病毒样纳米颗粒是经稀释的并且使用通常用于眼科操作 的无菌的注射器或针来眼内施用。本公开内容还提供了其他施用途径和向其他肿瘤和/转 移瘤施用，如本文中的其他部分所述。
[0105] 在一些实施方案中，每个病毒样纳米颗粒包含12至72个壳粒，其中每个壳粒包含5 分子的Ll衣壳蛋白（例如，每分子为55至56kD)和1分子的L2衣壳蛋白（例如，每分子为 52kD)。在一些实施方案中，每个病毒样纳米颗粒包含12至72个壳粒，其中每个壳粒仅包含 Ll衣壳蛋白（例如，每个壳粒5分子Ll蛋白）。
[0106] 在一些实施方案中，每个病毒样纳米颗粒具有10至1000个分子(例如，500个分子） 的光敏分子(IR700染料，例如丨:RDye K'7〇〇DX)与蛋白质的至少一个氨基酸(例如，赖氨酸氨 基酸)化学缀合(例如，通过酰胺键）。
[0107] 产生病毒样颗粒的方法
[0108] 为了产生本公开内容的光敏病毒样纳米颗粒，可将哺乳动物细胞(例如293T细胞 (例如，HEK293F细胞））培养(例如，悬浮培养)并用编码BPV或HPV Ll(或者Ll和L2)衣壳蛋白 的核酸瞬时转染。这诱导形成原衣壳（例如，如Buck等Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19,2007年12月中所述）。在细胞团回收和破碎之后，可用benzonase 处理对原衣壳进行宿主DNA清除并使其经受随后的体外成熟过程以形成稳定的病毒样纳米 颗粒。在纯化之后，可使病毒样纳米颗粒与光敏分子(例如，IR700 NHS酯)化学缀合以产生 光敏病毒样纳米颗粒。图23示出了本文中提供的产生过程的一个实例的示意性图示。
[0109] 因此，在一些方面，本文中提供了产生光敏分子的方法，其包括(a)用编码一种或 更多种衣壳蛋白的核酸瞬时转染细胞，从而形成原衣壳，（b)收集原衣壳并使原衣壳经受体 外成熟过程，从而形成稳定的病毒样纳米颗粒，以及(C)使病毒样纳米颗粒与50至1000个光 敏分子缀合。在一些实施方案中，所述病毒样纳米颗粒与500个光敏分子缀合。在一些实施 方案中，所述病毒样纳米颗粒通过酰胺键与光敏分子缀合(例如，通过光敏分子的酯基与病 毒样纳米颗粒衣壳蛋白的氨基酸的胺基团反应）。 实施例
[0110] 实施例 1-//?/_>% K700DX 的缀合
[0111] VLP(例如，包含变体HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之组合的病毒样纳米颗粒)与 光敏分子(例如，丨:RI)yefi700DX)的化学缀合操作如下。通常来说，使VLP的溶液以lmg/ml的 浓度维持在PBS，pH = 7.2和0.3至0.5M NaCl中。IR700(例如，IRDye:?700DX)分子作为干 NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯(NHS-酯与蛋白质上的胺基团反应以形成共价酰胺键）（图10A) 由生产商供应。蛋白质上的可利用胺基团是蛋白质的氨基末端或氨基酸(例如，赖氨酸)上 的ε_氨基。将干燥固体IR700-NHS酯以5mg/ml的浓度溶解于DMSO中并冷冻储存。通常来说， VLP:染料的不同比例通过将不同量的IR700-NHS与固定量的VLP(通常为Iml的I3BS中的Img/ ml溶液)混合来实现。典型的比例和IR700-NHS的量列于下表中： 「01121 券1
[0114] 为了实现200:1的比例，将Iml的PBS中的lmg/ml VLP与3.2μ1 IR700-NHS酯溶液混 合。使这些反应在室温下进行2至4小时。在反应完成之后，通过肝素亲和柱色谱纯化VLP以 使未结合的IR700-NHS与新形成的VLP-IR700缀合物(还称为光敏VLP)分离。
[0115] 实施例2_衫畑办财?的缀合
[0116] Visudynea^VLP的缀合遵循略不同于IR7OO-NHS的方案。Visudyne*分子需要 在缀合至VLP之前与NHS进行官能化。该官能化通过使用EDC(1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙 基)碳二亚胺盐酸盐)来实现。EDC用于官能化具有游离羧酸分子的分子，例如Vimidyne ii (参见图10B，用圆圈标出），并且在磺基-NHS存在下有效地将NHS部分转移至该试剂。该反应 方案概括于图11中。简言之，使约2mM EDC和2 X摩尔过量的磺基-NHS与不同量的 Visudyne#反应。在于室温下15分钟之后，通过添加2-巯基乙醇直至2〇mM的终浓度来停止 反应。将该反应混合物添加至PBS，pH=7.2+0.3-0.5M NaCl中的lmg/ml浓度的Img VLP并在 室温下孵育2至4小时。最后，通过肝素亲和柱色谱使未反应的组分与VLP缀合物分离。
[0117]实施例3-VLP结合特异性由HSPG介导并且受肝素的抑制。
[0118] 在以下条件下处理悬浮的SK-0V-3细胞:无 VLP(例如，包含变体HPV16/31 Ll蛋白 和!^1^蛋白之组合的病毒样纳米颗粒），与人丨6\3卩1|101'1<丨88(图3/1488*?^"）或 IR700(图3，"11?700*?^"）缀合的￥1^，或在批?6存在下孵育的相同￥1^缀合物。在孵育之 后，使这些培养物经受4焦耳的690mm近红外光。未经光辐照细胞的平行组用作对照。在辐照 之后，评估培养物的细胞死亡程度。图3显示显著细胞杀伤的唯一条件是细胞暴露于 IR700* PsV和4焦耳的光。在暴露于AF488* PsV下未观察到类似的细胞死亡，表明细胞死亡 是IR700染料缀合物特异性的。此外，在HSPG存在下细胞死亡几乎完全消除，表明VLP与细胞 的结合对于IR700介导的细胞死亡是至关重要的。
[0119] 实施例4-细胞死亡取决于红外辐射以及VLP和IR700的量。
[0120]用不同浓度的VLP(例如，包含变体HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之组合的病毒 样纳米颗粒）处理悬浮的SK-0V-3细胞，所述VLP已缀合有不同量的IR700染料（例如， IRDyeil^OODX)。使用未与IR700染料缀合的VLP作为对照。在孵育之后，使这些培养物经受 0或16焦耳的690nm近红外光。在光处理之后，评估细胞死亡的程度。图4显示细胞死亡依赖 于IR700染料的存在和光处理二者。这得到以下观察结果的支持:细胞死亡依赖于VLP浓度 和IR700染料缀合比例二者。
[0121] 实施例5-SK0V-3细胞在经与IR700缀合的VLP处理之后于辐照后的体外细胞死亡。
[0122] 将SK0V-3卵巢癌细胞平板接种在24孔板上并用两种不同浓度的光敏VLP颗粒(例 如，与IR700染料缀合之包含变体HPV16/31L1蛋白和HPV L2蛋白之组合的病毒样纳米颗粒） (2.5yg(红)和0.25yg(蓝））在37°C下处理1小时。在结合之后，将细胞洗涤，随后用4J的光处 理。基于对LDH释放的酶促评估来确定细胞死亡(通过测量490nm下的吸光度来确定）。分别 测试三种不同摩尔比的VLP: IR700缀合：1:500、1:1000和1:2000。图5显示对于这两个受试 浓度而言，均在1:1000的VLP: IR700( "PsV: IR70"）比例下观察到最大的细胞死亡效力。使用 去污剂介导的细胞裂解作为阳性对照。
[0123] 实施例6-IR700_PsV复合物的结构评价
[0124] 图6示出了对对照VLP(PsV) (A)和IR700缀合的VLP(PsV) (B)的ESI-TOF分析。在图 6B中，将反应设置成实现每个VLP(PsV)分子与1000个IR700分子缀合。ESI-TOF扫描中的信 号尖峰对应于VLP Ll蛋白。相对于对照样品，在缀合样品中观察到5517amu的转移，所述缀 合样品对应于平均3个缀合IR700分子（1840amu)/Ll蛋白或者约1000个IR700分子/VLP(通 常来说，每个VLP具有360个Ll)。
