用于修复子宫内膜损伤的干细胞复合胶原支架试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于修复子宫内膜损伤的干细胞复合胶原支架试剂盒及其制备方法，其由人脐带间充质干细胞和胶原支架组成。其制备方法包括脐带间充质干细胞复苏、脐带间充质干细胞传代、脐带间充质干细胞与胶原支架复合培养的步骤。本发明试剂盒采用胶原支架脐带间充质干细胞进行内膜修复，与传统子宫内膜损伤后修复方法相比具有以下优点：胶原支架存在可为脐带间充质干细胞提供附着位点，使其定位于内膜损伤部位，有利于局部组织修复，提高修复有效性并减低细胞移位带来的危险性；同时胶原支架可促进细胞分化。
【专利说明】
用于修复子宫内膜损伤的干细胞复合胶原支架试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于妇产科学领域，具体设计一种用于修复子宫内膜损伤的干细胞复合胶原支架试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]子宫内膜严重损伤时内膜功能性修复障碍，代之以结缔组织增生修复，子宫前后壁发生纤维化，瘢痕形成，临床上主要表现为宫腔粘连、闭经及子宫性不孕等。如何重建这些患者的内膜并使其恢复正常的形态及功能是当今再生医学的难题之一。在研究的过程中，学者们提出过多种不同的治疗方式，如宫内节育器使用，球囊导管，粘连分离术后雌激素或者透明质酸应用等，各种治疗方式各有其优缺点，纵观文献报道的结果，这些治疗效果存在争议并且令人失望。因此，针对子宫内膜损伤亟需新型治疗方法。
[0003]随着多种不同来源的人体干细胞的发现和鉴定，干细胞的治疗应用可能性也在不断被发掘，并建立了再生医学这个新的医学分支，旨在利用干细胞治疗目前尚不能用药物治愈的疾病。
[0004]间充质干细胞(MSCs)为间质组织来源的与骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)生物学性状相似，具有多向分化潜能的细胞。MSCs是多潜能的成体基质细胞，能分化为多种间质起源的组织，如成骨、软骨和脂肪细胞，在特殊环境下，还能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝胰细胞等多种其他组织细胞。人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)即是MSCs的一种。与BM-MSCs相比，UC-MSCs的SH2、CD106和HLA-1表达低，OCT mRNA表达阳性，这说明脐带UC-MSCs是一种更原始的MSCs群。大量的体外实验证明，在不同诱导条件下，UC-MSCs不仅可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等，还可以向外胚层和内胚层来源的神经元样细胞和肝细胞样细胞分化。这提示我们可以利用UC-MSCs进行子宫内膜的修复。
[0005]由于人类子宫空腔结构的特殊性，利用干细胞的治疗很难将细胞定位到受损内膜处，细胞易随着血液、体液等流动发生组织扩散及损失，其临床应用的有效性和安全性受到制约，这要求在修复的同时能够为细胞在局部组织附着提供条件。胶原是细胞外基质的主要成分，其具有来源广泛、生物相容性良好、可降解、制备工艺简单等优点，同时体内外实验结果均证实胶原支架可为细胞提供附着位点并且能够促进细胞的分化。
[0006]在本发明之前，尚无UC-MSCs修复子宫内膜损伤的相关研究报道。胶原支架作为一种生物材料已经SFDA批准应用于临床皮肤及口腔黏膜修复中，具有良好的生物相容性、可降解性及安全性。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是用于修复子宫内膜损伤的干细胞复合胶原支架试剂盒，为脐带间充质干细胞提供附着位点，使其定位于内膜损伤部位，有利于局部组织修复，提高修复有效性并减低细胞移位带来的危险性。
[0008]—种用于修复子宫内膜损伤的干细胞复合胶原支架试剂盒，由人脐带间充质干细胞和胶原支架组成。
[0009]所述人脐带间充质干细胞由中国科学院遗传所干细胞库分离与培养，经流式细胞术细胞表面抗原鉴定:显示⑶14、⑶34和⑶45为阴性，⑶29、⑶44和⑶105为阳性，呈现为间质干细胞的特征。
[0010]所述胶原支架由烟台正海生物技术有限公司提供，已经SFDA批准应用于皮肤及口腔黏膜修复。
