液体稳定的家禽病毒疫苗的制作方法

液体稳定的家禽病毒疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含禽类病毒的液体稳定的家禽疫苗。本发明还涉及这样的疫苗的制造和用这些疫苗接种动物主体的方法。
【专利说明】液体稳定的家禽病毒疫苗
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2014年2月17日提交的临时申请美国序列号61/ 940,627的优先权，其内容在此处以其整体通过引用并入。 发明领域
[0002] 本发明涉及包含活禽类病毒的液体稳定的家禽疫苗。本发明还涉及这样的疫苗的 制造和接种动物主体的方法。
[0003] 背景 存在大量可以感染家禽的病毒。这样的病毒包括传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法 氏囊病病毒（IBDV)、新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎（ILTV)、马立克氏病病毒(MDV)、火 鸡疱疹病毒(HVT)(其也被称为MDV3)和禽偏肺病毒(aMPV)。还存在许多可以感染家禽的细 菌，包括多杀巴斯德氏菌(Pasiet/reDa皿/_/iocic/a)、沙门氏菌属种（^almoeDa SSjO.)、大 肠杆菌、支原体属种(ifyc〇j〇_/as?a SSjO.)、副鸡禽杆菌(driAacieri? paragaDifiarar腫）、 丹毒菌属种(iiiysipeias sSj?.)、弯曲杆菌属种（CafflAf_/o/7acier sSj?.)、弧菌属种（Ki/^rio SSjO.)和产气荚膜梭菌（C7osirit/iu? joer/ri/^aos)。寄生虫，诸如艾美球虫，也 可以感染家禽。
[0004] 目前广泛接受的是，预防由于家禽中的细菌、寄生虫或病毒感染导致的疾病的最 佳方式是针对这些生物体接种它们。此外，可以安全地施用多价活的减毒病毒或细菌疫苗， 其限制需要的疫苗注射次数。因此，存在许多商业可得的多价活病毒疫苗，其防御多种病原 体。然而，迄今为止，当储存于液体溶液中时，活的减毒禽类病毒一直不稳定。因此，在其长 期储存前，大多数活的减毒禽类病毒疫苗是冻干的，即冷冻干燥的或冷冻的。活的减毒禽类 病毒通常作为在水中的悬浮液与保护剂混合，冷冻，并且然后通过在冻干过程期间的升华 和二次干燥脱水。冷冻和通过升华干燥的低温连同所涉及的低表面与体积比可需要长干燥 时间段，并且由此显著增加制造时间和成本。
[0005] 此外，在大型商业干燥过程中存在固有矛盾，这是由于:不能跨越整个产物负荷调 整储存温度，跨越干燥器的可变冷冻速度，边缘效应和辐射能效应。提高干燥温度以减少干 燥时间通常不是选项，因为干燥温度必须保持显著低于保护性蛋白基质的玻璃转化温度。 而且，长的不一致的干燥时间和/或高干燥温度通常导致对活的减毒病毒的结构性损伤，连 同其生物活性的显著丧失。
[0006] 因此，为了补偿功效的固有丧失，包含活的减毒病毒的冻干的家禽疫苗以增强的 滴度储存。然而，如果冻干过程实际上导致的活性丧失比预料的更少，这样的增加的滴度可 以导致显著的不利事件。因此，需要非常小心地配制疫苗，以使含有的病毒滴度不仅安全地 低于导致不利事件的量，而且鉴于由于冻干和后续储存的病毒滴度丧失而维持足够功效。 [0007]此外，存在对冻干小瓶的大小和/或这样的小瓶内含有的剂量数目的限制，这是由 于这些小瓶的顶部的标准塞子大小相对小。因此，大量液体变得难以通过相对小的开口升 华。因此，需要新的活的减毒禽类病毒疫苗，其可以使其病毒滴度可靠地保持在安全和有效 水平。
[0008] 此外，可用于大多数家禽疫苗的最小小瓶大小为1000个剂量。冻干疫苗的小瓶必 须在冷冻干燥饼的再水化之后以其整体使用。这对于必须购买大剂量大小来接种仅少量禽 类的越来越多的小家禽养殖户而言变得困难。因此需要其中可以经多天、多周或者甚至多 个月使用单一小瓶的家禽疫苗，由此降低成本且鼓励接种较小禽群(smaller flocks)。
[0009] 最终，可以用多达25,000个剂量/小瓶包装禽类疫苗，其随后由用户混合并置于饮 用水中或喷雾在禽群上。这要求用户去除金属密封环和塞子，通过将小瓶浸没于大桶水中、 然后将溶液用大搅拌器或桨叶混合而冲出冻干疫苗。这对于用户或疫苗旨在用于的家禽物 种都不卫生。事实上，处理冻干小瓶在疫苗受体(例如，禽类)居住的商业环境中是特别令人 烦恼的。
[0010] 本文任何参考文献的引用不应解释为承认此参考文献可用作本申请的"现有技 术"。
[0011] 发明概述 为了克服现有疫苗的缺陷，本发明提供新颖的液体稳定的活家禽病毒疫苗以及其相应 的免疫原性组合物。本发明的液体稳定的活家禽病毒疫苗可以持续长时间诸如6、7、9个月 或更长(例如，约1直至3年)保持有效。本发明还提供了将这样的疫苗施用于禽类的方法。本 发明进一步提供了通过施用本发明的疫苗来预防动物(例如，禽类)中的疾病的方法。
