松香抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和医药应用
【专利摘要】本发明属医药技术领域，具体涉及一种维吾尔药松香抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和其在制备预防及治疗乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肝癌等恶性肿瘤药物中的应用。将维吾尔药松香经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，用体积比为100:1的石油醚：丙酮洗脱，再用体积比100：2-100：3的石油醚：丙酮洗脱，得石油醚：丙酮=100：2-100:3洗脱液，回收溶剂，干燥即得松香抗肿瘤提取物。
【专利说明】
松香抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和医药应用
技术领域
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种维吾尔药松香抗肿瘤提取物及其组合物的 制备方法和其在制备预防及治疗肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、脑胶质 瘤等恶性肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 本品为松科植物马尾松Pinus massoniana Lamb.或其同属植物树干中取得的油 树脂，经蒸馏除去挥发油后的遗留物。多在夏季采收，在松树干上用刀挖成V字形或螺旋纹 槽，使边材部的油树脂自伤口流出，收集后，加水蒸馏，使松节油馏出，剩下的残渣，冷却凝 固后，即为松香Colophonium。产于广东、广西、福建、湖南、江西、浙江、安徽等地。
[0003] 松香功效：祛风，燥湿，排脓，拔毒，生肌，止痛，用于治疗痈疽，疔毒，痔瘘，恶疮，疥 癣，白秃，金疮，扭伤，风湿痹痛，疠风瘙痒等。松香是重要的化工原料，广泛应用于肥皂、造 纸、油漆、橡胶等行业。
[0004] 本发明通过系统地筛选研究，意外地发现松香提取物具有显著抗肿瘤活性，即松 香提取物对乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的具有 很好的预防及治疗作用，可以应用癌症的预防和治疗。
【发明内容】
[0005] 本发明所解决的技术问题是提供一种松香提取物。
[0006] 本发明还提供了以松香提取物为主要活性成分的组合物。
[0007] 本发明同时提供了松香提取物及其组合物的制备和在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0008] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0009] 松香经甲醇超声提取，提取液浓缩后，用硅胶（SiO2)柱分离，上样后的硅胶柱，用 石油醚：丙酮混合溶剂（100 :〇-〇 :1〇〇)梯度洗脱（石油醚：丙酮，具体比例见表1)，各石油 醚：丙酮比例混合溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外抗肿瘤活性筛选体系测试其抗肿瘤 活性，意外地发现先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:0-100:1，体积比）洗脱， 继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :2-100 :3,体积比）洗脱，石油醚：丙酮= 100 :2-100 :3洗脱液干燥后，具有显著的抗肿瘤活性，而其他比例的洗脱提取物，没有抗肿 瘤活性。即，抗肿瘤活性的化合物，可以通过以上方法，得到富集，从而与其他杂质类成分分 离开。该活性提取物优选先用100:1石油醚：丙酮洗脱，再用100 :3石油醚：丙酮洗脱，100 : 3洗脱液干燥后的提取物，该提取物的TLC分析表征如图1，TLC分析条件：GF254硅胶板，展 开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（3:1:1)显色方法：香草醛-硫酸显色。
[0010] 具体，发现过程如下：
[0011] 1、松香经甲醇超声提取物的制备
[0012] 取维吾尔药松香20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物 SN0003A2114. 7mg，留样 10.0 mg 剩余 2104. 7mg。
[0013] 2、石油醚：丙酮混合溶剂梯度洗脱方法和结果
[0014] 取维吾尔药松香20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物 3勵003六2114.711^，留样10.011^剩余2104.711^，上柱，甲醇溶解，共用甲醇201111。上硅胶柱 色谱，拌样硅胶2g，空白硅胶10g，玻璃柱内径2. 0cm，石油醚：丙酮系统梯度洗脱（条件见 表1)，柱体积22ml，每个梯度洗脱200ml，得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂， 即得，石油醚：丙酮梯度洗脱提取物，收率见表1，TLC分析结果见图2, TLC分析条件：GF254 硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6:1:1)，石油醚：乙酸乙酯：丙酮（3:1:1)显色 方法：香草醛-硫酸显色。
[0015] 表 1
[0017] 3、抗肿瘤活性筛选方法和结果
[0018] 1)实验条件
[0019] a)细胞株信息
[0020] 大鼠脑胶质瘤细胞C6购于中国典型培养物保藏中心细胞库。
[0021] b)药品及试剂
[0022] 样品无菌条件下，DMSO溶解配置成母液浓度为100mg/mL，使用时用RPMI-1640培 养液稀释至所需浓度（DMSO彡1%。）。
[0023] RPMI Medium 1640培养基干粉购于美国GIBCO公司。胎牛血清购于北京元亨圣马 生物技术研究所。Trypsin 1:250、二甲基二苯基四氮唑溴盐（MTT)。
[0024] c)仪器
[0025] CO2培养箱（SANYO,日本）
[0026] 垂直层流洁净工作台（上海上净净化设备有限公司）
[0027] 倒置生物显微镜（重庆光电仪器有限公司）
[0028] 低/高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）
[0029] 电子天平（奥豪斯仪器有限公司）
[0030] 酶标仪（伯乐生命医学产品有限公司）
[0031] 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）
[0032] 鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）