[0011]所述的严重子宫内膜损伤是指各种原因造成的子宫内膜过度损伤，内膜功能性修复障碍，代之以结缔组织增生修复，子宫壁发生纤维化，瘢痕形成。
[0012]本发明的另一个目的是提供一种上述用于修复子宫内膜损伤的干细胞复合胶原支架试剂盒的制备方法，其技术方案如下:
[0013]—种用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒的制备方法，包括以下步骤:
[0014](I)人脐带间充质干细胞复苏:将人脐带间充质干细胞解冻，加入完全培养液，接种于培养瓶中；
[0015](2)人脐带间充质干细胞传代:将上述步骤得到的人脐带间充质干细胞培养，进行传代；
[0016](3)人脐带间充质干细胞与胶原支架复合培养:将胶原支架剪裁，取上一步得到的脐带间充质干细胞，胰酶消化后制备单细胞悬液，取细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，从而制得用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒。
[0017]所述步骤(I)的具体步骤是:取出装有人脐带间充质干细胞的冻存管，立即放入水浴中，摇动，使其解冻，将细胞悬液转移至离心管，加入完全培养液，混合均匀；离心，弃上清；加入DMEM/F12完全培养液，接种于培养瓶中。
[0018]所述步骤(I)中，水浴温度为40°C，离心条件为:常温、1200rpm，5min。
[0019]所述步骤(2)的具体步骤为:培养每两天半量换液一次，培养至贴壁细胞90%融合时，进行传代；吸除培养瓶内的旧培养液；加入磷酸盐缓冲液(PBS)，轻轻摇动培养瓶，以洗去残留在瓶内的培养液，吸除磷酸盐缓冲液(PBS);培养瓶内加入胰酶，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；在倒置显微镜下观察，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入完全培养液终止消化；反复吹打瓶壁细胞，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液；将细胞悬液吸入离心管，离心，弃上清；用DMEM/F12完全培养液调整细胞浓度，接种于培养瓶中；置于培养箱培养。
[0020]所述步骤(2)中，离心的条件是:常温1200rpm，5min。
[0021]所述步骤(2)中，置于37°C、5% CO2、饱和湿度0)2培养箱中培养。
[0022]所述步骤⑵中，用DMEM/F12完全培养液调整细胞浓度为2 X 15个细胞/mL。
[0023]所述步骤(3)的具体步骤为:胶原支架剪裁成合适大小，UP面朝下，置于6孔板中，用培养基充分湿润，适当挤压去除内部空气；用无菌纱布将多余培养基吸干；取生长良好的第五代脐带间充质干细胞，胰酶消化后制备单细胞悬液，计数并调整细胞浓度；取细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，将6孔板放入培养箱中培养。
[0024]步骤(3)中，取细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，细胞数量约I X 106/cm2,将6孔板放入37°C、5% CO2培养箱中培养15min。
[0025]本发明的有益效果是:本发明试剂盒采用胶原支架脐带间充质干细胞进行内膜修复，与传统子宫内膜损伤后修复方法相比具有以下优点:胶原支架存在可为脐带间充质干细胞提供附着位点，使其定位于内膜损伤部位，有利于局部组织修复，提高修复有效性并减低细胞移位带来的危险性；同时胶原支架可促进细胞分化。脐带间充质干细直接分化为内膜组织或是分泌多种细胞因子促进内膜再生都可参与内膜损伤后修复，达到重建内膜目的。本发明所用人脐带间充质干细胞已有商品化产品、胶原支架已经SFDA批准应用于皮肤及口腔黏膜修复技术可控，安全性好，有利于干细胞治疗严重子宫内膜损伤的科学研究，保护实验动物福利。
【附图说明】
[0026]图1为流式细胞术脐带间充质干细胞表面标记测定；
[0027]图2为术后8、12周大体组织外观；
[0028]图3为术后8、12周离体组织手术区域HE染色观察；
[0029]图4为术后8、12周离体组织手术区域平滑肌免疫组化染色观察；
[0030]图5为术后8、12周离体组织手术区域腺体免疫组化染色观察；