[0012] 因此，本发明提供了包含活病毒的液体稳定的疫苗，包括多价疫苗。在某些实施方 案中，所述活病毒是减毒病毒。在其他实施方案中，所述活病毒是重组病毒。在具体实施方 案中，所述活病毒是既减毒、又重组的。本发明的重组病毒还可以编码异源蛋白。在该类型 的具体实施方案中，所述异源蛋白是病毒或细菌抗原。
[0013] 在具体实施方案中，所述疫苗包含作为糖醇的糖添加剂和/或氨基酸。在某些实施 方案中，所述疫苗包含5至40% (w/v)的糖醇。在具体实施方案中，所述疫苗包含10至30% (w/v)的糖醇。在具体实施方案中，所述疫苗包含15至25% (w/v)的糖醇。在相关实施方案 中，所述疫苗包含10至20% (w/v)的糖醇。在其他实施方案中，所述疫苗包含20至25% (w/v) 的糖醇。在还有其他实施方案中，所述疫苗包含25至40% (w/v)的糖醇。在更具体实施方案 中，所述疫苗包含12至18% (w/v)的糖醇。在甚至更具体实施方案中，所述疫苗包含约15% (w/v)的糖醇。在相关实施方案中，所述疫苗包含约23% (w/v)的糖醇。在某些实施方案中， 本发明的液体稳定的病毒疫苗包含两种或更多种糖醇，其中液体稳定的疫苗中的糖醇的总 量为5-40% (w/v)。在其他这样的实施方案中，本发明的液体稳定的病毒疫苗包含两种或更 多种糖醇，其中液体稳定的疫苗中的糖醇的总量为25-40% (w/v)。
[0014] 在本发明的液体稳定的病毒疫苗的具体实施方案中，所述糖醇是山梨糖醇。在该 类型的一个替代实施方案中，所述糖添加剂是甘露醇。在相关实施方案中，所述液体稳定的 疫苗进一步包含作为非糖醇的糖添加剂，其中液体稳定的疫苗中的糖醇和非糖醇的总量为 15-40% (w/v)。在其他实施方案中，所述液体稳定的疫苗进一步包含作为非糖醇的糖添加 剂，其中液体稳定的疫苗中的糖醇和非糖醇的总量为25-40% (w/v)。在具体实施方案中，所 述非糖醇、糖添加剂是海藻糖。在还有其他实施方案中，所述非糖醇、糖添加剂是右旋糖。在 还有其他实施方案中，所述非糖醇、糖添加剂是蔗糖。在该类型的一个具体实施方案中，所 述糖添加剂是蔗糖（非糖醇）和山梨糖醇（糖醇）的组合。在该类型的一个更具体实施方案 中，所述糖添加剂是10-25%山梨糖醇和5-20%蔗糖的组合。在该类型的其他实施方案中， 所述糖添加剂是15-30%山梨糖醇和10-25%蔗糖的组合。在该类型的一个仍更具体实施方案 中，所述糖添加剂是15 %山梨糖醇和10 %蔗糖的组合。在具体实施方案中，所述非糖醇、糖 添加剂实际上是两种或更多种非糖醇、糖添加剂的组合。
[0015] 本发明的液体稳定的疫苗的pH范围可以为pH 6.0至pH 8.0。在某些实施方案中， pH范围为pH 6.5至pH 7.8。在具体实施方案中，pH范围为pH 6.8至pH 7.5。在其他具体实施 方案中，pH范围为pH 6.6至pH 7.4。在更具体实施方案中，pH范围为pH 7.0至pH 7.4。在一 个甚至更具体实施方案中，pH为7.2。
[0016] 本发明的液体稳定的疫苗可以包含缓冲液。在该类型的一个具体实施方案中，所 述缓冲液包含2.5至50 mM磷酸盐，例如磷酸钠(NaPHOS)或磷酸钾(KPHOS)。在一个相关实施 方案中，所述缓冲液包含5至25 mM磷酸盐。在具体实施方案中，所述缓冲液包含10至20 mM 磷酸盐。
[0017] 在还有其他实施方案中，所述缓冲液（即，缓冲溶液)可以进一步包含0.15至0.75 M精氨酸。在具体实施方案中，所述缓冲液包含2.5至50 mM磷酸盐和0.15至0.75 M精氨酸。 在更具体实施方案中，所述缓冲液包含5至25 mM磷酸盐和0.15至0.75 M精氨酸。在仍更具 体实施方案中，所述缓冲液包含10至20 mM磷酸盐和0.3至0.5 M精氨酸。在其他实施方案 中，所述缓冲液包含2.5至50 mM磷酸盐。在一个相关实施方案中，所述缓冲液包含5至25 mM Tris。在具体实施方案中，所述缓冲液包含10至20 mM Tris。在相关实施方案中，Tris缓冲 液包含组氨酸。
[0018] 本发明的液体稳定的疫苗可以包含氨基酸。在如上面详述的某些实施方案中，所 述氨基酸是精氨酸。在其他实施方案中，所述氨基酸是甲硫氨酸。在还有其他实施方案中， 所述氨基酸是甘氨酸。在还有其他实施方案中，所述氨基酸是谷氨酸。在相关实施方案中， 所述液体稳定的疫苗包含精氨酸和甲硫氨酸两者。在其他实施方案中，所述液体稳定的疫 苗包含精氨酸和甘氨酸两者。在还有其他实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含甘氨酸和 甲硫氨酸两者。在相关实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含谷氨酸和甲硫氨酸两者。在其 他实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含谷氨酸和甘氨酸两者。在还有其他实施方案中，所 述液体稳定的疫苗包含谷氨酸和精氨酸两者。
