西藏扁芒菊挥发油及其在制药中的用图
【专利摘要】本发明属藏药制药领域，涉及西藏扁芒菊挥发油及其在制药中的用途，本发明从西藏扁芒菊植物中提取得到的挥发油，其中主要成分为甜没药烯萜醇；缬草酮；斯巴醇；石竹烯和绿花白千层醇等，经药理筛选CPE法和MTT法进行不同浓度梯度活性检测，结果证实所述的西藏扁芒菊植物挥发油有良好的抗炎和抗流感病毒活性。本发明的西藏扁芒菊植物提取的挥发油可用于制备抗炎、抗流感病毒或防治季节性流感的药物。尤其是用于制备防治人禽流感的药物；以及用于制备防治甲型H1N1型流感药物和防治季节性流感药物；本发明的所述的西藏扁芒菊挥发油还可用于制备解热药物。
【专利说明】
西藏扁芒菊挥发油及其在制药中的用途
技术领域
[0001] 本发明属藏药制药领域，涉及西藏扁芒菊挥发油及其在制药中的用途，具体涉及 来源于西藏扁芒菊植物挥发油在制备抗炎、抗病毒药药中的应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒（Influenza viruses)属正粘病毒科，是RNA病毒。据研究报道，流感病 毒核蛋白NP和基质蛋白Ml抗原性的不同，流感病毒可分为甲（A)、乙（B)和丙（C)三型， 该三种型的流感病毒均能感染人。其中，A型流感病毒根据其表面血凝素蛋白（HA)和神经 氨酸酶（NA)的结构以及其基因特性的不同又可分成若干亚型，至今发现的HA有16个亚型 H1-H16, NA有9个亚型N1-N9。研究显示，流感病毒具有很强的宿主特异性，人流感病毒识 别SAa 2,6Gal特异性受体，主要存在于人的呼吸道中，因此流感病毒会引起急性呼吸道传 染病，以及引起心肌炎、肺炎、支气管炎等多种并发症。据报道，季节性流感病毒株不断地在 亚洲演化，形成重叠性的流行蔓延；根据世界卫生组织的统计数据，全球每年有大约300万 至500万人因感染流感病毒而严重发病（P. Palese, M.L. Shaw, PA (2007)，pp :1647 - 1689 ; T.Ito et al. , Arch. Virol. , 140(1995), pp. 1163 - 1172) 〇
[0003] 流感病毒是至今未被有效控制的传染性疾病。目前，临床实践中应对流感病毒 的主要干预方式是采用疫苗和药物治疗。其中，抗流感病毒药物根据作用机制分为两类， 第一类是上市较早的离子通道阻断剂，以金刚烷胺和金刚乙胺为代表；第二类是神经氨酸 酶（NA)抑制剂；目前由美国FDA批准的抗流感病毒药物有磷酸奥司他韦（oseltamivir phosphate)，扎那米韦（zanamivir)和帕拉米韦（peramivir)三个抗流感病毒药物 (Centers for Disease Control and Prevention http://www. cdc. gov ;张强，赵庆杰， 等.药学，2010, 45 (3) : 289-299)。研究显示，迄今，国内外采用的抗流感病毒药物均存在有 一定的副作用，并且对最新流行的病毒株均存在有一定的耐药性，因此，开发新型抗流感病 毒药物是迫在眉睫。
[0004] 近年来植物挥发油除了用于芳香疗法，按摩疗法，个人护理等以外，在治疗抑 郁症、炎症、癌症等疾病发现有很多有利的科学证据，例如，紫苏属植物挥发油主要成 分中，发现1-紫苏醛（Ι-Perillaldehyde)可用于治疗抑郁症；香柠檬、蓝桉树挥发油 在流行性感冒上显现有潜在的效果；伊朗布留序（Bunium persicum)挥发油主要含有 gamma-砲品稀，茴香甲醛和对伞花经等，显示具有抗炎作用（Ito，et al. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2011, Jun 22, pp:1-5 ；Selvarani, James, American Journal of Essential Oils and Natural Products, 2014 ；2(1):47-53 ； Hajhashemi, et al., 2011, Pharm. Biol. 49, 146 - 151 ；ffu et al. , BMC Complement. Altern. Med.，10(2010)，p:69)。
