一种补骨脂黄酮甲醚及其类似物的用图
【专利摘要】本发明公开了一种补骨脂黄酮甲醚及其类似物的用途，所述用途是指以补骨脂黄酮甲醚或/和其类似物作为活性成分用于制备PPARα/γ双重激动剂。本发明的研究结果显示：补骨脂黄酮甲醚及其类似物可显著提高PPARα/γ转录活性，具有PPARα/γ双重激动活性，可作为PPARα/γ双重激动剂的活性成分用于制备预防或治疗代谢综合症的组合物，具有广泛应用前景。
【专利说明】
一种补骨脂黄酮甲醚及其类似物的用途
技术领域
[0001] 本发明是涉及一种补骨脂黄酮甲醚及其类似物的用途，属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 代谢综合症是以葡萄糖与脂质代谢异常为特征的常见病，伴有低密度脂蛋白升高 和高密度脂蛋白胆固醇降低，其常见的病症为肥胖病、糖尿病、高血脂症和动脉粥样硬化， 其中，糖尿病患者还常并发有高脂血症、心血管病、糖尿病肾病、糖尿病神经病变等疾病。
[0003] 据世界卫生组织公布，目前世界范围内超过2. 2亿人患糖尿病，其中，中国已成为 全球糖尿病人最多的国家，共有9200万糖尿病患者，据2010年3月25日出版的《新英格兰 医学杂志》研究报告的数据显示，中国目前有超过9200万糖尿病患者，而且我国目前的发病 还是上升期，增长速度也明显加快，据估算中国目前糖尿病前期患者是1. 5亿。持续扩大的 糖尿病人群已给社会带来了巨大的经济与医疗负担。世界卫生组织指出，如果不采取有效 措施来应对糖尿病的发展，预计在未来10年内，仅心脏病、中风和糖尿病就将给中国带来 至少5500亿美元的经济损失。
[0004] 过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)是一种配体激活转录因子，属于核受体超家族成员。它存在3种亚型，即 PPARa、β/δ、γ。现已研究证实：PPAR通过调控相关基因表达，在脂肪形成、糖脂代谢中 发挥重要作用，并与多种疾病包括肥胖、糖尿病、高血脂的发生发展有关。PPARa主要调节 脂肪酸代谢，它可以诱导肝脏脂蛋白脂酶表达，促进脂肪分解，改变脂蛋白的结构和功能， 影响血脂的构成和水平，降低甘油三酯，增加 HDL ;而PPARy在人体内涉及调节脂质合成、 糖类代谢，以及脂肪细胞的分化，PPARy的活化可以刺激成熟脂肪细胞内数种基因的表达， 从而促进脂肪组织对葡萄糖的摄取和利用；同时PPARy被激活后通过降低游离脂肪酸水 平来改善骨骼肌和肝脏对胰岛素的抵抗情况；因此，筛选具有PPAR α / γ双重激动活性的 化合物对预防或/和治疗代谢异常类疾病非常重要。[J. Med. Chem. 2009. 52,6835-6850 ; J.Nutr. 2006. 899-905 ；Emdocrinol Rev. 1999,20 (5) :649-688 ；Diabetes. 1998, 47(4) :507-514. ] 〇
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种补骨脂黄酮甲醚及其类似物作为PPARa / γ双重激动 剂的用途，为预防或/和治疗代谢异常类疾病提供一种新途径。
[0006] 具体说，本发明所述的补骨脂黄酮甲醚及其类似物的用途，是指以补骨脂黄酮甲 醚或/和其类似物作为活性成分用于制备PPAR α / γ双重激动剂。
[0007] 进一步说，本发明所述的补骨脂黄酮甲醚及其类似物的用途，是指以补骨脂黄酮 甲醚或/和其类似物作为PPAR α / γ双重激动剂的活性成分用于制备预防或治疗代谢综合 症的组合物。
[0008] 所述组合物为药物组合物、保健品组合物或食品组合物。
[0009] 所述的代谢综合症包括葡萄糖代谢异常疾病或/和脂质代谢异常疾病，尤其包括 糖尿病、肥胖症、高血脂症、动脉粥样硬化疾病中的至少一种。
[0010] 本发明所述的补骨脂黄酮甲醚及其类似物为具有式I结构的化合物或所述化合 物的药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前体化合物：
[0012] 通式中：1^为烷氧基；R2为羟基或酯基；R；?为氛或羟基；R4为异戊烯基或烷基。
[0013] 作为优选方案，所述的烷氧基选自Cl~C4的烷氧基；所述的酯基选自Cl~C4的 醋基；所述的烷基选自Cl~ClO的烷基。
[0014] 作为进一步优选方案，所述的烷氧基选自甲氧基或乙氧基；所述的酯基选自甲酯 基或乙酯基；所述的烷基选自异戊烷基。
[0015] 作为更进一步优选方案，本发明所述的补骨脂黄酮甲醚及其类似物为具有如下 结构式的化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前体化合 物：
[0018] 本发明所述组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达 体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、糖浆、溶液、悬浮液、注射 剂、酊剂、口服液、气雾剂、口含剂、冲剂、丸剂、散剂等常见剂型或纳米制剂等缓释剂型。
[0019] 本发明所述活性成分的有效施用剂量可随所用的组合物、给药的模式和待治疗的 疾病的严重程度而变化。