[0019] 在相关实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸。在其他 实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甘氨酸。在还有其他实施方案中， 所述液体稳定的疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸。在还有其他实施方案中，所述液体稳 定的疫苗包含精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。在还有其他实施方案中，所述液体稳定的疫苗包 含精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。在具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含精氨酸、甘氨 酸、甲硫氨酸和谷氨酸。
[0020] 在具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓 度为0.15至0.75 M。在相关实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨 酸的最终浓度为0.25至0.75 M。在更具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的精氨酸或 谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为〇. 2至0.6 M。在更具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗中 的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为〇. 2至0.5 M。在还有其他实施方案中，所述液体 稳定的疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为〇. 25至0.45 M。在甚至更具体实施 方案中，所述液体稳定的疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为约0.45 Μ。在其 他具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为约 0.3 M0
[0021]在具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的精氨酸连同谷氨酸和/或甘氨酸的 最终组合浓度为0.15至0.75 M。在相关实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的精氨酸连同 谷氨酸和/或甘氨酸的最终浓度为0.25至0.75 M。在其他实施方案中，所述液体稳定的疫苗 中的精氨酸连同谷氨酸和/或甘氨酸的最终组合浓度为0.2至0.6 M。在更具体实施方案中， 所述液体稳定的疫苗中的精氨酸连同谷氨酸和/或甘氨酸的最终组合浓度为〇. 3至0.5 M。 在还有其他实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的精氨酸和谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为 0.25至0.45 M。在甚至更具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的精氨酸连同谷氨酸和/ 或甘氨酸的最终组合浓度为约0.45 M。在其他具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的 精氨酸连同谷氨酸和/或甘氨酸的最终浓度为约0.3 M。
[0022]在具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为0.025至0.3 M。在相关实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为0.04至0.15 M。在 更具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为〇. 06至0.09 M。在甚 至更具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为约0.07 M。
[0023] 本发明的液体稳定的疫苗还可以包含稳定剂蛋白。所述稳定剂蛋白可以是完整蛋 白和/或蛋白水解物。在具体实施方案中，所述稳定剂蛋白是明胶。在更具体实施方案中，由 本发明的液体稳定的疫苗含有的稳定剂蛋白是0.4至1.6%明胶。在替代实施方案中，所述稳 定剂蛋白是完整酪蛋白的水解物。在该类型的具体实施方案中，由本发明的液体稳定疫苗 含有的稳定剂蛋白是〇. 5-2.0%的完整酪蛋白的水解物。在某些实施方案中，所述完整酪蛋 白的水解物是完整酪蛋白的蛋白水解的水解物。在还有其他实施方案中，本发明的液体稳 定的疫苗含有的稳定剂蛋白是乳球蛋白或乳清蛋白水解物。