[0005] 青藏高原其极端环境抚育着丰富多样的植物药用资源，同时其极端环境导致高原 疾病多样化。多源细菌和病毒引起的肺部感染是青藏高原人们常见的疾病，然而目前市场 上抗病毒药物对高原特殊流行性感冒未见有很好的治愈效果，如，尤其在2011年至2014 年期间在孩童、老人及青年各个年龄阶段的藏族人出现了因流行性感冒引起呼吸道感染疾 病，由于西药干预未见有治愈效果，导致患者最终选择长期服用藏药进行治疗。
[0006] 西藏扁芒菊（Waldheimia glabra(Decne. ) Rgl.)，藏名为"刚布"，是菊科扁芒菊 属植物，分布于印度北部、巴基斯担、阿富汗、苏联中亚地区，生长于我国青藏高原喜马拉雅 山脉及闪底斯山脉海拔4900~5500米的高山碎石坡石缝中，常以民间熏香或泡水喝等方 式用于预防和治疗感冒；亦见有部分医学书籍记载西藏扁芒菊植物全草在民间用于外感表 证、发热头痛、项背强痛等。《中国植物志报道》藏族群众有采用西藏扁芒菊植物全草干预感 冒等病症。
[0007] 鉴于目前国内外关于西藏扁芒菊在抗病毒和抗炎的研究工作属于空白的现状，虽 然有研究报道了涉及采集尼珀尔昆布地区的扁芒菊（Waldheimia)植物次生代谢产物及其 抗自由基酸类化合物随海拔浓度变化的研究工作（Annamaria Giorgi),其中采用顶空固相 萃取法对挥发性有机物化学成分分析，但是，该研究采集植物分布与本发明来源植物分布 不同，尤其生态环境有截然不同；该研究得到的主要化学成分与本发明拟提供的植物中提 取的挥发油成分不同；以及该研究尚未报道挥发油的药理活性等等，本申请的发明人拟提 供西藏扁芒菊挥发油及其在制药中的新用途，尤其是西藏扁芒菊植物挥发油的抗炎、抗流 感病毒活性的药物用途。
【发明内容】
[0008] 本发明目的是为克服现有技术的缺陷，提供新的抗病毒药物，涉及西藏扁芒菊挥 发油及其在制药中的用途，尤其涉及来源于西藏扁芒菊（W. glabra)植物提取的挥发油及 该挥发油在制备抗炎和抗流感病毒药物中的用途。
[0009] 本发明从西藏扁芒菊（W. glabra)植物中提取得到的挥发油，经药理筛选CPE法和 MTT法进行不同浓度梯度活性检测，结果证实西藏扁芒菊植物挥发油有良好的抗炎和抗流 感病毒活性。
[0010] 本发明所述的西藏扁芒菊即指扁芒菊属（Waldheimia)西藏扁芒菊种（W. glabra) 的全草。本发明的植物挥发油来源于西藏扁芒菊（W. glabra)植物挥发油。
[0011] 本发明的西藏扁芒菊挥发油通过下述方法制备：
[0012] 采用西藏扁芒菊植物干草粉碎，过筛后，用蒸馏水浸泡4h，然后用水蒸气蒸馏法提 取，得到1. 5 %的淡黄色精油。
[0013] 本发明对西藏扁芒菊挥发油进行了化学成分分析：
[0014] 西藏扁芒菊植物提取的挥发油用气相色谱-质谱检测（GC-MS)、分析，经搜索 NIST谱库以及标准样品比对结合人工解析质谱图，首次鉴定了 67个化合物，其中主要 成分为甜没药稀碗醇（a -Bisabolol，CAS#515_69_5) 20. 22 % ;缴草酬（Jatamansone CAS#1803-39-0) 11.79 %;斯巴醇（（-)-Spadhuleno#l 139-30-6)8.2 %;石竹烯 (Caryophyllene) 6. 06% ;绿花白千层醇（Viridiflorol) 5. 18%等。
[0015] 本发明进行了西藏扁芒菊挥发油抗流感病毒活性实验：
[0016] CPE法（细胞病变）检测西藏扁芒菊提取的挥发油对流感病毒A型的甲型流感病 毒A3 (H3N2) (A3/京科/30/95)(购买于上海疾控中心）的抑制作用，用MTT法检测西藏扁 芒菊提取的挥发油对MDCK细胞毒性，以利巴韦林作为阳性对照进行实验；结果显示所述的 挥发油浓度在100 μ g/ml时，CPE抑制率达到37. 5%，且无明显毒性，表明西藏扁芒菊挥发 油在中等剂量下有良好的抗流感病毒活性。