[0125] 实施例7-药剂结合决定在眼黑素瘤细胞系中细胞死亡的程度。
[0126] 使悬浮的眼黑素瘤细胞系(92.1;HER2J暴露于不同稀释度之与IR700染料(例如， IRDyeii 700DX)缀合的Herceptiliii抗体或与IR7〇〇染料缀合的VLP (例如，包含变体 HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之组合的病毒样纳米颗粒）。然后，评估平行培养物的药剂 结合（图7C)或者在不存在（图7B)或存在（图7A)16焦耳的690nm近红外光下的细胞死亡。图 7C显示VLP与92.1眼黑素瘤细胞的结合具有浓度依赖性，而基本不存在Herceptiiili!抗体 结合。图7B显示，在光不存在下，无细胞死亡。图7A显示仅在经光敏VLP处理的细胞中的浓度 依赖性细胞死亡。
[0127] 实施例8-药剂结合决定在卵巢癌细胞系中细胞死亡的程度。
[0128] 使悬浮的SK-0V-3细胞(HER2-)暴露于不同稀释度之与IR700染料(例如，IRDve wi V 700DX)缀合的Herceptin8抗体或VLP颗粒(例如，包含变体HPVl6/31 Ll蛋白和HPV L2蛋 白之组合的病毒样纳米颗粒）。然后，评估平行培养物的H:erceptin#SvLP结合（图8C)或 者在不存在（图8B)或存在（图8A) 16焦耳的690nm近红外光下的细胞死亡。图8C显示，VLP结 合在sk-ov-3细胞中达到饱和。.Herceptin #结合也是浓度依赖性的，但是相对于VLP而言 程度降低。图8B显示，在不存在光下，无细胞死亡。图8A显示在两种条件下均具有浓度依赖 性细胞死亡，但是与结合类似，在VLP下响应饱和，而在.Hereeptin iil下细胞死亡出现浓度 依赖性提高。这些数据表明，与IR700缀合的VLP(PsV-IR700)比与IR700缀合的 1161^只付11^(1161^印1^11-11? 7〇0)更有效。
[0129] 实施例9-疫苗诱导的抗HPV16中和性抗体不阻断BPV* IR 700 VLP与眼黑素瘤细 胞系92.1的结合。
[0130] 测试含有不同抗体的血清样品抑制光敏VLP颗粒(例如，HPV16 VLP或BPV VLP)与 92.1眼黑素瘤细胞系结合的能力。图9显示"无血清"或"首次用于实验的血清"（na'ive serum)条件不含中和VLP结合的活性。此外，观察到的阻断活性对病毒血清型具有特异性。 即，仅与IR700染料缀合的人乳头瘤病毒样颗粒(HPV16-IR700)被含HPV16抗体的血清中和。 与IR700缀合的牛乳头瘤病毒样颗粒(BPV-IR700)不会被含HPV16特异性抗体的血清中和。
[0131] 实施例10-免疫原性评价
[0132] 在与实施例9中所述类似的研究中，通过连续稀释含有针对HPV16或BPV之抗体的 血清来确定中和效价。表2中所述的结果显示针对HPV16的抗体仅中和HPV16。此外，针对BPV 的抗体仅中和BPV。因此，不存在HVP16抗体对BPV以及BPV抗体对HVP16的交叉反应性。
[0133] 表2
[0135] 实施例11-结合研究
[0136] 该实施例的目的是评估病毒样纳米颗粒与多种类型癌细胞的结合。所述病毒样颗 粒包含人乳头瘤病毒16(HPV16)衣壳蛋白、变体HPV16/31 Ll衣壳蛋白和牛乳头瘤病毒 (BPV)衣壳蛋白。另外，对含有Ll和L2衣壳蛋白或者仅含Ll衣壳蛋白的病毒样纳米颗粒进行 测试以确定病毒样纳米颗粒与癌细胞的结合是否依赖于L2。该研究的结果显示BPV病毒样 纳米颗粒和HPV病毒样纳米颗粒具有相当的结合。
[0137] 对一大组细胞系进行筛选，其包括:杂细胞系（例如，293TT、HaCaT、PAM_212和TC-l)、子宫颈细胞系（例如，HeLa、SiHa、CaSki和C-33A)、卵巢细胞系（例如，M0SEC、SHIN-3、SK-0￥-3、肝-3 45-2、厶2780、0￥〇厶1?-3和(^^1?-4)、黑素瘤细胞系（例如，816卩10、51(]\^1^-2、 SKMEL-5、SKMEL-28和UACC)、眼黑素瘤细胞系（例如，92.1、MKT-BR、0CM-1 和UW-I)、肺细胞系 (例如，NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460 和 NCI-H522)、头颈细胞系（例如，CAL-33(HPV-)、FaDu (HPV-)、HSC-3(HPV_)、SNU-1076(HPV_)、UM-SCC-47(HPV+)、UPCI-SSC-90(HPV+)和UPCI-SCC-154 (HPV+))，以及膀胱细胞系（例如，5637、J82、RT112、SCaBER、SVHUC、T24、UMUC-3、 UMUC-5)。
[0138] 在实验之前，使病毒样纳米颗粒与AlexaFlu〇r488缀合使得容易且直接地分析病 毒样纳米颗粒与细胞表面的结合。使用不干扰结合的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯化学来使 AlexaFluor488与病毒样纳米颗粒连接。在10μg/ml、lμg/ml和0. Ιμ/ml的浓度下测试每种病 毒样纳米颗粒。
[0139] 对细胞进行胰蛋白酶处理以将其从组织培养板的塑料表面移除，洗涤并允许在摇 动台上于生长培养基中在37°C下复苏4小时。然后，将细胞洗涤，计数并以IX IO5个细胞/孔 置于96孔圆底板的磷酸缓冲盐水(PBS)/2%胎牛血清(FBS)中。将病毒样纳米颗粒以100μΙ PBS/2%FBS的终体积添加至细胞。还向孔添加经与肝素预孵育的病毒样纳米颗粒（lmg/ml， 1小时，4°C )，作为对照。然后，将细胞和病毒样纳米颗粒在4°C下孵育1小时（在暗处），用 PBS/2% FBS洗涤两次并用4%多聚甲醛在室温下固定15分钟。最后，将细胞再次洗涤，重悬 于200μ1 PBS/2% FBS中并使用BD FACSDIVA?(BD Biosciences，San Jose，CA)和FlowJo软 件在BD FACSCANTO? II(K) Biosciences，San Jose，CA)上进行分析。
[0140] 使用 TC-l、HeLa、SK-0V-3、SKMEL-28、92.1、NCI-H322M、HSC-3、UPCI-SCC-15^PT24 细胞系的结果以直方图示于图12中。由图12可以明显看出：在结合测定中，所有的病毒样纳 米颗粒不管其血清型或组成(LI相对于L1/L2)都与癌细胞结合。此外，肝素竞争结合，表明 病毒样纳米颗粒结合是特异性且HSPG依赖性的。
[0141] 实施例12-生物分布时间过程
[0142] 该实施例的目的是评估病毒样颗粒在静脉内注射到荷瘤动物之后肿瘤的定位和 清除的时间过长。
[0143] 纯病毒样纳米颗粒通过用IR700染料(例如，IRDye?700DX)以1:500的病毒样纳 米颗粒:染料比例标记病毒样纳米颗粒(例如，包含变体HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2之组合 的病毒样纳米颗粒)来制备。光敏病毒样纳米颗粒使用0PTIPREP?密度滴度介质通过密度梯 度超速离心来纯化。
[0144] 在05781/6白鼠中通过皮下注射10(^1?83中的2\105个1'(：-1癌细胞来产生肿瘤。 约两周之后，将动物随机分成处理组。通过静脉内注射使荷瘤动物接受I 3BS或200yg光敏病 毒样纳米颗粒(1〇〇μ1体积）。在注射后12或24小时，对动物实施安乐死。在安乐死之后，收获 肿瘤组织并对IR700染料(例如，IRDye?700DX)的荧光进行成像，其指示光敏病毒样纳米 颗粒的存在。