[0024] 此外，本发明的液体稳定的疫苗还可以进一步包含螯合剂。这样的螯合剂可以包 括、但不限于：乙二胺四乙酸（EDTA)、1，2-双（邻氨基苯氧基）乙烷-Ν,Ν,Ν'，Ν'-四乙酸 (BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二巯基琥珀酸(DMSA)、二乙烯三胺五乙酸（DTPA)和2，3_二 巯基-1 -丙磺酸(DMPS)。本发明的液体疫苗中的这样的螯合剂浓度可以从约50 μΜ至10 mM 变化。
[0025]在具体实施方案中，所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。在该类型的某些实施方 案中，所述液体稳定的疫苗包含0.050至I mM EDTA。在具体实施方案中，所述液体稳定的疫 苗包含0.25至0.75 mM EDTA。在更具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含约0.5 mM EDTA。
[0026]在某些实施方案中，本发明的液体稳定的疫苗可以进一步包含一种或多种自由基 清除剂和/或抗氧化剂作为组分。在该类型的一个具体实施方案中，本发明的疫苗包含抗坏 血酸。在该类型的一个具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含约0.5 mM抗坏血酸。在一 个相关实施方案中，所述疫苗包含生育酚。在该类型的一个具体实施方案中，所述液体稳 定的疫苗包含约0.5 mM α-生育酚。在又另一个实施方案中，所述疫苗包含谷胱甘肽。在该 类型的一个具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含约3 mM谷胱甘肽。在又另一个实施 方案中，所述疫苗包含生育酚和抗坏血酸两者。在又另一个实施方案中，所述疫苗包含α- 生育酚和谷胱甘肽两者。在又另一个实施方案中，所述疫苗包含谷胱甘肽和抗坏血酸两者。 在又另一个实施方案中，所述疫苗包含抗坏血酸、生育酚和谷胱甘肽。
[0027] 在相关实施方案中，本发明的液体稳定的疫苗被保持在密封容器中。在该类型的 具体实施方案中，本发明的液体稳定的疫苗保持在密封容器中，所述密封容器具有在液体 上的惰性气体，诸如氩气、氮气或氦气(例如已经用所述惰性气体回填）。
[0028] 本发明的液体稳定的疫苗可以进一步包含佐剂。在该类型的具体实施方案中，所 述佐剂是磷酸铝。在其他这样的实施方案中，所述佐剂是氢氧化铝。在还有其他实施方案 中，所述佐剂是低分子量共聚物佐剂，其可以在溶液中形成交联以变成高分子量凝胶。在还 有其他实施方案中，所述佐剂由水中的丙烯酸钠的凝胶颗粒构成。在还有其他实施方案中， 所述佐剂是两种或更多种这样的佐剂的组合。
[0029] 在具体实施方案中，本发明的液体稳定的疫苗可以进一步包含去污剂和/或表面 活性剂。在该类型的某些实施方案中，所述表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。 在该类型的一个具体实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含约0.01%聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌 段共聚物。在该类型的一个具体实施方案中，所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物为 PLUR0NIC?F-68。
[0030] 本发明的液体稳定的疫苗可以包含活的减毒家禽病毒。在某些实施方案中，所述 活的减毒家禽病毒是传染性支气管炎病毒(IBV)。在其他实施方案中，所述活的减毒家禽病 毒是传染性法氏囊病病毒（IBDV)。在其他实施方案中，所述活的减毒家禽病毒是新城疫病 毒(NDV)。在还有其他实施方案中，所述活的减毒家禽病毒是传染性喉气管炎（ILTV)。在还 有其他实施方案中，所述活的减毒家禽病毒是禽偏肺病毒(aMPV)。在还有其他实施方案中， 所述活的减毒家禽病毒是马立克氏病病毒(MDV)。在还有其他实施方案中，所述活的家禽病 毒是火鸡疱疹病毒(HVT) JHVT在鸡中不致病。]。
[0031] 所述活的家禽病毒也可以是重组载体。这对于HVT和两种其他MDV(即，MDVl和 MDV2)尤其如此。编码来自新城疫病毒(例如，NDV"融合"蛋白或另外被称为NDV F蛋白）或传 染性喉气管炎病毒(例如，ILTV gl和gD蛋白）的抗原的重组HVT载体已经是商业可得的。更 近地，已经描述了编码来自NDV (NDV F蛋白）和ILTV (ILTV gl和gD蛋白）两者的抗原的独 特的重组HVT载体[参见，U.S. 8,932,604,其内容在此通过引用并入]。本发明的液体稳定 的疫苗可以包含任何如本文所述单独或任意组合的这些重组家禽病毒载体。