[0020] 另外，本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，还可通过多种本领 域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的类似物，比如化学合成或从植物中提取 等。
[0021] 本发明中所述术语的定义如下：
[0022] 术语"药学上可接受的盐"是指所述化合物与药学上可接受的无机酸或有机酸所 形成的盐，所述的无机酸包括：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述的有机酸包括：甲酸、 乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸（1，5)、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、 二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、 葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸。
[0023] 术语"互变异构体"是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团 异构体，例如：烯醇与相应的酮。
[0024] 术语"立体异构体"是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，例 如：顺反异构体、对映异构体、构象异构体等。
[0025] 术语"前体化合物"是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转 化为本发明的活性成分，从而发挥其药理作用的化合物。
[0026] 术语"组合物"是指在组合物中，除了含有主要活性成分之外，还可含有少量的且 不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体。例如，可以含有甜味剂以改善口 味、抗氧化剂以防止氧化，以及各种制剂所必要的辅料。
[0027] 术语"药学上可接受的"是指适用于人而无过度不良副反应（如毒性、刺激和变态 反应），即有合理的效益/风险比的物质。
[0028] 本发明的研究结果显示：补骨脂黄酮甲醚及其类似物可显著提高PPARa/γ转录 活性，具有PPAR α / γ双重激动活性，可作为PPAR α / γ双重激动剂的活性成分用于制备预 防或治疗代谢综合症的组合物，具有广泛应用前景。
【附图说明】
[0029] 图1体现了补骨脂黄酮甲醚（式A化合物）对db/db小鼠空腹血糖的影响；
[0030] 图2体现了补骨脂黄酮甲醚（式A化合物）改善db/db小鼠葡萄糖耐受情况。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0032] 实施例1 :补骨脂黄酮甲醚（式A化合物）的制备
[0034] 式3中间体：2' -异戊烯基氧基-4' -甲氧基苯乙酮的制备：
[0035] 将500mg 2' -羟基-4' -甲氧基苯乙酮（式1化合物）、I. 25g无水碳酸钾、15mL丙 酮及0. 4mL异戊烯基溴（式2化合物）加入反应瓶中，使反应液升温至回流，保温反应；待 TLC监测反应结束时（约回流反应5h)，使反应液降温至室温，用30mL乙酸乙酯和15mL水 萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和NaCl溶液进行洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤，滤液经硅胶柱 层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式3中间体，黄色油状物（548mg，77. 74% )。
[0036] 1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ 7. 86 (d, J = 8. 7Hz, 1H), 6. 53 (dd, J = 8. 7, 2. 2Hz, 1H), 6. 47 (d, J = 2. 1Hz, 1H), 5. 56 - 5. 49 (m, 1H), 4. 61 (d, J = 6. 6Hz, 2H), 3. 87 ( s, 3H), 2. 60 (s, 3H), 1.82(s, 3H), 1.77(s, 3H) ；MS (EI) m/z = 234 [M+], 166(60%), 151(100% ),69(24% )〇
[0037] 式4中间体：2' -羟基-4' -甲氧基-5' -异戊烯基苯乙酮的制备：
[0038] 将521mg式3中间体和IOmL二乙胺加入反应瓶中，使反应液升温至回流，保温反 应；待TLC监测反应结束时（约回流反应4h)，使反应液降温至室温，加入20mL乙酸乙酯和 IOmL 2N盐酸溶液萃取，收集乙酸乙酯层，先用IOmL水洗涤，再用饱和NaCl溶液洗涤，然后 用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式4中间 体，黄色油状物（387mg，74. 30 % )。