[0017] 本发明进行了西藏扁芒菊挥发油的抗炎药理实验：
[0018] 以LPS和PolyI = C为刺激剂，激活巨噬细胞系RAW264. 7的TLR4、TLR3受体，引发 下游的炎症反应，通过检测细胞上清中NO评估挥发油在抗LPS和Poly IC诱导的炎症的能 力强弱，同时用MTT法测定样品的细胞毒性。结果，西藏扁芒菊挥发油在20ug/ml时能显著 抑制LPS诱导的炎症，且无明显毒性。
[0019] 本发明的西藏扁芒菊植物提取的挥发油进一步可用于制备抗炎、抗流感病毒或防 治季节性流感的药物。尤其是所述的西藏扁芒菊植物提取的挥发油可用于制备防治人禽流 感的药物；以及用于制备防治甲型HlNl型流感药物和防治季节性流感药物；本发明的所述 的西藏扁芒菊挥发油也可用于制备解热药物。
【附图说明】
[0020] 图1是西藏扁芒菊（W. glabra)抗炎活性NO值，其中，Sample DJ(浓度分别为 4, 20, 100ug/ml)。
[0021] 图2是西藏扁芒菊（W. glabra)细胞毒性MTT值，其中，Sample DJ(浓度分别为 4, 20, 100ug/ml)。
[0022] 图3西藏扁芒菊（W. glabra)标准总离子谱图。
[0023] 图4 (：8至C 33标准离子谱图。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1提取制备西藏扁芒菊挥发油
[0025] 取西藏扁芒菊（W. glabra)干燥全草，用中药粉碎机粉碎，并过（40目）筛，称取 l〇〇g，用蒸馏水浸泡过夜。按照《中华人名共和国国家药典2010版附录XD》挥发油测定方 法提取4h，得1. 5 %的淡黄色精油；
[0026] 按照《中华人名共和国国家药典2010版附录XD》挥发油测定方法进行化学成分分 析；采用气相色谱-质谱检测（GC-MS)分析，色谱-质谱分析条件为如下：
[0027] 检测仪器：美国Thermo DSQ气相色谱-质谱联用仪；
[0028] 色谱条件：Hp_5MS 毛细管柱（5 % phenyl methyl siloxane， 30mX0. 25_Χ0. 25μπι)毛细管柱；进样口温度：250°C ;柱温：起始温度60°C，保持2min; 以15°C /min升至300°C，保持8min ;载气（He);流速：lmL/min ;分流比：200:1 ;进样量： l.OyL；
[0029] 质谱条件：电离方式EI，电离能量70eV，离子源温度250°C，传输线温度：250°C;扫 描范围（41-40(^11111) ;标准谱库：见31'库；
[0030] 经气相色谱-质谱分离检测得到的化合物质谱图在NIST库搜库，同时结合标 准样品的谱图比较，结合人工解析质谱图鉴定了 67个化合物，其中主要成分为下式的 (I )甜没药稀砲醇（a_Bisabolol，CAS#515-69_5)20. 22% ;( II )缴草酮（Jatamansone CAS#1803-39-0) 11. 79 % ;斯巴醇（（-)-Spadhuleno#1139-30-6)8. 2 % ; ( III )石竹烯 (Caryophyllene) 6. 06% ; (IV)绿花白千层醇（Viridiflorol) 5. 18%等。
[0031]
[0033] 实施例2西藏扁芒菊挥发油抗流感病毒活性筛选实验
[0034] 用MTT法检测制得的西藏扁芒菊挥发油对MDCK细胞毒性，CPE法（细胞病变）检 测所述西藏扁芒菊挥发油对流感病毒A型的甲型流感病毒A3 (H3N2) (A3/京科/30/95)(购 买于上海疾控中心），抑制作用，以利巴韦林作为阳性对照实验：
[0035] 首先，进行药物的细胞毒性检测，MDCK细胞在细胞培养板中培养形成单层后，加入 不同浓度的药液继续培养，以细胞病变或MTT染色法为观察指标，用Reed-Muench法计算药 物对细胞无毒的最大浓度（TD。）和半数中毒浓度（TD 5。）；