[0145] 图13B显示从12小时和24小时两个时间点获得的肿瘤组织中均具有可检出的 IR700染料(例如，IRDye? 700DX)荧光，而在PBS对照（12小时时间点）中未检测到荧光。月中 瘤组织中的定量总荧光绘制于图14中所描绘的图中。
[0146] 实施例13-生物分布时间过程
[0147] 该实施例的目的是评估病毒样颗粒在静脉内注射到荷瘤动物之后肿瘤的定位和 清除的时间过程。
[0148] 将经纯化的病毒样纳米颗粒在裂解物中用AlexaFluor488标记并使用0PTIPREP? 密度滴度介质通过密度梯度超速离心进行纯化。
[0149] 在白化C57B1/6小鼠中通过皮下注射100μΙ PBS中的2X105个TC-I癌细胞来产生 肿瘤。约2周之后，通过静脉内注射以100μΙ的体积递送200yg光敏病毒样纳米颗粒。在注射 光敏病毒样纳米颗粒之后于以下时间点收获肿瘤4=1、2、4、8、12、24、48和72小时。在收获 之后，将肿瘤碎片冷冻以用于显微镜评估。对于该显微镜评估，对组织切片进行进一步染 色。将针对HPV16的兔多克隆血清与AlexaFluor-488二抗联合使用。将血管用大鼠抗⑶31抗 体和抗大鼠 AlexaFluor-594二抗共染色。将细胞核用DAPI突出显示。
[0150] 数据(原位图像未示出）证明在1-小时时间点存在光敏病毒样纳米颗粒。信号的定 位显示与血管中相关。最高染色水平显示出现在8小时时间点，并且在8小时时间点光敏病 毒样纳米颗粒显示正从血管中向肿瘤细胞扩散。最后，在24小时和48小时时间点，显示肿瘤 中具有很低的病毒样纳米颗粒信号。
[0151] 实施例14-全身性施用后的体内效力
[0152] 设计该实施例中所示的研究以测量单次处理后24小时的肿瘤生存力。该研究建立 了长期体内研究的指导方案。
[0153] 完整的研究设计示于图15中。根据肿瘤大小的范围，将动物随机分配成使得大和 小肿瘤在每个组(η = 3，盐水处理组;η = 5，IR700(例如IRDye?7〇〇DX)-光敏病毒样纳米颗 粒处理组）中平均分布。在光处理前12小时静脉内施用病毒样纳米颗粒。测试100微克（100μ g)和200yg剂量。光处理包括25J(在400mW下62.3秒)或50J(在400mW下125秒）。24小时之后， 收获肿瘤并使用胶原酶和DNA酶进行处理以产生单细胞悬液。然后，施用BD 黄色染色剂，并将细胞放置通过FACSCANT0? π。数据作为死细胞的百分 比来报道，如Pacific orange通道中的焚光位移所指示的（图16Α)。
[0154] 2 0 0 μ g单剂量的I R 7 0 0 (例如，IRBye? 700DX)光敏病毒样纳米颗粒 (nanoparticle，NP)在用50J的光处理之后能够杀伤大部分的肿瘤细胞（图16B和图17C)。当 用25J的光处理肿瘤时，200yg NP下的杀伤水平降低接近一半（图16B和图17B)。IOOyg的NP 在25J光下不足以诱导杀伤（图16B和图17B);然而在50J剂量下观察到一定程度的肿瘤死亡 (图16B和图17C)。该研究为体内研究提供了必需的IR700(例如，:丨RDyf 700DX)光敏病毒 样纳米颗粒和光剂量信息。
[0155] 实施例15-免疫系统活化研究
[0156] TC-I肿瘤模型能够在免疫活性动物中检测用病毒样纳米颗粒处理之后的抗肿瘤 免疫诱导。TC-I肿瘤系由经HPV16癌基因 E6和E7以及表达C-Ha-Ras的突变基因永生化的 C57B1/6肺上皮细胞发展而来(Lin KY，等，Cancer Research. 56( 1): 21-6，1996)。这些细胞 可皮下植入或者，对于研究转移模型，其可静脉内注射以将细胞接种在肺中。近二十年来， 这些细胞已用于测试E6和E7治疗性疫苗的效力。E7以C57B1/6为背景具有独特的MHC I类表 位，已表明如果可引发针对它的CD8 T-细胞应答，则其具有保护性（H-2Db，aa 49-57 RAHYNIVTF)(Feltkamp MC，等European Journal of Immunology.23(9):2242-9,1993)。可 如下检测这些应答:对细胞进行四聚体染色并用肽重新刺激细胞，之后进行细胞内细胞因 子染色。
[0157] 剂量响应研究：向动物皮下接种100μΙ PBS中的2 X IO5个TC-I细胞。在接种后约两 周，将动物随机分成六组：（1)无处理对照；（2)无光的IOOyg病毒样纳米颗粒（标记有 IRDye?700DX且包含变体HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白的组合)对照；（3)PBS与50J/cm2 光对照；（4)200yg病毒样纳米颗粒与50J/cm2光；（5)100yg病毒样纳米颗粒与50J/cm2光;和 (6) 50yg病毒样纳米颗粒与50 J/cm2光。通过静脉内注射使小鼠接受100μΙ体积的PBS或病毒 样纳米颗粒，并在12小时后使用690nm激光向肿瘤施加光。24小时后将肿瘤收获，消化以产 生单细胞悬液并用生存力染色剂染色以测量死细胞的百分比（图18，上方）。
[0158] 高剂量组中的几只动物经历与肿瘤溶解综合征（tumor lysis syndrome)相关的 症状，这可能归因于大量且迅速的肿瘤坏死并且细胞内成分释放到动物的系统中。尽管 "lOOyg病毒样纳米颗粒与50J/cm 2光"组中没有死亡，但是该组中的小鼠的确展现出一些疾 病体征（图18,上方）。"无光的IOOyg纳米颗粒"和"PBS与50J/cm 2光"组未展现出疾病体征， 表明所观察的响应是由病毒样纳米颗粒和光的组合引起的。总之，接受病毒样纳米颗粒和 光的所有组中均具有明显的坏死。所有组中均发生最大杀伤并且未观察到剂量响应(图18， 下方）。
[0159] 存活研究：向动物皮下接种100μΙ PBS中的2X IO5个TC-I细胞。在接种后约2至3 周，将动物随机分成处理组(25yg病毒样纳米颗粒)和安慰剂组(仅PBS)。使小鼠接受两轮处 理，相隔三天。认为以下为一次处理:单次静脉内注射1〇〇μ1的25yg病毒样纳米颗粒或无菌 1^，12小时后使用69〇11111激光以5(^/〇11 2进行光处理。每3至4天测量肿瘤大小，并且当动物 的肿瘤大小达到> 1500mm3时（图19A)，对其实施安乐死。
[0160] 在肿瘤小于500mm3的动物中，用病毒样纳米颗粒处理能够延迟生长或辐射肿瘤 (图19B和19C)。在安慰剂组中，对肿瘤生长动力学无作用。开始时具有最小肿瘤的两只动物 在第一次处理的7天内未表现出肿瘤迹象，并且有三只动物表现出肿瘤减小的迹象（图 19C)〇
[0161] 免疫学研究:对于免疫学读出，在第0天(第一次处理之前）、第10天和第17天收集 血液。裂解红细胞并将剩余的细胞分成两半，一半对细胞表面标志物(⑶62L、⑶127、⑶103、 CD69、CD4、CD8、CD3、H2-DbE7(49-57)四聚体)进行染色。将另一半用HPV16E7肽49-57重新刺 激4.5小时，之后用针对⑶4、⑶8和IFN- γ的抗体以及生存力染料进行染色以区别活细胞。
[0162] 在肿瘤生长受控的两只动物的血液中，可检测到"Ε7四聚体+CD8+T-细胞"和"INF-γ分泌性CD8+细胞"（在用Ε7肽重新刺激之后)二者，表明已引发潜在的抗肿瘤响应(图19)。
[0163] 实施例16-组织学分析