[0031]图6为术后8、12周离体组织手术区域血管免疫组化染色观察。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0033]实施例
[0034]用于修复子宫内膜损伤的干细胞复合胶原支架试剂盒，由人脐带间充质干细胞和胶原支架组成。
[0035]人脐带间充质干细胞由中国科学院遗传所干细胞库分离与培养，经流式细胞术细胞表面抗原鉴定:显示⑶14、⑶34和⑶45为阴性，⑶29、⑶44和⑶105为阳性，呈现为间质干细胞的特征。
[0036]胶原支架由烟台正海生物技术有限公司提供，已经SFDA批准应用于皮肤及口腔黏膜修复。
[0037]严重子宫内膜损伤是指各种原因造成的子宫内膜过度损伤，内膜功能性修复障碍，代之以结缔组织增生修复，子宫壁发生纤维化，瘢痕形成。
[0038]上述用于修复子宫内膜损伤的干细胞复合胶原支架试剂盒的制备方法为:
[0039]步骤1，人脐带间充质干细胞复苏:取出冻存管，立即放入40°C水浴中，摇动，迅速解冻；将细胞悬液转移至15mL离心管，加入5mL完全培养液，混勾；离心(常温1200rpm，5min)，弃上清；加入DMEM/F12完全培养液，接种于培养瓶中。
[0040]步骤2，人脐带间充质干细胞传代:培养每两天半量换液一次，培养至贴壁细胞90%融合时，进行传代；吸除培养瓶内旧培养液；加入PBS lmL，轻轻摇动培养瓶，以洗去残留在瓶内的培养液，吸除PBS ;培养瓶内加入胰酶lmL，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；在倒置显微镜下观察，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入完全培养液ImL终止消化；反复吹打瓶壁细胞，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液；将细胞悬液吸入离心管，离心(常温1200rpm，5min)，弃上清；用DMEM/F12完全培养液调整细胞浓度为2 X 15个细胞/mL，接种于25cm2培养瓶中，每瓶5mL ;置37°C、5% CO2、饱和湿度CO2培养箱培养。
[0041]步骤3，人脐带间充质干细胞与胶原支架复合培养:胶原支架剪裁成合适大小，UP面朝下，置于6孔板中，用培养基充分湿润，适当挤压去除内部空气，用无菌纱布将多余培养基吸干；取生长良好的第五代脐带间充质干细胞，胰酶消化后制备单细胞悬液，计数并调整细胞浓度；取适量细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，细胞数量约IX 1fVcm2，将6孔板放入37°C、5% CO2培养箱中培养15min。
[0042]采用本发明制得的试剂盒进行试验，分别做自然修复组、空白胶原支架修复组、脐带间充质干细胞胶原支架修复组，进行对照试验，试验结果如下:
[0043]图2-6分别为术后8、12周大体组织外观、离体组织手术区域HE染色观察、离体组织手术区域平滑肌免疫组化染色观察、离体组织手术区域腺体免疫组化染色观察、离体组织手术区域血管免疫组化染色观察。
[0044]图2中，A、B、C 术后8周；C、D、E 术后12周；其中，A、D 自然修复组；B、E—一空白胶原支架修复组；C、F—一脐带间充质干细胞胶原支架修复组；
[0045]图3中，A-D:术后8周；E_H:术后12周；其中，A、E——正常子宫组织；B、F——自然修复组；C、G一一空白胶原支架修复组；D、H脐带间充质干细胞胶原支架修复组。A-H，20 X，标尺长度为1000 μ m。
[0046]图4中，A-D:术后8周；E_H:术后12周；其中，A、E——正常子宫组织；B、F——自然修复组；C、G一一空白胶原支架修复组；D、H脐带间充质干细胞胶原支架修复组。A-H，20 X，标尺长度为1000 μ m。
[0047]图5 中，A-D、A’ -D’:术后 8 周；E-H、E’-H’:术后 12 周；其中，A、A’、E、E’ ——正常子宫组织；B、B’、F、F’——自然修复组；C、C’、G、G’——空白胶原支架修复组；D、H脐带间充质干细胞胶原支架修复组。A-H，20X，标尺长度为1000 μm，A’-H’，100X，标尺长度为 500 μπ?ο
[0048]图6 中，A-D、A’ -D’:术后 8 周；Ε-Η、Ε’-H’:术后 12 周；其中，Α、Α’、Ε、Ε’ ——正常子宫组织；Β、B’、F、F’——自然修复组；C、C’、G、G’——空白胶原支架修复组；D、H脐带间充质干细胞胶原支架修复组。A-H，20X，标尺长度为1000 μm，A’-H’，100X，标尺长度为 500 μπ?ο