[0039] 4匪1?(4001抱，〇11(^(^〇^11-(1)5 12.74(8，1!1)，7.42(8，1!1)，6.41(8，1!1)，5.30-5. 24 (m, 1H), 3. 88 (s, 3H), 3. 24 (d, J = 7. 2Hz, 2H), 2. 56 (s, 3H), L 78 (s, 3H), 1. 73 (s, 3H)； MS(EI)m/z = 234[M+], 219(100% )，191(20% )，177(40% )。
[0040] 式7中间体：4-甲氧甲氧基苯甲醛的制备：
[0041] 将I. 5g 4-羟基苯甲醛（式5化合物）、6. 8g无水碳酸钾、50mL丙酮及I. 23mL氯 甲基甲醚（式6化合物）加入反应瓶中，在室温下反应；待TLC监测反应结束时（约反应 2h)，使反应液降温至室温，加入IOOmL乙酸乙酯和50mL水萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和 NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚 淋洗，即得到式7中间体，无色油状物（I. 632g，79. 95% )。
[0042] 1H NMR (400MHz, Chloroform-d) δ 9. 92 (s, 1H), 7. 86 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 17 (d, J =8. 7Hz, 2H),5. 27(s, 2H),3. 51(s, 3H) ；MS(EI)m/z = 166[M+], 152(20%), 135(28%), 121 (20% ), 65(24% ) 〇
[0043] 式8中间体：1-(2-羟基-4-甲氧基-5-异戊烯基）-3-(4'_甲氧甲氧基苯 基） _2E_稀丙基-1酮的制备：
[0044] 将287mg式4中间体、204mg式7中间体、IOmL乙醇及583mg三甲基硅醇钾加入反 应瓶中，使反应液升温至回流，保温反应；待TLC监测反应结束时（约回流反应3h)，使反应 液降温至室温，加入20mL乙酸乙酯和IOmL饱和氯化铵水溶液萃取，收集乙酸乙酯层，先用 IOmL水洗涤，再用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯 化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式8中间体，黄色固体（215mg，45. 90% )。
[0045] 1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ 13. 52(s, 1H), 7. 87(d, J = 15. 4Hz, 1H), 7. 63 (d, J = 8. 9Hz, 3H), 7. 48 (d, J = 15. 4Hz, 1H), 7. 28 (s, 1H), 7. 12 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 47 (s, 1H), 5. 31 (t, J = 7. 3Hz, 1H), 5. 26 (s, 2H), 3. 90 (s, 3H), 3. 52 (s, 3H), 3. 28 (d, J = 7. 2Hz, 2H), I. 80 (s, 3H), I. 76 (s, 3H) ；MS (EI) m/z = 382 [M+], 263 (16 % ), 218(28 % ), 203(24% ) 〇
[0046] 式A化合物：4' -羟基-6-异戊烯基-7-甲氧基黄酮的制备：
[0047] 将205mg式8中间体、IOmL DMSO及140mg碘加入反应瓶中，使反应液升温至90°C， 保温反应；待TLC监测反应结束时（约反应3h)，将反应液降温至室温，加入20mL乙酸乙酯 和IOmL饱和硫代硫酸钠水溶液萃取，收集乙酸乙酯层，先用IOmL水洗涤，再用饱和NaCl溶 液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即 得到式A化合物，浅黄色粉末（25mg，13. 87% )。
[0048] 1H NMR (400MHz, DMS0-d6) δ 10. 28 (s, 1H)，7. 95 (d, J = 8. 8Hz, 2H), 7. 70 (s, 1H) , 7. 29 (s, 1H), 6. 93 (d, J = 8. 9Hz, 2H) , 6. 78 (s, 1H) , 5. 30 (t, J = 7. 5Hz, 1H), 3. 96 (s, 3H) , 3. 32 (d, J = 7. 4Hz, 2H), I. 74 (s, 3H) , I. 68 (s, 3H). 13 C NMR(126MHz, DMS〇-d6) δ 176. 22, 162. 38, 161. 52, 160. 65, 156. 00, 132. 72, 128. 03, 127. 97, 123. 95, 121. 72, 121. 42, 116. 42, 115. 83, 104. 58, 99. 25, 56. 32, 27. 59 ,25. 55, 17. 58. MS(ESI)m/z = 337. 3 [M+H]+, m/z = 335. I [M-H]+. HRMS (ESI) Calc. Mass[C21H2004+H]+337. 1440, found 337. 1441 〇
[0049] 实施例2 :补骨脂黄酮甲醚（式A化合物）的制备