[0164] 光敏病毒样纳米颗粒(例如，与IR700染料缀合的包含变体HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之组合的病毒样纳米颗粒)在组织学水平的作用使用鼠异种移植模型进行评估。简 言之，将1.5 X IO6个92.1葡萄膜黑素瘤(uveal melanoma)细胞植入到nu/nu小鼠后胁的皮 下间隙中。允许肿瘤达到约200mm3,此时通过静脉内注射200yg光敏病毒样纳米颗粒来处理 动物。在注射光敏病毒样纳米颗粒后12小时，用50J/cm 2的690nm近红外光辐照肿瘤部位。再 24小时之后，对动物实施安乐死，将肿瘤组织切除，在福尔马林中固定，进行石蜡包埋和处 理以用于标准组织学检查。
[0165] 苏木精和伊红(H&E)图像揭示:相比较于未处理组具有高度坏死（图像未示出）。当 与对照肿瘤相比时，经光敏病毒样纳米颗粒和激光处理的肿瘤具有苍白外观。通过在较高 放大倍数下进行检查，经光敏病毒样纳米颗粒处理肿瘤的细胞与经对照处理的肿瘤相比表 现出显著的细胞质损失。另外，坏死程度覆盖整个肿瘤，从而得出NIR光穿透通过整个肿瘤 组织深度的结论。
[0166] 实施例17-葡萄膜黑素瘤的原位异种移植模型中的病毒样纳米颗粒活性
[0167] 最常见的眼部原发性恶性肿瘤是葡萄膜黑素瘤(UM)。在美国，每年出现约2,000位 患者，而在欧洲发生得更为频繁。尽管对UM存在数种治疗选择，但是没有哪种治疗能可靠地 控制肿瘤生长、保护视力并且使辐射相关副作用的发生最小化。
[0?68]病毒样纳米颗粒光治疗(phototherapy，PT)是一种新的分子祀向性癌症治疗，其 涉及需要施用药物和光活化二者的两阶段过程。病毒样纳米颗粒PT的药物部分是与 IRDye?7〇〇DX(用作光敏化剂的一种近红外(NIR)酞菁染料)缀合的光敏病毒样纳米颗粒 (NP)，之后施加设计成治疗患有原发性葡萄膜黑素瘤之成人的非热NIR光。
[0169]在本研究中，在葡萄膜黑素瘤的原位异种移植模型中对光敏病毒样纳米颗粒的抗 癌活性进行评价。在该模型中，将人葡萄膜黑素瘤细胞植入免疫抑制兔的脉络膜腔中，并允 许其生长。当通过眼底检查(fundoscopy)可观察到肿瘤时，将动物分配成处理组或对照组。 在两种情况下，均通过眼底检查和超声追踪动物的进行性肿瘤生长或对处理的响应。在研 究结束之后，还通过大体病理学和组织病理学检测携带肿瘤的眼部。
[0170]该研究使用总共20只植入有92.1葡萄膜黑素瘤细胞系的兔来进行。总计，20只动 物中有11只发生肿瘤。有两只动物在处理之前的随访期期间意外死亡;将这些动物用作未 处理对照。未经激光处理的几只动物具有额外的眼肿瘤;将些动物用作内对照。将前房中具 有肿瘤的动物从研究中排除。
[0171] 与对照动物相比，所有的经处理肿瘤均表现出主要肿瘤响应，这通过眼底检查、大 体病理学和组织病理学评价得到证明。邻近肿瘤的视网膜组织不受处理的影响。
[0172] 综上所述，基于在施用光敏病毒样纳米颗粒并施用激光之后观察到的肿瘤响应和 坏死的程度，本文中提供的治疗方法可用于治疗葡萄膜黑素瘤。
[0173] 研究时间表:两个处理组：1)全肿瘤处理;2)无处理。
[0174] 表3
[0176] 方法和实验设计：
[0177] 测试体系
[0178] 表4
L 0180」 模型
[0181] 细胞培养
[0182] 人葡萄膜黑素瘤细胞系92.1(由Jerry Y博士Niederkorn，University of Texas Southwestern Medical Center ,Dallas，TX惠赠)在完全培养基(具有 10% 胎牛血清、IOOU/ mL青霉素 G、250ng/mL两性霉素 B和100yg/mL链霉素溶液的RPMI-1640)中在5 % CO2中于37 °C 下进行培养。
[0183] 动物和免疫抑制诱导
[0184] 本研究使用平均初始体重为约3kg的新西兰白兔。通过每日皮下注射环孢素 A (CsA;山地明50mg/mL;Novartis Pharmaceuticals ,Cambridge，MA，USA)来免疫抑制兔。在 整个实验期间维持CsA施用以防止自发性肿瘤消退。剂量方案为:细胞接种前每天15mg/kg， 持续3天，此后持续4周，之后是每天10mg/kg，直至实验结束。根据兽医的判断进一步减少剂 量。根据每只动物的体重每日调整CsA剂量。每日测量体重，并将其张贴在圈养兔的房间中。
[0185] 在随访期间，每日监测动物的CsA毒性症状，例如牙龈肥大、垂涎、腹泻和体重减 轻。如果动物表现出CsA毒性的早期征象(例如，食欲不振），则立即针对支持性管理而咨询 兽医人员，例如食欲刺激物和GI活动力增强剂。还可根据兽医的建议考虑调整注射剂量。
[0186] 细胞植入
[0?87] 在CsA处理后的第3天，通过肌内注射氯胺酮(40mg/kg)和甲苯噻嗪（6mg/kg)来麻 醉动物。在麻醉之后，向右眼施用1至3滴的0.5%盐酸丙美卡因，并使用弯曲的套管将1.0 X IO6个92. 1人葡萄膜黑素瘤细胞以100μ1悬液的体积注射到兔右眼的脉络膜上腔 (suprachoroidal space)中。简言之，在眼上放置消毒帷帘以避免任何毛发或睫毛污染，并 用10 %聚维酮碘(betadine)溶液清洁结膜。接下来，在眼肌下使用缝合线来使眼睛向前转 动，并在将结膜切开之后，从角膜缘（limbus)约IOmm进行巩膜切开术。然后，将套管插入到 巩膜切口（slerotomy)(其长度的1/3至1/2)中并将细胞（100yL，含有1.0 X 10-6个细胞)注 射到脉络膜上腔中。缓慢地取回针，并绷紧闭合巩膜切口的缝合线以确保注射部位发生最 低回流。在外科手术伤口上施用一滴抗生素眼用溶液(红霉素软膏）以防止感染。
[0188] 圈养、饲料、水和环境条件、适应环境
[0189] 在分组圈养中，将动物以每组6只圈养并随意供给新鲜、可口且营养充分的食物。 随意提供干净、可饮用且未经污染的水。将环境控制设置为温度维持在22±4°C(68±5°F)， 并且相对湿度为50% ± 20%。维持12小时的光照/黑暗周期。在动物到达设施(faciIity)之 后，使其适应环境至少5天，之后进行基线评价。在基线眼底检查评价之后，将动物分配到测 试组。
[0190] 受试品和对照品
[0191]表5:受试品的载剂
[0197] 剂量制剂的制备
[0198] 将受试品在无菌注射用水中以1:1稀释。
[0199] 受试品/对照品的施用
[0200] 给药:光敏病毒样纳米颗粒或盐水通过眼内注射到玻璃体中来施用。
[0201]激光施用：激光处理使用具有Coherent Opa] :Ph〇t〇aCtivat〇r?激光器的狭缝 灯系统来施加，所述激光器在83秒的持续时间内以600mW的功率递送690nm光，总能量密度 (f Iuence)为50 J/cm2。激光斑点尺寸设定为5mm的直径并且这样，大于该尺寸的肿瘤用重叠 斑点进行激光处理。在由于眼部并发症(例如，玻璃体炎、视网膜脱离)而不能划定肿瘤边界 的明确区别的情况下，可对整个怀疑区域进行激光处理。
[0202] 死亡率/发病率检查：除有两只动物死于CsA并发症之外，所有的动物在整个实验 期间均保持良好的健康状况(参见下文）。
[0203] 临床观察:所有动物均由动物设施人员每日观察;记录观察结果。大多数动物经历 一定程度的重量减轻和食欲不振，这是由CsA引起。
[0204] 眼科学
[0205] 频率:通过眼底检查和超声的眼科检查每周进行。
[0206] 操作：使动物镇静并使用眼用盐酸去氧肾上腺素和托吡卡胺滴剂来使其右眼扩 大。接下来，使用间接双目检眼镜（indirect binocular ophthalmoscope)对眼进行眼底检 查。眼科学家对任何的眼部并发症进行记录。当鉴别到肿瘤时，通过将其与视盘(视盘直径 [DD]; IDD =约1.75mm)进行比较来估计尺寸。对于超声读数，在眼底检查之后立即向眼部施 加超声探针以使通过眼底检查确定的肿瘤的位置可视化。超声测量证明在技术上是困难 的，主要是因为一些肿瘤位于过于外周而不能适当地可视化。结果，并非总是可测量最大的 肿瘤尺寸;并且在大多数情况下仅可对高度进行量化。