[0036] 其次，进行药物抗流感病毒作用检测，MDCK细胞培养形成单层后，用IOOTCId5。（含 胰蛋白酶）的流感病毒感染细胞，吸附2小时后，倾出病毒，再加入无毒浓度下的系列浓度 的含药培养液，继续培养；试验设病毒对照、细胞对照及阳性药物对照，以病毒对照孔出现 病变达75 %以上（即4+时），可终止试验；根据细胞病变程度CPE，用Reed-Muench法计算 半数有效浓度（IC5。）；结果显示所述挥发油在浓度100 μ g/ml时，CPE抑制率达到37. 5%， 且无明显毒性，表明西藏扁芒菊植物挥发有良好的抗流感病毒活性。
[0037] 表1是西藏扁芒菊细胞毒性检测和抗流感病毒A3 (H3N2)活性测试检测结果
[0038]
[0039] 实施例3西藏扁芒菊挥发油抗炎活性筛选实验
[0040] 以LPS和PolyI: C为刺激剂，激活巨噬细胞系RAW264. 7的TLR4、TLR3受体，引发 下游的炎症反应，通过检测细胞上清中NO评估挥发油在抗LPS和Poly IC诱导的炎症方面 的能力强弱：
[0041] 将RAW264. 7细胞消化后计数，按照4*105/ml种板，配制lmg/ml刺激剂、lmg/ml LPS贮存液、IOOuM DEX贮存液和0. 5mg/ml挥发油贮存浓度（配制浓度：8、40、200ug/ml终 浓度：4、20、100耶/1111);配制贮存液浓度 ：0.51^/1111，0130:1:800，加板后置于细胞培养箱 培养，之后取出收集上清（180ul/孔），用于测定相关炎症介质因子分泌，加 DMEM-IO% FBS 180 μ L，5mg/ml MTT 20 μ 1 (终浓度0. 45mg/ml)，继续培养4h，4h后，小心弃去上清，每孔 加 DMSO 200 μ 1，在振荡器上震荡10分钟，于570nm比色（吸光度越大，表明活细胞数量越 多），记录OD值，以亚硝酸钠溶液为标准溶液建立NO标准曲线（测量范围0-200umol/L)， 确定各组细胞上清中的NO水平；
[0042] 结果显示，西藏扁芒菊挥发油20ug/ml时能显著抑制LPS诱导的炎症，在IOOug/ ml，抑制炎症效果明显，但是在100ug/ml时抑制细胞增长能力增强（如图1、2所示），结果 表明，中等计量的西藏扁芒菊挥发油具有良好的抗炎作用。
【主权项】
1. 西藏扁芒菊挥发油，其特征在于，通过下述方法制备： 取西藏扁芒菊干燥全草，用中药粉碎机粉碎，过40目筛，用蒸馈水浸泡过夜，提取制得 淡黄色精油； 其中主要成分为下式所示的（I )甜没药締祗醇；（II )鄉草酬；斯己醇（(-); (III) 石竹締；（IV)绿花白千层醇；2. 按权利要求1所述的西藏扁芒菊挥发油，其特征在于，所述的西藏扁芒菊挥发油采 用气相色谱-质谱检测（GC-M巧分析其化学成分，色谱-质谱分析条件为如下： 检测仪器：美国化ermo DSQ气相色谱-质谱联用仪； 色谱条件 Wp-SMS 毛细管柱巧％ 地6115^1 meth}d siloxane，30mX0. 25mmX0. 25]im) 毛细管柱；进样口溫度：250°C ;柱溫：起始溫度60°C，保持2min ; W 15°C /min升至300°C， 保持8min ;载气化e);流速：1血/min ;分流比：200:1 ;进样量：1. 0 y L ; 质谱条件：电离方式EI，电离能量70eV，离子源溫度250°C，传输线溫度：250°C;扫描范 围（41-400amu);标准谱库：NIST库。3. 权利要求1所述的西藏扁芒菊挥发油在制备抗炎和抗流感病毒药物中的用途。4. 按权利要求3的用途，其中所述的抗流感病毒药物是防治人禽流感的药物。5. 按权利要求3的用途，其中所述的所述的抗流感病毒药物是防治甲型HlNl型流感药 物。6. 按权利要求1的用途，其中所述的抗流感病毒药物是是防治季节性流感药物。7. 权利要求1所述的西藏扁芒菊挥发油在制备解热药物中的用途。
【文档编号】A61P29/00GK105982936SQ201510287695
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年5月29日
【发明人】德吉, 卢燕, 陈道峰
【申请人】西藏大学