【主权项】
1.一种用于修复子宫内膜损伤的干细胞复合胶原支架试剂盒，其特征在于:由人脐带间充质干细胞和胶原支架组成。2.一种用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)人脐带间充质干细胞复苏:将人脐带间充质干细胞解冻，加入完全培养液，接种于培养瓶中； (2)人脐带间充质干细胞传代:将上述步骤得到的人脐带间充质干细胞培养，进行传代； (3)人脐带间充质干细胞与胶原支架复合培养:将胶原支架剪裁，取上一步得到的脐带间充质干细胞，胰酶消化后制备单细胞悬液，取细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，从而制得用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒。3.如权利要求2所述的用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)的具体步骤是:取出装有人脐带间充质干细胞的冻存管，立即放入水浴中，摇动，使其解冻，将细胞悬液转移至离心管，加入完全培养液，混合均匀；离心，弃上清；加入DMEM/F12完全培养液，接种于培养瓶中。4.如权利要求3所述的用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中，水浴温度为40°C ;离心条件为:常温，1200rpm，5min。5.如权利要求2所述的用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)的具体步骤为:培养每两天半量换液一次，培养至贴壁细胞90%融合时，进行传代；吸除培养瓶内的旧培养液；加入磷酸盐缓冲液，轻轻摇动培养瓶，以洗去残留在瓶内的培养液，吸除磷酸盐缓冲液；培养瓶内加入胰酶，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；在倒置显微镜下观察，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入完全培养液终止消化；反复吹打瓶壁细胞，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液；将细胞悬液吸入离心管，离心，弃上清；用DMEM/F12完全培养液调整细胞浓度，接种于培养瓶中；置于培养箱培养。6.如权利要求5所述的用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中，离心的条件是:常温，1200rpm，5min。7.如权利要求5所述的用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中，置于37°C、5% CO2、饱和湿度0)2培养箱中培养。8.如权利要求5所述的用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中，用DMEM/F12完全培养液调整细胞浓度为2 X 15个细胞/mL。9.如权利要求2所述的用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)的具体步骤为:胶原支架剪裁成合适大小，UP面朝下，置于6孔板中，用培养基充分湿润，适当挤压去除内部空气；用无菌纱布将多余培养基吸干；取生长良好的第五代脐带间充质干细胞，胰酶消化后制备单细胞悬液，计数并调整细胞浓度；取细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，将6孔板放入培养箱中培养。10.如权利要求2所述的用于修复子宫内膜损伤的干细胞试剂盒的制备方法，其特征在于:步骤(3)中，取细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，细胞数量约I X 1fVcm2，将6孔板放入37°C、5% CO2培养箱中培养15min。
【文档编号】A61L27/24GK105983133SQ201510051011
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月30日
【发明人】胡娅莉, 薛白, 曹昀, 颜桂军, 戴建武
【申请人】南京鼓楼医院