[0207] 最终操作和解剖病理学
[0208] 计划外死亡:根据方案指南，在本研究中使用的20只动物中，一只动物由于重量减 轻（> 20 %的到达时体重)而对其实施了安乐死。一只动物意外地死于由CaA毒性引起的胃 肠道停滞（gastrointestinal stasis) 〇
[0209] 计划性安乐死：在研究结束后，根据公认的美国兽医医学协会（American Veterinary Medical Association，AVMA)指南对动物实施安乐死。使用氯胺酮-甲苯噻嗪-乙酰丙嗪（分别为〇.7511111^/1^、511^/1^和20至3511^/1^)和丁丙诺啡(0.211^/1^)的组合在麻 醉下对动物放血。
[0210] 结果
[0211] 总的来说，有11只动物发生组织病理学上明显的肿瘤。如前所述，有两只动物意外 死亡并将其用作未处理对照。有9只具有不同肿瘤大小的动物接受用病毒样纳米颗粒进行 处理。一只动物由于肿瘤范围在不能进行激光处理的赤道前段中而在评价中排除。
[0212] 对于在眼后部中具有肿瘤并且接受全处理(光敏病毒样纳米颗粒+激光）的动物， 观察到显著的肿瘤响应，其以以下三个要素为特征：1)诱导广泛的肿瘤坏死;2)生长模式改 变，从扩散变为"袖套样模式"（sleeve-like pattern);和3)不影响邻近的视网膜。
[0213] 表8


[0217] 未处理对照
[0218] 兔#14由于不能接受的重量减轻（>20%初始体重)而在第4周对其实施了安乐死。 针对肿瘤存在的眼底检查由于大出血和视网膜脱离而无说服力。该动物未接受处理。
[0219] 超声:该兔由于死亡时机而未经历超声检查。
[0220] 大体病理学/组织病理学:基于大体病理学，观察到尺寸为3mm高度(height，H) X 8mm最大肿瘤尺寸（largest tumor dimension，LTD)的眼内肿瘤，并且基于组织病理学，观 察到尺寸为2.2mm H和9.5最大肿瘤尺寸的眼内肿瘤。基于大体病理学，观察到尺寸为1.4_ 高度和9.4_最大肿瘤尺寸的眼外肿瘤。眼内和眼外肿瘤二者中有约10%是坏死的。未检测 到袖套模式。
[0221] 全处理
[0222] 兔 9
[0223] 兔#9在第四周在眼底上具有大小为约IDD的临床上可检出的肿瘤，立即对其进行 处理。在随后的一周，估测肿瘤为0.5DD。在第6周，估测肿瘤为<0.f5DD，并且在最后一周，未 检测到肿瘤。
[0224] 超声:在第3周时，超声未辨别到肿瘤，但是在第4周，鉴别到尺寸为1.04mm高度的 团块。在后续几周，超声的测量结果减退，直至截止第6周及此后肿瘤不再可见。
[0225] 大体病理学/组织病理学：组织病理学揭示无肿瘤或细胞。然而，尚需获得整个眼 的系列切片和免疫组织化学结果以进一步证实该结果。
[0226] 兔 6
[0227] 在第四周，存在肿瘤的临床怀疑(视网膜下的团块升高），但是在实验持续期间视 网膜下出血、流体和视网膜脱离对临床尺寸估测造成妨碍。
[0228] 超声:通过超声，在第3周检测到4.88mm的大团块，其在第4周生长至5.29mm，在此 点我们开始进行处理。在第5周，测量肿瘤为4.88mm，而在第6和7周，测量肿瘤分别为4.02mm 和4.98mm〇
[0229] 大体病理学/组织病理学:基于大体病理学，鉴别到两种独特的肿瘤：眼内肿瘤和 结膜肿瘤，后者怀疑是由细胞植入期间发生回流造成。由于结膜肿瘤的位置原因，不能对其 进行处理，并且因此我们考虑将其作为内对照。眼内肿瘤解聚集并且尺寸为7mm HXll mm LTD。还鉴别到尺寸为6mm HX9 LTD mm的延伸部(extraocular extension)，其具有特征性 的质地。基于组织病理学，测量眼内肿瘤为4.9mm HX8.3 LTD mm并且>70%坏死，其中剩 余的大部分存活细胞形成前述袖套样模式。未经处理的结膜肿瘤表现出远远更低的坏死 (约15 % )并且袖套模式不明显。
[0230] 该研究的目的是探索光敏病毒样纳米颗粒+NIR光在兔眼中的葡萄膜黑素瘤原位 异种移植模型中的活性。接受光敏病毒样纳米颗粒+激光处理的所有动物均对该处理作出 有利的响应。这对小至中等肿瘤而言特别明显，作为处理响应和完全组织病理学响应，所述 肿瘤具有明显的肿瘤缩小。例如在第4周时呈现小肿瘤的兔9中，通过头两个剂量的处理该 肿瘤完全根除并且在第二处理后两周在临床上或组织病理学上均不再检测到。在较大的肿 瘤（例如兔4)中，肿瘤大部分坏死，这与未处理的对照（兔14)形成明显对比，所述对照仅在 约10%的肿瘤体积中表现出坏死，清楚地指示处理效力。此外，接受全处理之具有眼内肿瘤 的数只动物具有未经激光处理的眼外延伸部；与经处理的肿瘤部分相比，这些部分表现出 显著更低的坏死，这是支持激光活化的光敏病毒样纳米颗粒用于治疗葡萄膜黑素瘤的效力 的另一证据。邻近肿瘤的视网膜区域未受处理的影响。
[0231] 基于处理之后的眼内肿瘤响应，尤其与对照（未经处理的眼外部分）相比，本文中 提供的数据支持光敏病毒样纳米颗粒在肿瘤存在下用于治疗眼黑素瘤的选择性且强效的 抗癌活性。
[0232] 实施例18-比较HPVLl与BPVLl的体外效力测定
[0233] 光敏病毒样纳米颗粒(例如，与IR700染料缀合之包含变体HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之组合的病毒样纳米颗粒）的效力通过体外细胞杀伤测量来测定。葡萄膜黑素瘤细 胞(例如，细胞系0CM-1或92.1)通过常规方法使用EDTA和胰蛋白酶的溶液来收获。一经从组 织培养塑料移出，就将细胞悬浮于完全生长培养基中并允许其在37°C下复苏约30分钟。在 该复苏期期间，在PBS+2%胎牛血清中以l/21og增量（2000pM、600pM、200pM、60pM、20pM、 6pM、2pM和0.6pM)制备光敏病毒样纳米颗粒的连续稀释物。在复苏期之后，将细胞计数，离 心并悬浮于TOS+2%FBS中直至细胞密度为3 X IO6Ail。向病毒样纳米颗粒稀释物添加等体 积的细胞悬液以在适当浓度（1000pM、300pM、100pM、30pM，、10pM、3pM、IpM和0 · 3pM)的病毒 样纳米颗粒中产生1.5 X IO6个细胞/ml。这些条件(例如，360μ1)是在冰上孵育约I. 5小时至 2小时。
[0234] 在该孵育之后，将管离心以收集细胞并随后将细胞在无光敏病毒样纳米颗粒的情 况下用PBS+2%FBS洗涤两次。在最后的离心之后，将细胞悬浮于200μ1 PBS+2%FBS中。每份 样品移出1〇〇μ1并将其转移至96孔1/2区板的孔。然后，使用Coherent Opal Photoactivator眼科激光器用25 J/cm2(600mW，43秒)近红外光（689nm)福照每份样品。在福 照之后，随后将细胞样品转移至新的管。将经光辐照和未经辐照的样品均放置在37°C下，再 持续1至2小时。
[0235] 在该孵育之后，将最终20μ1的细胞样品与AOPI染色剂（吖啶橙和碘化丙啶）1:1混 合并使用NexcelomCellometer Auto 2000评价细胞的生存力。图20显示，BPVLl和HPVLl在 半最大有效浓度(EC50)(BPVLl = 88pm;HPVLl = 60.5pm)下对细胞生存力具有相当的作用， 表明所述光敏分子的效力彼此相当。
[0236] 图21示出了分析光敏病毒样纳米颗粒结合之来自图20中所述的杀伤测定的细胞 样品。在Odyssey Clx凝胶/板扫描仪上对来自杀伤测定的细胞进行扫描。Odyssey Clx专门 设计成用于检测和量化一系列红外染料，包括IR700染料(例如，IRDyeK)7〇〇DX)。因此，在 该测定中，经不同浓度光敏病毒样纳米颗粒处理的细胞显示出浓度依赖性量的与细胞相关 的荧光，表明细胞与BPV-L1-IR700和HPV-L1-IR700二者都结合。