[0032] 因此，本发明的液体稳定的疫苗可以进一步包含灭活的病毒和/或灭活的细菌(例 如菌苗)和/或菌苗的亚级分。因此，本发明的包含一种或多种活病毒疫苗的任何液体稳定 疫苗可以进一步包含灭活的病毒和/或灭活的细菌和/或菌苗的亚级分，或者甚至减毒或未 减毒的寄生虫诸如活的艾美球虫。
[0033]在某些实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含活的减毒IBV、活的减毒IBDVjgHVT 和活的减毒MDV。在其他实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含活的减毒禽偏肺病毒、活的 减毒IBDV、活的减毒NDV和活HVT。在还有其他实施方案中，所述液体稳定的疫苗包含活的减 毒IBV、活的减毒IBDV、活的减毒NDV、活的减毒MDV和活的减毒aMPV。在还有其他实施方案 中，所述液体稳定的疫苗包含活的减毒IBV、活的减毒IBDV、活的减毒NDV、活的减毒MDVjg aMPV和活的减毒禽痘病毒。在任何这些实施方案中，活家禽病毒可以是编码异源抗原的重 组病毒载体。此外，本发明的任何液体稳定的疫苗还可以在施用前与一种或多种减毒或灭 活的细菌抗原诸如多杀巴斯德氏菌(/?*?iet/reDa iocic/a)、肠炎沙门氏菌（SahcMeDa enteritidis)、.掛\%%禽奸菌(Avibacterium paragallinarum)、产气英攛^梭蔑(Clostridium perfriZ^efis)和鸡败血支原体dcOjC^as/sa gaDisepiict/ffi)组合。本发明的液体稳定的疫 苗中可以包括的含有抗原和抗原组合的家禽疫苗(一价和多价两者）的实例可见于下表1A-IC中。
[0034] 本发明进一步提供了帮助保护禽类免于临床疾病的方法，所述临床疾病起因于禽 类病毒感染，所述方法包括将本发明的疫苗施用于动物。因此，本发明提供了包括向家禽施 用本发明的任何液体稳定的疫苗的方法。在某些实施方案中，所述施用经粘膜(通过滴眼或 饮用水)进行。在其他实施方案中，所述施用肠胃外进行。在还有其他实施方案中，所述施用 皮内进行。在还有其他实施方案中，所述施用经皮进行。在更具体实施方案中，本发明的疫 苗通过喷雾施用于动物。在还有其他实施方案中，所述施用通过卵内（i/3 ora)途径进行。在 其他具体实施方案中，本发明的疫苗肌内施用于禽类。本发明还包括初始和/或加强疫苗的 使用。
[0035] 在具体实施方案中，所述方法包括向禽类施用包含活病毒(例如，活的减毒病毒） 的本发明的液体稳定的疫苗。因此，在具体实施方案中，提供了施用本发明的液体稳定的疫 苗的方法，所述液体稳定的疫苗可以包含一种或多种活家禽病毒，所述活家禽病毒选自活 的减毒IBV、活的减毒IBDV、活HVT、活的减毒MDV、活的减毒禽偏肺病毒和/或活的减毒NDV。 在任何这些实施方案中，所述疫苗中的活家禽病毒可以是编码异源抗原的重组病毒载体。 此外，在施用本发明的任何液体稳定的疫苗之前、一起或之后，还可以施用一种或多种减毒 或灭活的细菌抗原诸如多杀巴斯德氏菌（/^asieureDa iocic/a)、肠炎沙门氏菌 (Salmonella enteritidis)、掛\鸡禽奸.舊(Avibacterium paragallinanm)、产气英锻^梭蔑 (Clostridium perfringens)和%%败in支爵、体（Mycoplasma gallisepticmi) 〇
[0036] 还提供了制备任何和所有本发明的液体稳定的疫苗的方法。在某些实施方案中， 该方法包括组合治疗有效量的活的减毒的病毒与例如5-40%糖添加剂(例如，糖醇或糖醇与 非糖醇的组合）、氨基酸和pH 6.0-ρΗ 8.0的缓冲溶液，以形成液体稳定的疫苗。所述氨基酸 可以是精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸，或精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和/或甲硫氨酸的组 合。在具体实施方案中，精氨酸和/或甘氨酸和/或谷氨酸在液体稳定的疫苗中具有0.15-0.75 M的最终浓度。在某些实施方案中，所述疫苗进一步包含液体稳定的疫苗中的0.025-0.3 M的最终浓度的甲硫氨酸。在具体实施方案中，治疗有效量的活的减毒病毒是治疗有效 量的活的减毒禽类病毒。在该类型的具体实施方案中，治疗有效量的活的减毒家禽病毒包 括治疗有效量的活的减毒IBV、活的减毒IBDV、活的减毒新城疫病毒、活的减毒马立克病病 毒和活的减毒禽偏肺病毒。在该类型的一个更具体实施方案中，治疗有效量的活的减毒家 禽病毒包括治疗有效量的活的减毒IBV、活的减毒IBDV、活的减毒新城疫病毒、活的减毒马 立克病病毒、活的减毒禽偏肺病毒和活的减毒禽痘病毒。