[0033] PH 计（SART0RIUS，德国）
[0034] 2)实验方法和过程
[0035] 大鼠脑胶质瘤细胞C6以4000/孔的密度铺于96孔板，每孔100 μ 1，12h后使用。 各组分以DMSO溶解为lOOmg/mL储存液，保存于-20°C待用。铺板后12h，观察细胞汇合率 约为40%，加药，浓度均为100yg/mL，每个组分3个复孔。每板细胞设立二个对照组（培 养基+细胞；含〇. 1% DMSO培养基+细胞），3个空白孔（只有培养基）。加入药物24小 时后，加入20 μ 1四甲基偶氮唑盐化学名为3- (4, 5-二甲基噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴盐 (3_(4, 5-dimethyl_2thiazolyl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide，ΜΤΤ)，继续培养 4 小时。完全弃去上清液，加入100 μ I DMS0,混匀使MTT完全溶解，去气泡。490nm测定OD 值。
[0036]
[0037] 3)实验结果
[0038] 表 2
[0039]
[0043] 结果发现：
[0044] 维吾尔药松香经甲醇超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱， 先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :0-100:1，体积比）洗脱，继用石油醚：丙酮 混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :2-100 :3,体积比）洗脱，石油醚：丙酮=100 :2-100 :3,尤其 是先用100:1石油醚：丙酮洗脱，再用100 :3石油醚：丙酮洗脱，所得100 :3洗脱液经回收 有机溶剂，干燥，得到高活性提取物，为该抗肿瘤的提取物。该活性提取物从未见文献报道， 其100 :3洗脱液得到的提取物的TLC分析表征如图1。
[0045] 4、抗肿瘤有效提取物的提取方法研究
[0046] 1)提取溶剂的种类研究
[0047] 分别用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有 机溶剂提取，并测试提取物对C6细胞的抗肿瘤活性，结果如下：
[0048]表 3
[0050] 研究结果表明：提取用有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水 混合溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0051] 2)提取溶剂的用量研究
[0052] 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍（重量/体积比）有机溶剂提取，并测试提取物 对C6细胞的抗肿瘤活性，结果如下：
[0053] 表 4
[0056]
[0057] 提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍（重量/体积比）。
[0058] 3)干燥方法的研究
[0059] 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到 的抗肿瘤活性提取物进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、冷冻干 燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对C6细胞抗肿瘤活性提取物进行干燥，其 中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0060] 表 5
[0062] 因此，松香抗肿瘤提取物的制备方法为：
[0063] 松香经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用 石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :0-100:1，体积比）洗脱2-50倍柱体积，继用石 油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :2-3,体积比）洗脱2-50倍柱体积，石油醚：丙酮 100 :2-3洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物。以上条件最优为先用石油醚：丙酮 混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :0-100:1，体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合 溶剂（石油醚：丙酮，100 :2-3,体积比）洗脱15倍柱体积。最优为：先用石油醚：丙酮混合 溶剂（石油醚：丙酮，100:1，体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油 醚：丙酮，100 :3,体积比）洗脱15倍柱体积；其中，
[0064] 1)提取物提取用有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶 剂、乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。提取物提取用有机溶剂用量为药材重量 的2-50倍（重量/体积比）。
[0065] 2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0066] 5.松香抗肿瘤有效提取物的抗肿瘤活性研究
[0067] 利用各种肿瘤细胞，如乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肝 癌等恶性肿瘤细胞株，分别测试松香抗肿瘤提取物（石油醚：丙酮=100:3洗脱物得到的 提取物）的抗肿瘤活性，IC 5。结果如下：
[0068] 表 6
[0069]
[0070] 因此，我们发现，松香抗肿瘤提取物具备抗肿瘤活性，可望用于各种肿瘤如乳腺 癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肝癌等恶性肿瘤细胞株的预防及治疗。 [0071 ] 6、松香抗肿瘤有效提取物的组合物及其制备方法研究
[0072] 1)固体分散体
[0074] 制备方法：
[0075] 称取松香提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的质量比分 别放入烧杯中，加入无水乙醇，磁力搅拌器搅拌至松香提取物和载体完全溶解，转入旋蒸仪 中去除有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得松香提取物PVP包合物。