[0237] 实施例19-光敏病毒样纳米颗粒在头颈癌的异种移植模型中的活性。
[0238] 将头颈癌细胞植入nu/nu小鼠的背部侧胁中。允许肿瘤生长两周。一旦肿瘤达到 150_3的平均大小，就将动物如下随机分成6个研究组(每组7只动物）：盐水;光敏病毒样纳 米颗粒(HPV16/31 Ll/L2;200yg剂量）；盐水+NIR光(50J/cm2);光敏病毒样纳米颗粒(200yg 剂量)+NIR光(50J/cm2);光敏病毒样纳米颗粒（IOOyg剂量)+NIR光(50J/cm2);以及光敏病毒 样纳米颗粒(50yg剂量)+NIR光(50J/cm 2)。每3天进行给药和NIR光处理。每3至5天记录肿瘤 测量结果。
[0239] 尽管所有的对照对其相应的处理均未表现出实质性效应，但是在所有给药组中均 观察到显著的肿瘤生长抑制（图22)。所观察到的肿瘤生长抑制是剂量依赖性的。在高剂量 组中存在肿瘤响应。在200yg处理组中有两只动物死亡，这与大量细胞死亡相关并且潜在地 与肿瘤溶解综合征相关的毒性相关。
[0240]实施例20-光敏病毒样纳米颗粒的产生
[0241]为了产生本公开内容的光敏病毒样纳米颗粒，将HEK293F在悬浮培养物中培养，并 用编码Ll (或者Ll和L2)衣壳蛋白的双顺反子质粒DNA瞬时转染。这诱导形成原衣壳(如Buck 等Current Protocols in Cell Biology26.1.1-26· 1.19,2007年 12月中所述）。在细胞团 回收并破碎之后，使原衣壳经受benzonase处理以去除宿主DNA污染物并经受后续的体外成 熟过程以形成稳定用于缀合的病毒样纳米颗粒。在纯化之后，将病毒样纳米颗粒与 IR700NHS酯化学缀合以产生光敏病毒样纳米颗粒。图23示出了产生过程的示意性图示。
[0242] 由该实施例中所述的过程产生的光敏病毒样纳米颗粒已使用SDS-PAGE、SE-HPLC 和DLS进行表征，并且显示纯度为90 %至95 %。来自HEK293细胞的组蛋白作为病毒样纳米颗 粒组合物的一部分存在并且占病毒样纳米颗粒总蛋白的10%至15%。
[0243] 序列
[0244] 变体HPV16/31 Ll蛋白核苷酸序列（SEQ ID N0:1)
[0245] ATGAGCCTGTGGCTGCCCAGCGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGC ACCGACGAGTACGTGGCCAGGACCAACATCTACTACCACGCCGGCACCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTA CTTCCCCATCAAGAAGCCCAACAACAACAAGATCCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGA TCCACCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGG GCCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGCT GGACGACACCGAGAACGCCAGCGCCTACGCCGCCAACGCCGGCGTGGACAACAGGGAGTGCATCAGCATGGACTACA AGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCAGCCCCTGCACCAAC GTGGCCGTGAACCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGATCAACACCGTGATCCAGGACGGCGACATGGTGGACAC CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCACCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCACCAGCATCT GCAAGTACCCCGACTACATCAAGATGGTGAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTACCTGAGGAGGGAGCAG ATGTTCGTGAGGCACCTGTTCAACAGGGCCGGCGCCGTGGGCGAGAACGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCAG CGGCAGCACCGCCACCCTGGCCAACAGCAACTACTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGACGCCCAGA TCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTG ACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGAGCCTGTGCGCCGCCATCAGCACCAGCGAGACCACCTACAAGAA CACCAACTTCAAGGAGTACCTGAGGCACGGCGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCC TGACCGCCGACGTGATGACCTACATCCACAGCATGAACAGCACCATCCTGGAGGACTGGAACTTCGGCCTGCAGCCC CCCCCCGGCGGCACCCTGGAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCGCCTGCCAGAAGCACACCCCCCC CGCCCCCAAGGAGGACCCCCTGAAGAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGG ACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGCCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAAGTTCACCCTGGGCAAGAGG AAGGCCACCCCCACCACCAGCAGCACCAGCACCACCGCCAAGAGGAAGAAGAGGAAGCTGTGA
[0246] BPVlLl核苷酸序列（SEQ ID N0:2)
[0247] ATGGCCCTCTGGCAGCAGGGGCAGAAACTCTACCTGCCACCCACACCCGTGTCAAAAGTCCTGTGTTCC GAGACATACGTCCAGCGGAAGTCAATCTTCTACCACGCCGAGACCGAAAGGCTCCTCACCATCGGCCACCCCTACTA CCCCGTCAGCATTGGCGCTAAGACCGTGCCCAAAGTCTCCGCCAACCAATACCGCGTGTTCAAGATCCAGCTGCCCG ACCCAAACCAGTTCGCCCTGCCCGATCGCACCGTGCATAACCCCTCCAAGGAAAGACTCGTCTGGGCCGTGATCGGC GTCCAAGTCTCACGGGGCCAACCCCTGGGCGGCACCGTGACCGGCCATCCAACCTTCAACGCCCTCCTGGACGCCGA GAACGTCAACCGGAAAGTCACAACACAAACCACCGACGATCGCAAGCAGACCGGGCTGGACGCCAAACAGCAGCAAA TCCTCCTCCTGGGGTGCACACCCGCTGAGGGCGAGTACTGGACCACCGCTCGGCCCTGCGTGACCGACAGGCTGGAG