[0037]本发明的这些和其他方面通过参考下述详述将得到更好理解。
[0038] 发明详述 因为本发明的液体稳定的家禽病毒疫苗包含活病毒，例如活的减毒病毒，所以迄今为 止，在配制所述疫苗过程中需要特别小心，以使减毒病毒的滴度维持在安全地低于可以导 致显著不良事件的水平。事实上，大多数活的减毒家禽病毒疫苗是冻干的，并且冻干可以由 于冻干过程本身以及在长期储存过程中随时间的推移而导致活的减毒病毒疫苗功效的显 著下降。
[0039] 本发明已经通过提供液体稳定的家禽疫苗来克服该问题，所述液体稳定的疫苗甚 至在储存过程中也保持有效，而无需使活的减毒病毒抗原的初始滴度提高高于可靠的安全 水平。作为额外益处，本发明通过显著减少制备这样的安全且有效的疫苗所必需的活的减 毒家禽病毒的量而提供了用于降低所提供的疫苗的制造成本的方式。此外，本发明的活的 减毒家禽病毒疫苗比其冻干对应物更便于使用。因此，本发明提供了安全且有效的活的减 毒家禽病毒疫苗，其可以在冷藏温度作为液体储存，且仍保持稳定5至7个月、6至9个月、9至 12个月、12至18个月和/或18至24个月和/或甚至更长。不像其冻干的对应物，本发明的液体 稳定的疫苗不必一再水化就使用，因为它们总是水化的。由于家禽疫苗经常最少以1000剂 量小瓶呈现，具有较小农场的那些将仅使用他们购买的冻干疫苗中的一部分。用液体稳定 的家禽疫苗，较小农场可以继续数周或数月使用相同的疫苗小瓶，只要正确处理且不污染 所述疫苗。这为较小农场打开了全新的独占市场。
[0040] 而且，令人惊讶的是，本发明的液体稳定的活家禽病毒疫苗可以包括任何类型的 家禽病毒。因此，本发明的液体稳定的活病毒疫苗可以包括有包膜和无包膜的家禽病毒两 者。此外，本发明的液体稳定的活病毒疫苗可以包括具有单链RNA基因组、单链DNA基因组或 双链DNA基因组的活的减毒家禽病毒。
[0041] 为了方便起见在说明书中使用单数术语绝非期望是如此限制性的。因此，例如，除 非另有说明，提及"糖添加剂"包括提及这样的糖添加剂中的一种或多种。除非另有说明，复 数术语的使用也不期望是限制性的。类似地，当在本文中指示为任一时，可以被称为酸或其 相应碱的化合物意指该化合物的任一形式，除非另有说明。因此，术语谷氨酸的使用意欲包 括谷氨酸盐，并且反之亦然。
[0042] 如本文所使用，术语"家禽"可以包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和野鸡。
[0043]如本文所使用的术语"禽类(avian)"和"禽类(fowl)"可以互换使用，其中两个术 语均意欲包括如上所定义的家禽。
[0044] 如本文所使用，"疫苗"是适合于应用于动物(在某些实施方案中，包括人）的组合 物，在施用于动物后，所述组合物诱导免疫应答，其强度足以最低限度地帮助防御起因于由 野生型微生物感染的临床疾病，即强度足以帮助预防临床疾病，和/或预防、改善或治愈临 床疾病。除非另有明确说明，术语疫苗的使用包括多价疫苗。
[0045] 如本文所使用，"多价疫苗"是包含两种或更多种不同抗原的疫苗。在该类型的具 体实施方案中，所述多价疫苗刺激受体的免疫系统预防两种或更多种不同病原体。
[0046] 如本文所使用，"液体稳定的"疫苗是作为液体维持的疫苗(包括液体多价疫苗）， 当储存于或低于7°C(例如在标准冷藏库中，和/或在(TC_7°C)时，所述疫苗持续至少六个月 保持有效。在具体实施方案中，当在7 °C或低于7 °C储存至少9个月时，液体稳定的疫苗保持 有效。在更具体实施方案中，当在7 °C或低于7 °C储存至少1年时，液体稳定的疫苗保持有效。 在甚至更具体实施方案中，当在7°C或低于7°C储存至少1.5年时，液体稳定的疫苗保持有 效。在仍更具体的实施方案中，当在7°C或低于7°C储存至少2.0-3年时，液体稳定的疫苗保 持有效。
[0047] 如本文所使用，术语"保护"（〃protect〃、〃protecting〃）、"提供保护"（"provide protection to〃、''providing protection to 〃）和"帮助保护"（〃a i ds in the protection")不要求免于任何感染指征的完全保护。例如，"帮助防御"可以意指保护是足 够的，使得在攻击之后，潜在感染的症状至少被减少，和/或引起症状的潜在细胞、生理学或 生物化学原因或机制中的一种或多种被减少和/或被消除。如本上下文中所使用，应当理解 "减少的"意指相对于感染状态，包括感染的分子状态，而不只是感染的生理学状态。
[0048]术语"预防有效量"是指组合物的量，当施用于家禽时，所述量显著降低由于给定 病原体导致的感染/侵染的可能性和/或程度。
[0049] "整体预防(Metaphylaxis)"是对整组动物及时群体用药以消除或尽可能降低疾 病的预期爆发，例如在处于感染/侵染的高风险中的一个或多个动物中。
[0050] 术语"化学预防"是指施用药物/治疗，例如，一种或多种预防组合物，用于预防或 减少病毒、细菌和/或寄生虫感染/侵染;和/或预防或降低与该感染/侵染相关的疾病和/或 症状的目的。