[0051] 将250mg补骨脂黄酮甲醚（式9化合物）、10mL DMSO及94mg碘加入反应瓶中，使 反应液升温至90°C，保温反应；待TLC监测反应结束时（约反应3h)，使反应液降温至室温， 加入20mL乙酸乙酯和IOmL饱和硫代硫酸钠水溶液萃取，收集乙酸乙酯层，先用IOmL水洗 涤，再用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸 乙酯/石油醚淋洗，即得到式A化合物，浅黄色粉末（151mg，60. 88% )。
[0052] 实施例3 :式B化合物的制备
[0054] 将50mg式A化合物、800mg无水碳酸钾、IOmL丙酮及13mL乙酰氯（式10化合 物）加入反应瓶中，于室温下反应；待TLC监测反应结束时（约反应2h)，加入20mL乙酸乙 酯和IOmL水萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤， 滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式B化合物，浅黄色固体（40mg， 71. 11% ) 〇
[0055] 1H NMR(400MHz，Chloroform-d) : δ 7. 96 (s，1H)，7. 91 (d，J = 8. 1Hz，2H)，7. 19 (d，J =8. 4Hz, 2H), 6. 91 (s, 1H), 6. 73 (s, 1H), 5. 30 (t, J = 7. 4Hz, 1H), 3. 98 (s, 3H), 3. 39 (d, J = 7. 4Hz, 2H), 2. 10 (s, 3H), I. 78 (s, 3H), I. 73 (s, 3H) · LRMS (ESI) m/z = 379. 3 [M+H]+。
[0056] 实施例4 :式C化合物的制备
[0057]
[0058] 式12中间体：3,4-二甲氧甲氧基苯甲醛的制备：
[0059] 将0· 5g 3, 4-二羟基苯甲醛（式11化合物）、2. 5g无水碳酸钾、20mL丙酮及0· 7mL 氯甲基甲醚（式6化合物）加入反应瓶中，在室温下反应；待TLC监测反应结束时（约反应 2h)，加入40mL乙酸乙酯和20mL水萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无 水硫酸钠干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式12中间体， 无色油状物（〇· 646g，78. 88% )。
[0060] 1H NMR (400MHz, Chloroform-d) δ 9. 88 (s, 1H), 7. 70 (d, J = 0. 7Hz, 1H), 7. 53 (dd, J =8. 3, 0. 6Hz, 1H), 7. 30 (d, J = 8. 4, 1H), 5. 37 (s, 2H), 5. 32 (s, 2H), 3. 55 (s, 3H), 3. 54 (s, 3H) · MS (ESI) m/z = 227. 3 [M+H]+。
[0061] 式13中间体：1-(2-羟基-4-甲氧基-5-异戊烯基）-3-(3'，4'-二甲氧甲氧基苯 基） _2E_稀丙基-1酮的制备：
[0062] 将652mg式4中间体、630mg式12中间体、20mL乙醇及I. 32g三甲基硅醇钾加入 反应瓶中，使反应液升温至回流，保温反应；待TLC监测反应结束时（约回流反应3h)，将反 应液降温至室温，加入40mL乙酸乙酯和20mL饱和氯化铵水溶液萃取，收集乙酸乙酯层，先 用20mL水洗涤，再用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析 纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式13中间体，黄色固体（460mg，37. 38% )。
[0063] 1H NMR (400MHz，Chloroform-d) δ 13. 50 (s，1H)，7. 83 (d，J = 15. 4Hz, 1H), 7. 61 (s, 1H), 7. 53 - 7. 50 (m, 1H), 7. 45 (d, J = 15. 4Hz, 1H), 7. 23 (d, J = 8. 4Hz ,1H), 6. 46 (s, 1H), 5. 32 (s, 5H), 3. 90 (s, 3H), 3. 58 (s, 3H), 3. 55 (s, 3H), 3. 32 (d, J = 7. 2Hz, 2H), I. 81(s, 3H), I. 76(s, 3H).MS(ESI)m/z = 442. 9[M+H]+。
[0064] 式14中间体：3'，4' -二甲氧基甲氧基-6-异戊烯基-7-甲氧基二氢黄酮的制备：
[0065] 将460mg式13中间体、IOmL甲醇及230mg无水氟化钾加入反应瓶中，使反应液升 温至回流，保温反应；待TLC监测反应结束时（约回流反应6h)，使反应液降温至室温，加入 20mL乙酸乙酯和IOmL水萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠 干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式14中间体，白色固体 (269mg,58. 51% ) 〇