AACGGGGCTTGTCCCCCCCTGGAGCTGAAGAATAAGCATATCGAGGACGGCGACATGATGGAGATCGGCTTCGGCGC CGCTAACTTCAAGGAGATCAACGCCTCCAAGAGCGACCTGCCCCTGGATATCCAGAACGAAATTTGTCTCTATCCCG ATTATCTGAAGATGGCCGAAGATGCCGCCGGCAACTCAATGTTTTTCTTCGCCCGCAAGGAGCAAGTCTACGTGCGG CATATTTGGACACGGGGCGGGAGCGAAAAGGAGGCTCCCACAACCGACTTCTACCTGAAAAACAACAAGGGCGACGC TACACTGAAGATCCCATCCGTCCACTTCGGCTCCCCATCCGGGAGCCTCGTCAGCACCGACAACCAGATCTTCAACA GACCATATTGGCTGTTTAGGGCTCAAGGGATGAATAACGGCATCGCTTGGAACAACCTGCTCTTCCTGACCGTCGGC GATAACACCAGGGGCACCAACCTGACAATCTCCGTGGCTAGCGACGGCACACCCCTGACCGAATACGACTCAAGCAA GTTTAACGTGTATCACCGGCACATGGAGGAGTACAAACTGGCTTTCATCCTGGAACTGTGTAGCGTCGAGATTACCG CCCAGACCGTCAGCCACCTCCAGGGCCTGATGCCAAGCGTCCTGGAGAACTGGGAGATCGGCGTCCAACCACCAACA AGCAGCATCCTGGAAGATACATACAGATACATCGAAAGCCCCGCCACCAAGTGCGCCTCAAACGTGATCCCCGCCAA GGAGGATCCCTACGCCGGCTTCAAATTCTGGAATATCGACCTGAAGGAGAAACTGAGCCTCGATCTGGACCAGTTCC CACTCGGCCGGCGGTTCCTGGCCCAACAGGGCGCTGGCTGCAGCACCGTCCGGAAGAGGCGGATCTCACAAAAGACC AGTTCCAAACCCGCCAAGAAGAAGAAGAAGTAG
【主权项】
1. 靶向肿瘤的病毒样颗粒，其包含与衣壳蛋白缀合的光敏分子。2. 权利要求1所述的病毒样颗粒，其中所述衣壳蛋白是乳头瘤病毒衣壳蛋白。3. 权利要求2所述的病毒样颗粒，其中所述乳头瘤病毒衣壳蛋白为非人乳头瘤病毒衣 壳蛋白。4. 权利要求3所述的病毒样颗粒，其中所述非人乳头瘤病毒衣壳蛋白是牛乳头瘤病毒 衣壳蛋白。5. 权利要求2所述的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒包含人乳头瘤病毒衣壳蛋白并 且不与人乳头瘤病毒(HPV)16、HPV 18或对HPV具有特异性的已有抗体交叉反应。6. 权利要求1至5中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述衣壳蛋白包含L1衣壳蛋白。7. 权利要求1至5中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述衣壳蛋白包含L1和L2衣壳蛋白 的组合。8. 权利要求7所述的病毒样颗粒，其中所述衣壳蛋白由L1衣壳蛋白组成。9. 权利要求1至8中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒具有经修饰的免疫 原性和/或抗原性。10. 权利要求1至9中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子与所述衣壳蛋白共 价缀合。11. 权利要求1至10中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子与所述衣壳蛋白的 赖氨酸残基缀合。12. 权利要求10或11所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子通过共价酰胺键与所述衣 壳蛋白缀合。13. 权利要求1至12中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子不破坏所述病毒样 颗粒与肿瘤细胞表面的结合。14. 权利要求13所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子不破坏所述病毒样颗粒与肿瘤 细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。15. 权利要求1至14中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒包含约10至约 1000个光敏分子。16. 权利要求15所述的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒包含约50至约1000个光敏分 子。17. 权利要求16所述的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒包含约100至约1000个光敏分 子。18. 权利要求1至17中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子包含荧光染料、红 外染料、近红外染料、扑啉分子、叶绿素分子或前述任意两种或更多种的组合。19. 权利要求1至18中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子通过红外光、近红 外光或紫外光来活化。20. 权利要求1至19中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子选自酞菁染料、维 替泊芬分子以及酞菁染料和维替泊芬分子的组合。21. 靶向肿瘤的病毒样颗粒，其包含约50至约1000个光敏分子。22. 权利要求21所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子与衣壳蛋白缀合，所述衣壳蛋白 是乳头瘤病毒衣壳蛋白。23. 权利要求22所述的病毒样颗粒，其中所述乳头瘤病毒衣壳蛋白为非人乳头瘤病毒 衣壳蛋白。24. 权利要求23所述的病毒样颗粒，其中所述非人乳头瘤病毒衣壳蛋白是牛乳头瘤病 毒衣壳蛋白。25. 权利要求22所述的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒包含人乳头瘤病毒衣壳蛋白 并且不与人乳头瘤病毒(HPV)16、HPV 18或对HPV具有特异性的已有抗体交叉反应。26. 权利要求21至25中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子与所述病毒样颗 粒的衣壳蛋白缀合。27. 权利要求26所述的病毒样颗粒，其中所述衣壳蛋白包含L1衣壳蛋白。28. 权利要求26或27所述的病毒样颗粒，其中所述衣壳蛋白包含L1和L2衣壳蛋白的组 合。29. 权利要求28所述的病毒样颗粒，其中所述衣壳蛋白由L1衣壳蛋白组成。30. 权利要求21至29中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒具有经修饰的 免疫原性和/或抗原性。31. 权利要求22至30中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子与所述衣壳蛋白 共价缀合。32. 权利要求22至31中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子与所述衣壳蛋白 的赖氨酸残基缀合。