[0051] 术语"预防组合物"是指单独或与其他药剂组合使用的任何药剂，其显著降低家禽 中由于给定病原体导致的感染/侵染的可能性和/或程度。在一个这样的实施方案中，所述 家禽处于在混杂(commingling)、天气变化、营养变化和/或可以起始（由药剂或药剂的组合 靶向的）与通常与家禽相关的病毒、细菌或寄生虫病原体的存在相关的症状和/或疾病的其 他应激源(stressor)之后发生家禽呼吸系统疾病的高风险中。
[0052]如本文所使用，术语"治疗有效量"是给定抗原（例如活的减毒家禽病毒）的量，当 在单一施用中提供时和/或当预期，作为伴随一个或多个后续加强施用的初始施用提供时， 所述量足以提供保护和/或帮助防御这样的病原体，施用该抗原以针对所述病原体进行防 御。
[0053] 如本文所使用，"有效的"疫苗包含治疗有效量的给定抗原。"有效的"疫苗对于给 定抗原保留足够滴度以符合该抗原对于施用所述疫苗的管辖的法规要求，例如，在美国的 疫苗的施用由美国农业部(USDA)管理。
[0054] 如本文所使用，术语"药学上可接受的"作为形容词使用，以意指被修饰的名词适 合于用于药物产品中。当其例如用于描述药物疫苗中的赋形剂时，其将赋形剂表征为与组 合物的其他成分相容，并且不对预期受体不利地有害。
[0055]术语"载体"是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。药学上可接 受的载体可以是无菌液体，诸如水和/或油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如 花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液盐水溶液和糖(例如，右旋糖和/或甘油）水 溶液可以用作载体，特别是用于可注射溶液。此外，所述载体可以是和/或包含水胶体和/或 聚合物溶液，例如，以使待喷在禽类上的家禽疫苗变稠。
[0056]如本文所使用，"佐剂"是这样的物质，其能够有利于或放大免疫学事件级联，最终 导致更好的免疫应答，即针对抗原的整合的身体应答。佐剂通常不是免疫应答发生所需的， 但有利于或放大该应答。
[0057]如本文所使用，"全身施用"是施用至身体的循环系统（包含心血管和淋巴系统） 内，因而影响作为整体的身体而不是特定部位，诸如胃肠道(经由例如口服，在其上喷雾)和 呼吸系统(经由例如滴眼施用）。全身施用可以例如通过施用到肌肉组织内（肌内）、真皮内 (皮内、经皮或真皮上（supradermal))、皮肤下方(皮下）、粘膜下方(粘膜下）、静脉中（静脉 内）等来进行。
[0058] "肠胃外施用"包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射和输 注。
[0059] 如本文所使用，"卵内（i/2 〇ra)"是施用入禽类仍然在其内部生长的蛋中。该类型 的施用可以导致疫苗被同时在蛋中的禽类口服摄入，或者可以被意外地肌内注入，或者可 以通过卵黄囊被吸收。
[0060] 如本文所使用，"糖添加剂"是5-12碳糖(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、 葡萄糖、果糖、半乳糖)或糖醇/多元醇(例如山梨糖醇、甘露糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、麦芽糖 醇、甘油）。除非另有具体相反说明，所述糖添加剂的百分比(％)被提供为疫苗中的糖添加剂 的重量(W)比疫苗体积(V)，(w/v)。
[0061 ]如本文所使用，"非还原糖"是糖添加剂，其在碱性含水介质中不生成含有醛基的 任何化合物。本发明的非还原糖的实例包括蔗糖和海藻糖。
[0062]如本文所使用，术语"非糖醇"和"非醇糖"可以互换使用。作为如本文所使用的"非 糖醇"（或"非醇糖"）的糖添加剂可以是不是糖醇的任何糖添加剂，例如，非还原糖。
[0063]如本文所使用，除非另有具体相反说明，疫苗中的固体添加剂(例如，糖添加剂或 明胶)的百分比(％)基于1%溶液，其为Ig固体/100 ml疫苗体积(w/v)。
[0064] 如本文所使用，除非另有具体相反说明，疫苗中的液体添加剂(例如，乙醇）的百分 比（％)基于1%溶液，其为I ml的液体添加剂/100 ml疫苗体积(v/v)。
[0065] 如本文所使用，术语"近似"与术语"约"可以互换使用，并且通常表示值在所示值 的25%之内，8卩"约"2 mM EDTA的浓度可以是1.5 mM至2.5 mM EDTA，除非另有说明。