[0066] 1H NMR(400MHz，Chloroform-d) δ 7· 69 (s，1H)，7· 31 (d，J = 2. 0Hz，1H)，7· 23 (d，J =8. 3Hz, 1H), 7. 10 (d, J = 8. 5Hz, 1H), 6. 48 (s, 1H), 5. 44 (dd, J = 13. 4, 2. 9Hz, 1H), 5. 29 (s, 2H), 5. 28 (s, 2H), 3. 87 (s, 3H), 3. 55 (s, 3H), 3. 55 (s, 3H), 3. 26 (d, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 05 (dd, J =16. 8, 13. 4Hz, 1H), 2. 80 (dd, J = 16. 9, 2. 9Hz, 1H), L 76 (s, 3H), L 72 (s, 3H). MS (ESI) m/z =443. 0[M+H] + 〇
[0067] 式15中间体：3'，4' -二羟基-6-异戊烯基-7-甲氧基二氢黄酮的制备：
[0068] 将200mg式14中间体、IOmL甲醇及2. 26mL 3N盐酸加入反应瓶中，使反应液升温 至回流，保温反应；待TLC监测反应结束时（约回流反应0. 5h)，使反应液降温至室温，加入 20mL乙酸乙酯和IOmL水萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠 干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式15中间体，白色固体 (112mg,70. 71% ) 〇
[0069] 1H NMR (400MHz，DMS0-d6) δ 9. 07 (s，1H)，9. 02 (s，1H)，7. 47 (s，1H)，6. 90 (s， lH)，6.76(d，J = 2·9Ηζ，2Η) ,6.60 (s，lH) ,5.40 (dd, J = 12.7,3. 0Hz,ΙΗ) ,5.23 (t，J =7.5Hz, lH),3.84(s,3H),3. 18(d,J = 7. 4Hz, 2H) , 3. 06 (dd, J = 16. 8, 12. 7Hz, 1H), 2. 63 (dd, J = 16. 8, 3. 0Hz, 1H), I. 71 (s, 3H), I. 65 (s, 3H). MS (ESI)m/z = 355. l[M+H]+〇
[0070] 式C化合物的制备：
[0071] 将IOOmg式15中间体、IOmL DMSO及36mg碘加入反应瓶中，使反应液升温至90°C， 保温反应；待TLC监测反应结束时（约反应3h)，使反应液降温至室温，加入20mL乙酸乙酯 和IOmL饱和硫代硫酸钠水溶液萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水 硫酸钠干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式C化合物，浅 黄色固体（63mg，63. 36% )。
[0072] 1H NMR (400MHz, DMS〇-d6) δ ： 7. 70 (s, 1H), 7. 43 (s, IH), 7. 42 (d, 1H), 7. 24 (s, IH), 6 .89 (d, J = 7. 8Hz), 6. 66 (s, 1H), 5. 30 (t, J = 7. 5Hz, 1H), 3. 97 (s, 3H), 3. 30 (overlapped, 2H )，I. 73 (s, 3H), I. 68 (s, 3H) · MS (ESI) m/z = 353. 2 [M+H]+。
[0073] 实施例5 :式D化合物的制备
L0075」 式16中I日」体- 1?? -中氧.-δ' -丼仄盎本乙酮的制爸：
[0076] 将500mg式4中间体、50mg 10% Pd-C及20mL乙醇加入反应瓶中，在室温下通入 H2反应；待TLC监测反应结束时（约反应3h)，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石 油醚淋洗，即得到式16中间体，浅黄色固体（420mg，83. 29% )。
[0077] 1H NMR (400MHz，Chloroform-d) δ 12. 72 (s，1H)，7. 42 (s，1H)，6. 39 (s，1H)，3. 86 (s， 3Η)，2· 57 (s，3Η)，2· 55-2. 51 (m，2Η)，I. 65-1. 56 (m，1Η)，I. 46-1. 41 (m，2Η)，0· 97 (s，3Η)，0· 9 5 (s，3H) ;MS(EI)m/z = 234[M+]，219(100% )，191(20% )，177(40% )。
[0078] 式17中间体：1-(2-羟基-4-甲氧基-5-异戊基）-3_(4' -甲氧甲氧基苯 基）_2E_稀丙基-1酮的制备：
[0079] 将400mg式16中间体、281mg式7中间体、IOmL乙醇及620mg三甲基娃醇钾加入 反应瓶中，使反应液升温至回流，保温反应；待TLC监测反应结束时（约回流反应3h)，使反 应液降温至室温，加入20mL乙酸乙酯和IOmL饱和氯化铵水溶液萃取，收集乙酸乙酯层，用 饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石 油醚淋洗，即得到式17中间体，黄色固体（235mg，36. 11% )。