[0076] 2)环糊精包合物
[0078] 制备方法：
[0079] 将β -环糊精与1~5倍水研匀，加松香提取物（水难溶性的应先溶于少量有机 溶剂中）充分研磨至成糊状物，低温干燥即得。
[0080] 3)分散片处方：
[0081] 松香提取物 100: 十二烷基硫酸钠 1
[0082]
[0083] 制备方法：
[0084] 1.松香提取物淀粉分散体的制备，精密称取松香提取物提取物，加入适量的十二 烷基硫酸钠，用70 %的乙醇溶解加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C的温度下蒸 干，粉碎，过100目筛；
[0085] 2.称取处方量，松香提取物淀粉分散体，交联聚维酮，预胶化淀粉，用70%乙醇做 湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min后，60°C烘箱烘干45min， 16目筛整粒，加入滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片。
[0086] 7、松香抗肿瘤有效提取物的检测方法研究
[0087] 我们发现，可以用薄层色谱的方法，很好地检测和标示松香抗肿瘤有效提取物的 特征。见图1
[0088] 具体条件为：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮=6:1:1，显色方 法：香草醛-浓硫酸显色。
【附图说明】：
[0089] 图1提取物的TLC色谱图
[0090] 图2松香得到的化学组分的TLC色谱图
【具体实施方式】
[0091] 以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。
[0092] 实施例1 :
[0093] 取松香20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后 的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:1，体积比） 洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :3,体积比）洗脱15倍柱 体积，石油醚：丙酮=100 :3洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥，即为该提取物，收率1. 3%。
[0094] 实施例2 :
[0095] 取松香20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后 的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:1，体积比） 洗脱20倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :3,体积比）洗脱30倍柱 体积，石油醚：丙酮=100 :3洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥，即为该提取物，收率1. 5%。
[0096] 实施例3 :
[0097] 取松香20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后 的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:1，体积比） 洗脱20倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :3,体积比）洗脱40倍柱 体积，石油醚：丙酮=100 :3洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥，即为该提取物，收率1. 7%。
[0098] 实施例4 :
[0099] 取松香20g，经100mL乙醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后 的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:1，体积比） 洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :3,体积比）洗脱15倍 柱体积，石油醚：丙酮=100 :3洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，得到的高活性提取物，即 为该抗肿瘤的提取物，收率1. 2%，其C6细胞的抑制活性为IC5。= 39. 2 μ g/mL。
[0100] 实施例5 :
[0101] 取松香20g，经100mL丙酮超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后 的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:1，体积比） 洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :3,体积比）洗脱15倍 柱体积，石油醚：丙酮=100 :3洗脱液经回收有机溶剂，鼓风干燥，得到的高活性提取物，即 为该抗肿瘤的提取物，收率〇. 8%，其C6细胞的抑制活性为IC5。= 43. 7 μ g/mL。
[0102] 实施例6:
[0103] 取松香20g，经100mL氯仿超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后 的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:1，体积比） 洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :3,体积比）洗脱15倍 柱体积，石油醚：丙酮=100 :3洗脱液经回收有机溶剂，离心干燥，得到的高活性提取物，即 为该抗肿瘤的提取物，收率〇. 6%，其C6细胞的抑制活性为IC5。= 37. 3 μ g/mL。
[0104] 实施例7 :
[0105] 取松香20g，经100mL乙酸乙酯超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上 样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:1，体积 t匕）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100 :3,体积比）洗脱15 倍柱体积，石油醚：丙酮=100 :3洗脱液经回收有机溶剂，旋蒸干燥，得到的高活性提取物， 即为该抗肿瘤的提取物，收率〇. 8%，其C6细胞的抑制活性为IC5。= 44. 2 μ g/mL。
[0106] 实施例8:
[0107] 取松香20g，经100mL甲醇水混合溶剂（甲醇：水=1:1)超声提取15min，提取液浓 缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：丙酮混合溶剂（石 油醚：丙酮，100:1，体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮， 100 :3,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：丙酮=100 :3洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干 燥，得到的高活性提取物，即为该抗肿瘤的提取物，收率1. 〇%，其C6细胞的抑制活性为IC5。 =28.6 μ g/mL〇
[0108] 实施例9:
[0109] 取松香20g，经100mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=1:1)超声提取15min，提取液浓 缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：丙酮混合溶剂（石 油醚：丙酮，100:1，体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮， 100 :3,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：丙酮=100 :3洗脱液经回收有机溶剂，真空干 燥，得到的高活性提取物，即为该抗肿瘤的提取物，收率1. 3%，其C6细胞的抑制活性为IC5。 =26.1 μ g/mL〇
[0110] 实施例10 :
[0111] 取松香20g，经100mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=90:10)超声提取15min，提取 液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：丙酮混合溶剂 (石油醚：丙酮，100:1,体积比）洗脱10倍柱体积,继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙 酮，100 :3,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：丙酮=100 :3洗脱液经回收有机溶剂，冷冻 干燥，得到的高活性提取物，即为该抗肿瘤的提取物，收率1. 2%，其C6细胞的抑制活性为 IC50= 32. 9 μ g/mL〇
[0112] 实施例11 :固体分散体
[0113] 称取松香提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的质量比分 别放入烧杯中，加入无水乙醇，磁力搅拌器搅拌至松香提取物和载体完全溶解，转入旋蒸仪 中去除有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得松香提取物PVP包合物。
[0114] 实施例12 :环糊精包合物
[0115] 将环糊精与1~5倍水研匀，加松香提取物（水难溶性的应先溶于少量有机 溶剂中）充分研磨至成糊状物，低温干燥即得。
[0116] 实施例13 :分散片
[0117] 1.称取干燥的松香提取物，加入适量的十二烷基硫酸钠，使用70%的乙醇充分溶 解，加入水溶性淀粉与松香提取物（I : 1)，搅拌混合均匀，在70°C下干燥，粉碎，过100目筛， 得松香提取物分散体。
[0118] 2.精密称取处方量，松香提取物分散体，交联聚维酮，可压性淀粉，用70%乙醇做 湿润剂，边加入边搅拌，14目筛制成湿颗粒，室温下放置15min后，70°C烘箱烘干45min，16 目筛整粒，加入滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片。
【主权项】
1. 一种松香提取物，其特征为，维吾尔药松香经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶 柱分离，上样后的硅胶柱，用体积比为100 :0-100:1的石油醚：丙酮洗脱，再用体积比100 : 2-100 :3的石油醚：丙酮洗脱，得石油醚：丙酮=100 :2-100:3洗脱液，回收溶剂，干燥即得。2. 如权利要求1所述的松香提取物，其特征为，维吾尔药松香经溶剂超声提取，提取液 浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，用体积比为100:1的石油醚：丙酮洗脱，，再用体 积比100 :3的石油醚：丙酮洗脱，得石油醚：丙酮=100:3洗脱液，回收溶剂，干燥即得。3. 如权利要求1或2所述的松香提取物，其特征在于，所述的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、 氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂，优选甲醇或95%乙醇，提取物提取用 溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。4. 如权利要求1或2所述的松香提取物，其特征为，体积比100:1的石油醚-丙酮混合 溶剂的洗脱体积为2-50倍柱体积，优选2-40倍柱体积，更优选10倍柱体积。5. 如权利要求1或2所述的松香提取物，其特征在于，体积比100 :2-100:3或100:3的 石油醚-丙酮混合溶剂洗脱体积为2-50倍柱体积，优选2-40倍柱体积，更优选15倍柱体 积。6. -种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的松香提取物和药 学上可接受的载体。7. -种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的松香提取物或权利 要求6所述的药物组合物。8. 如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述的制剂为固体分散体、环糊精包合 物、分散片。9. 权利要求1-5任何一项所述的松香提取物或权利要求6所述的组合物或权利要求7 所述的药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、 胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤或肝癌。10. 权利要求1-5任何一项所述的松香提取物，其特征在于，用TLC法检测，其色谱条件 为：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮=6:1: 1，显色方法：香草醛-浓硫酸。
【文档编号】A61P35/00GK105982924SQ201510079798
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月15日
【发明人】王金辉, 黄健, 郑雅鑫
【申请人】沈阳药科大学