33. 权利要求31或32所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子通过共价酰胺键与所述衣 壳蛋白缀合。34. 权利要求21至33中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子不破坏所述病毒 样颗粒与肿瘤细胞表面的结合。35. 权利要求34所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子不破坏所述病毒样颗粒与肿瘤 细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。36. 权利要求21至35中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒包含约100至约 1000个光敏分子。37. 权利要求21至36中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子包含荧光染料、红 外染料、近红外染料、扑啉分子、叶绿素分子或前述任意两种或更多种的组合。38. 权利要求21至37中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子通过红外光、近红 外光或紫外光来活化。39. 权利要求21至38中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子选自酞菁染料、维 替泊芬分子以及酞菁染料和维替泊芬分子的组合。40. 包括以下的方法： 向患有肿瘤的对象施用权利要求1至39中任一项所述的病毒样颗粒。41. 权利要求40所述的方法，其还包括活化光敏分子。42. 权利要求40或41所述的方法，其还包括在允许氧的系间跨越从而产生细胞毒性分 子或直接能量传递以损伤细胞膜的光波长下活化所述光敏分子。43. 包括以下的方法： 向患有肿瘤的对象施用包含与衣壳蛋白缀合的光敏分子的靶向肿瘤的病毒样颗粒。44. 包括以下的方法： 向患有肿瘤的对象施用包含约50至约1000个光敏分子的靶向肿瘤的病毒样颗粒。45. 权利要求43或44所述的方法，其还包括在使所述分子可见的波长下活化光敏分子。46. 权利要求43至45中任一项所述的方法，其还包括在使光敏分子具有细胞毒性从而 杀伤肿瘤细胞的波长下活化所述分子。47. 权利要求46所述的方法，其中所述光敏分子是激光活化的。48. 权利要求47所述的方法，其中所述激光是红外激光、近红外激光或紫外激光。49. 权利要求48所述的方法，其中通过所述红外激光递送的能量为5J至100J。50. 权利要求49所述的方法，其中通过所述红外激光递送的能量为50J。51. 权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述激光施加约5秒至约5分钟。52. 权利要求43至51中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒样颗粒之后约30分钟 至约48小时活化所述光敏分子。53. 权利要求43至52中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是眼肿瘤。54. 权利要求53所述的方法，其中所述眼肿瘤位于玻璃体、脉络膜腔、虹膜、睫状体、巩 膜、视网膜中央凹、视网膜、视盘或视神经中。55. 权利要求43至52中任一项所述的方法，其中所述肿瘤位于肺、胸膜、肝、胰、胃、食 管、结肠、乳腺、卵巢、前列腺、脑、脑脊膜、睾丸、肾或膀胱中。56. 权利要求43至53中任一项所述的方法，其中所述肿瘤无需外科手术介入即可接近。57. 权利要求52所述方法，其中所述肿瘤位于头、颈、子宫颈、喉或皮肤中。58. 权利要求43至57中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是孤儿病或罕见病。59. 权利要求43至58中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是癌性或恶性的。60. 权利要求59所述的方法，其中所述肿瘤是转移性的、癌前期的、发育不良性的或者 具有指示恶性转化的可疑生长细胞。61. 权利要求43至60中任一项所述的方法，其中所述病毒样颗粒通过注射来施用。62. 权利要求61所述的方法，其中所述病毒样颗粒用空心针或包被针、微型针或显微操 作针来施用。63. 权利要求43至60中任一项所述的方法，其中所述病毒样颗粒表面、眼内、玻璃体内、 脉络膜上施用。64. 权利要求43至60中任一项所述的方法，其中所述病毒样颗粒通过植入来施用。65. 权利要求43至64中任一项所述的方法，其中所述衣壳蛋白是乳头瘤病毒衣壳蛋白。66. 权利要求65所述的方法，其中所述乳头瘤病毒衣壳蛋白为非人乳头瘤病毒衣壳蛋 白。67. 权利要求66所述的方法，其中所述非人乳头瘤病毒衣壳蛋白是牛乳头瘤病毒衣壳 蛋白。68. 权利要求43至64中任一项所述的方法，其中所述病毒样颗粒包含人乳头瘤病毒衣 壳蛋白，不与由人乳头瘤病毒(HPV)16、HPV 18VLP诱导的抗体或由HPV感染诱导的已有抗体 交叉反应。69. 权利要求43至68中任一项所述的方法，其中所述光敏分子与所述病毒样颗粒的衣 壳蛋白缀合。70. 权利要求69所述的方法，其中所述衣壳蛋白包含L1衣壳蛋白。71. 权利要求69或70所述的方法，其中所述衣壳蛋白包含L1和L2衣壳蛋白的组合。72. 权利要求71所述的方法，其中所述衣壳蛋白由L1衣壳蛋白组成。73. 权利要求43至72中任一项所述的方法，其中所述病毒样颗粒具有经修饰的免疫原 性和/或抗原性。74. 权利要求43至73中任一项所述的方法，其中所述光敏分子与衣壳蛋白共价缀合。75. 权利要求43至74中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子与所述衣壳蛋白 的赖氨酸残基缀合。76. 权利要求74或75所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子通过共价酰胺键与所述衣 壳蛋白缀合。77. 权利要求43至76中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子不破坏所述病毒 样颗粒与肿瘤细胞表面的结合。78. 权利要求77所述的病毒样颗粒，其中所述光敏分子不破坏所述病毒样颗粒与肿瘤 细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。79. 权利要求43、46至78中任一项所述的方法，其中所述病毒样颗粒包含约10至约1000 个光敏分子。80. 权利要求43、46至79中任一项所述的方法，其中所述病毒样颗粒包含约50至约1000 个光敏分子。81. 权利要求43至80中任一项所述的方法，其中所述病毒样颗粒包含约100至约1000个 光敏分子。82. 权利要求4 3至81中任一项所述的方法，其中所述光敏分子包含荧光染料、红外染 料、近红外染料、扑啉分子、叶绿素分子或前述任意两种或更多种的组合。83. 权利要求43至82中任一项所述的方法，其中所述光敏分子选自酞菁染料、维替泊芬 分子以及酞菁染料和维替泊芬分子的组合。
【文档编号】A61K39/42GK105979967SQ201480057289
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年9月18日
【发明人】伊丽莎白·德洛斯皮诺斯, 约翰·T·席勒, 罗达·C·基尼斯, 约翰·麦克杜格尔
【申请人】奥拉生物科学公司, 美国政府卫生与公众服务部