[0080] IH NMR (400MHz, Chloroform-d) 5l3.51(s,lH),7.90,7.86 (d,J = 15. 5Hz, 1H) , 7. 66, 7. 64 (d, J = 8. 5Hz, 2H) , 7. 6 I (s, 1H) , 7. 52, 7. 48 (d, J = 15. 5Hz, 1H), 7. 13, 7. 11 (d, J = 8. 4Hz, 2H), 6. 46 (s, 1H), 5. 25 (s, 2H), 3. 89 (s, 3H), 3. 52 ( s, 3H), 2. 61-2. 56 (m, 2H), I. 67-1. 61 (m, 1H), I. 50-1. 44 (m, 2H), I. 00 (s, 3H), 0. 98 (s, 3H)； MS(EI)m/z = 382[M+], 263(16% ), 218(28% ), 203(24% ) 〇
[0081] 式18中间体：4' -甲氧基甲氧基-6-异戊基-7-甲氧基二氢黄酮的制备：
[0082] 将220mg式17中间体、IOmL甲醇及IlOmg无水氟化钾加入反应瓶中，使反应液升 温至回流，保温反应；待TLC监测反应结束时（约回流反应6h)，使反应液降温至室温，加入 20mL乙酸乙酯和IOmL水萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠 干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式18中间体，白色固体 (134mg,61. 00% ) 〇
[0083] 1H NMR (400MHz，Chloroform-d) δ 7. 70 (s，1H)，7. 44, 7. 42 (d，J = 8. 4Ηζ, 2Η) , 7. 13, 7. 11 (d, J = 8. 4Hz, 2Η) , 6. 46 (s, 1Η) , 5. 45-5. 41 (dd, J = 13. 5, 2. 8Hz, 1Η) , 5. 2 3 (s, 2Η) , 3. 86 (s, 3Η) , 3. 51 (s, 3Η) , 3. 10-3.03 (dd, J = 16. 9, 13. 5Hz, 1Η), 2. 82-2. 77 (dd, J = 16. 9, 2. 9Hz, 1Η), 2. 58-2. 54 (m, 2Η), 1. 62-1. 57 (m, 1 Η), L 49-1. 43(m, 2Η), 0· 96(s, 3Η), 0· 95(s, 3Η) ;LRMS(EI)m/z = 382[Μ+], 218(44% )。
[0084] 式19中间体：4' -羟基-6-异戊基-7-甲氧基二氢黄酮的制备：
[0085] 将120mg式18中间体、IOmL甲醇及1.0 mL 3Ν盐酸加入反应瓶中，使反应液升温 至回流，保温反应；待TLC监测反应结束时（约回流反应0. 5h)，使反应液降温至室温，加入 20mL乙酸乙酯和IOmL水萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠 干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式19中间体，白色固体 (89mg,83. 77% ) 〇
[0086] 1H NMR (40 0MHz, Chloroform-d) 57.71(s,lH),7.38,7.36(d,J = 8. 3Hz, 2H), 6. 93, 6. 91 (d, J = 8. 3Hz, 2H), 6. 46 (s, 1H), 5. 62 (s, 1H), 5. 43-5. 39 (dd, J = 13. 5, 2. 8Hz, 1H), 3. 86 (s, 3H), 3. 11-3. 03 (dd, J = 16. 8, 13. 5Hz, 1H), 2. 85-2. 75 (dd, J = 16. 8, 2. 8Hz, 1H), 2. 58-2. 54 (m, 2H), I. 63-1. 55 (m, 1H), I. 48-1. 42 (m, 2H), 0. 96 (s, 3H), 0. 9 4(s, 3H) ；LRMS(EI)m/z = 338 [M+], 219 (68% ), 203(40% ) 〇
[0087] 式D化合物的制备：
[0088] 将80mg式19中间体、IOmL DMSO及30mg碘加入反应瓶中，使反应液升温至90°C， 保温反应；待TLC监测反应结束时（约反应3h)，使反应液降温至室温，加入20mL乙酸乙酯 和IOmL饱和硫代硫酸钠水溶液萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水 硫酸钠干燥，过滤，滤液经硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚淋洗，即得到式D化合物，浅 黄色粉末（41mg，51.55% )。
[0089] 1H (400MHz，DMS0-d6) δ : 10. 29 (s，1H)，7. 96, 7. 94 (d，J = 8. 6Hz，2H)，7. 74 ( s, 1H), 7. 28 (s, 1H), 6. 94, 6. 92 (d, J = 8. 6Hz, 2H), 6. 77 (s, 1H), 3. 95 (s, 3H), 2. 66-2. 62 ( m, 2H), I. 59-1. 51 (m, 1H), I. 48-1. 42 (m, 2H), 0. 94 (s, 3H), 0. 92 (s, 3H) ；LRMS (ESI) m/z = 339. 2[M+H]+。
[0090] 实施例6:利用双荧光素酶报告基因法分析式I化合物对PPAR a / γ转录活性的 影响
[0091] 使用PPAR全长基因和配体结合域（ligand binding domain, LBD)两种质粒检测 化合物对核受体转录因子活性的影响；将其转染到293T细胞后，经药物干预24h，检测其萤 火虫荧光素酶活性；并使用水母荧光素酶活性做转染效率对照。
[0092] (I)293T 细胞培养
[0093] 293T细胞株（人胚肾细胞株）用含10%小牛血清及1%双抗的DMEM高糖培养基于 37°C、5% 0)2培养箱中培养；取对数生长期的293T细胞铺板，细胞密度为IX 10 5~2X 10 5 个/mL铺板于48孔板中。
[0094] (2)供转染质粒
[0095] pCMX-Gal-mPPAR γ LBD 质粒，PPAR a-LE5D 质粒，Gal4reporter vector MHlOO X 4-TK-Luc重组质粒和reni I la Iuciferase内参质粒；PPARy全长质粒； PPARa 全长质粒，质粒构建可参考文献：Biochemical and Biophysical Research Communications 2006(348) :571-578 ；Cell Metabolism. 2(2005)239-249 ；J.Biol. Chem. 272(1997) 18779-1878 ;Cell 83 (1995)803-812。
[0096] (3)转染
[0097] 过夜，待细胞长至50~80%的密度时，进行转染；用DMEM(无血清无双抗）配制 转染体系：在每毫升的DMEM中含有10 μ g的总质粒，以及15 μ L的转染试剂-FuGENE HD 【Roche】，然后将转染体系涡旋混匀，并室温放置15min，然后将转染体系共转染于293Τ细 胞中，用完全培养基（DMEM，10% FBS，1%双抗）继续培养至24h。
[0098] (4)加药干预
[0099] 24h后，加入用完全培养基稀释的不同浓度梯度（0. 01、0. 1、0. 3、1、3、10、30μΜ) 的式I化合物或用完全培养基稀释的不同浓度梯度（〇.〇〇1、〇.〇1、〇. 1、1、3、1〇μΜ)罗格列 酮（特异性PPARy激动剂）或不同浓度梯度的PPARa激动剂WY14643(0.001、0.01、0.1、 1、3、10μΜ)进行干预。
[0100] (5)细胞处理
[0101] ①24h后，用PBS清洗细胞两次，除去剩余的细胞培养液；
[0102] ②每孔加入65 μ L的裂解液，摇床振荡15min，待细胞裂解完全，将细胞裂解液转 移到I. 5mL离心管中；
[0103] ③将细胞裂解液于1000 rpm离心5min，取上清液10 μ L于新的离心管中，待测。
[0104] (6)测定与分析荧光素酶强度
[0105] ①加 LAR II液【购自于Promega公司】20 μ L，混匀，测荧光，2秒延迟，读10秒；转 染效率利用内参Renilla荧光素酶活性校正，所有转染实验至少独立重复三次，每个实验 组至少2个副孔。
[0106] ②利用Bio-Tek, Synergy HT多功能酶标仪进行萤火虫和海洋腔肠萤光强度检测； 萤火虫萤光素酶表达强度用萤火虫萤光和海洋腔肠萤光强度的比值表示，相对荧光强度= 萤火虫萤光强度/海洋腔肠萤光强度，即，主要利用荧光素酶相对表达活性反映外加药物 是否通过与PPARs受体发生功能性结合来影响PPARs转录活性。
[0107] (7)数据分析
[0108] 利用软件SPSS16.0进行数据分析，不同干预组的差异性比较采用单因素方差分 析（ANOVA)，p〈0. 05认为组间差异具有统计学意义。并利用软件GraphPad Prism 6计算每 个化合物干预组的EC5。值。
[0109] (8)实验结果
[0110] 实验结果表明：式A、B、C、D化合物可显著促进PPARy LBD (配体结合域，ligand binding domain)的转录活性；其中式B化合物在25 μ M时，对PPAR γ LBD激动活性最强， 相比于溶剂媒介干预组激动倍数为10. 85 ;其次为式A化合物对其激动倍数为6. 32,式C化 合物激动倍数为6. 01 ;式D化合物对PPAR γ LBD转录活性促进作用最弱，为2. 14倍。化合 物作用于PPAR a LBD转录活性趋势类似于对PPAR γ LBD的影响。关于式A、B、C、D化合物 对PPARa / γ全长转录活性的半数有效浓度（EC5。值，μΜ)见表1所示。
[0111] 表 1
[0113] 由表1结果可见：式A、B、C、D化合物均可作为PPARa / γ双重激动剂的有效成分。
[0114] 实施例7 :式A化合物对db/db小鼠血糖的影响
[0115] C57BL/KsJ来源的db/db小鼠经罗格列酮2mg/kg/天或式A化合物50mg/kg/天 治疗14天。小鼠禁食12小时后测空腹血糖作为Omin，然后小鼠腹腔注射lg/kg葡萄糖， 间隔 15、30、60、90、120min 测尾静脉血糖；数据为 mean土SE，η = 10,8,7 和 7 ;*Ρ〈0· 05 ; **Ρ〈0. 01。
[0116] 1印tin受体突变db/db小鼠在4周时开始表现出肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、高 血糖等症状，为理想的肥胖、高脂血症及II型糖尿病的小鼠动物模型。
[0117] (I) db/db小鼠的饲养
[0118] db/db小鼠饲养于屏障系统小鼠实验饲养室（温度：22~23°C，湿度：50~70%， 工作照度：150~300Lx，动物照度：15~20Lx，噪声标准<60dB);试验前，适应环境2周。
[0119] (2) db/db小鼠的分组
[0120] db/db小鼠禁食12h，称重并测空腹血糖，筛选血糖稳定的db/db小鼠23只，按体 重和血糖值随即分为模型对照组（8只）、式A化合物组（7只）和罗格列酮（RSG)阳性对照 组（7只）进行药效学实验；同时将同来源的C57野生型小鼠作为正常对照组（10只）。
[0121] (3)药物处理
[0122] 罗格列酮阳性药对照组：将罗格列酮药物溶解于含有10%助溶剂的双蒸水中，给 予0· 5mg/kg/天罗格列酮；
[0123] 式A化合物组：将式A化合物溶解于含有10%助溶剂的双蒸水中，给予50mg/kg/ 天式A化合物；
[0124] 正常对照组：给予含有10 %助溶剂的双蒸水；
[0125] 模型对照组：给予含有10 %助溶剂的双蒸水；
[0126] 治疗14天后，分别测定三组不同处理后小鼠的空腹血糖；
[0127] 详细测试结果如图1所示。
[0128] ⑷db/db小鼠葡萄糖耐受试验（GTT)
[0129] 之后db/db小鼠腹腔注射葡萄糖（lg/kg)，观察葡萄糖耐受试验（IPGTT)指数的变 化；于0、30、60、90、120分钟时测小鼠尾静脉血糖值；
[0130] 详细测试结果如图2所示。
[0131] 由图1可见：与正常野生型C57小鼠组小鼠相比，模型对照组db/db小鼠的空腹血 糖显著提高（#*，P〈〇. 001);与模型对照组小鼠相比，式A化合物组db/db小鼠在连续给药 14天后空腹血糖明显下降（**，P〈0. 01)。
[0132] 由图2可见：在给药干预14天后，与模型对照组相比，式A化合物可有效地改善小 鼠葡萄糖耐受能力，但改善效果不如罗格列酮组。
[0133] 最后有必要在此说明的是：本领域的技术人员可以在上述实施例基础上，进行补 骨脂黄酮甲醚其它类似物的上述活性论证实验，在此不再一一列举。此外应理解，在阅读了 本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所做的等价 形式同样落于本申请权利要求书所要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种补骨脂黄酬甲酸及其类似物的用途，其特征在于：W补骨脂黄酬甲酸或/和其 类似物作为活性成分用于制备PPAR a / 丫双重激动剂。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：W补骨脂黄酬甲酸或/和其类似物作为 PPARa / 丫双重激动剂的活性成分用于制备预防或治疗代谢综合症的组合物。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述组合物为药物组合物、保健品组合物 或食品组合物。4. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的代谢综合症包括葡萄糖代谢异常 疾病或/和脂质代谢异常疾病。5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的代谢综合症包括糖尿病、肥胖症、 高血脂症、动脉粥样硬化疾病中的至少一种。6. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的补骨脂黄酬甲酸及其类似物 为具有式I结构的化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或 前体化合物：通式中：Ri为烷氧基；R2为径基或醋基；R3为氨或径基；R4为异戊締基或烷基。7. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的烷氧基选自Cl~C4的烷氧基；所 述的醋基选自Cl~C4的醋基；所述的烷基选自Cl~ClO的烷基。8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的烷氧基选自甲氧基或乙氧基；所述 的醋基选自甲醋基或乙醋基；所述的烷基选自异戊烷基。9. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的补骨脂黄酬甲酸及其类似物 为具有如下结构式的化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体 或前体化合物：
【文档编号】A61P3/10GK105982885SQ201510087003
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月25日
【发明人】李医明, 郭夫江, 杜国新, 冯丽, 黄诚, 朱维良, 李波, 陈凯先
【申请人】上海中医药大学