[0066]如本文所使用，除非另有具体相反说明，提供的pH值是在25°C测定/测量的pH值。 [0067]因为本发明的液体稳定的疫苗理想的pH范围为pH 6.0至pH 8.0,所以本发明的液 体稳定的疫苗可以包含缓冲液。用于本发明的液体稳定的疫苗中的缓冲液包括但不限于： 磷酸钾、磷酸钠、Tris、Tr is-组氨酸、BIS-Tri s、BI S-Tr is-丙烷、焦磷酸钠或焦磷酸钾、咪 唑、PIPES、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、三（羟甲基）甲基甘氨酸、甘氨酰甘氨酸和HEPES。可 以使用任何合适的抗衡离子，使缓冲液达到期望的pH。
[0068] 可以用于本发明的液体稳定的疫苗中的全酪蛋白的水解物可以通过许多程序获 得，包括例如作为酸性水解物或酶促水解物获得。这样的水解物含有混合的氨基酸和肽的 形式，其具有最初存在于酪蛋白中的所有氨基酸。可以用于本发明的液体稳定的疫苗中的 全酪蛋白的一种胰水解物作为CASEIN HYDROLYSATE ENZYMATIC?由MP Biomedicals销售。 相当产品以NZ-AMINE?、NZ-AMINE? A、NZ-AMINE? AS和NZ-AMINE? B以及Tryptone的名称由 Sigma-Aldrich 销售。
[0069] 本发明的疫苗可以包含的水胶体的实例包括：明胶、淀粉聚合物和树胶，诸如黄原 胶、角叉菜胶和阿拉伯胶(阿拉伯树胶）。
[0070] 多价疫苈本发明提供了液体稳定的多价疫苗。本发明的液体稳定的多价家禽疫 苗可以包括两种或更多种抗原，其包括以下活的减毒家禽病毒中的一种或多种：IBV、IBDV、 NDV、MDV、ILTV、aMPV和/或编码一种或多种异源抗原的重组HVT。如上所示，本发明的液体稳 定的多价家禽疫苗还可以包括以下活的减毒病毒中的一种或多种：IBV、IBDV、NDV、ILTV、 MDV、aMPV和/或编码一种或多种异源抗原的重组HVT连同一种或多种灭活的家禽病毒。
[0071]此外，本发明的液体稳定的疫苗还可以随后在施用前与一种或多种活的减毒或灭 活的细菌疫苗和/或未减毒或减毒的寄生虫诸如艾美球虫组合，所述细菌疫苗包含抗原诸 如多杀巴斯德氏菌(Pasiet/re_/_/a /Jiocic/a)、肠炎沙门氏菌（e/3ieriiic/is)、 爵\离禽奸菌（Avibacterium paragallinarimi)、产气英膜梭麗（Clostridium perfringens) 和鸡败血支原体(#7c〇jC^as?a gaDisepiict/ffi)。本发明的液体稳定的疫苗中可以使用的一 价和多价疫苗的实例提供于下表1A-1C中： 表1A 活病毒疫苗
[0
[0073]表1C
[0074] 佐游本发明的疫苗可以含有佐剂，或可选地不含佐剂，其经常取决于疫苗含有的 一种或多种抗原。在具体实施方案中，所述佐剂包含铝盐。已经描述了结合使用铝盐和活病 毒疫苗。在具体实施方案中，所述铝盐选自磷酸铝、磷酸铝钾和氢氧化铝。一种磷酸铝佐剂 是REHYDR0PH0S? (General Chemical, Parsippany,New Jersey)。氢氧化错佐剂的实例包 括：REHYDR0GEL?、REHYDR0GEL? HPA或REHYDROGELeLV (General Chemical, Parsippany, New Jersey)。其他众所周知的佐剂包括经油、聚合物、阜苷类和/或由水中的丙稀酸钠的凝 胶颗粒构成的佐剂，例如，MONTANIDE? PET GEL A? (Seppic, Paris France)。一种低分 子量共聚物佐剂可以在溶液中形成交联以变成高分子量凝胶，例如P〇LYGEN? (MVP Laboratories, Omaha)。当添加时，疫苗中的佐剂的量通常在约1%_20% (v/v)之间。在具体 实施方案中，所述佐剂的量在约2%_10% (v/v)之间。在更具体实施方案中，所述佐剂的量在 约3%-6% (v/v)之间。
[0075] 疫庶疏頌:本发明的液体稳定的病毒疫苗可以通过任何方便方式施用，例如通过 全身施用，包括通过肠胃外施用，诸如但不限于皮下或肌内施用。本发明的液体稳定的病毒 疫苗还可以通过粘膜施用，诸如通过在其上喷雾、经口、卵内和/或眼施用进行施用。或者， 所述疫苗可以经由皮肤贴剂、在延迟释放植入物中、划痕或局部施用进行施用。考虑本发明 的液体稳定的病毒疫苗还可以经由受体家禽的饮用水和/或食物进行施用。
[0076] 本发明的疫苗(包括多价疫苗)还可以作为组合疗法的一部分施用，所述组合疗法 即除了疫苗自身之外，还包括施用一种或多种额外的活性剂、疗法等的疗法。在该情况下， 应认识到构成"治疗有效"量的疫苗量可以多于或少于疫苗单独施用时将构成"治疗有效" 量的疫苗量。其他疗法可以包括本领域已知的那些，诸如，例如止痛药、退烧药、祛痰药、抗 炎药、抗组胺剂、和/或流体的施用。
[0077] 在本发明方法的某些实施方案中，适合于粘膜施用的本发明的病毒疫苗包含以下 中的一种或多种：活的减毒IBV、活的减毒IBDV、活的减毒MDV、活的减毒ILTV、活的减毒 aMPV、活的重组HVT病毒和活的减毒NDV。在更具体实施方案中，适合于粘膜施用的本发明的 病毒疫苗进一步包含活的减毒IBV和以下中的一种或多种:活的减毒IBDV、活的减毒MDVjg 的减毒ILTV、活的减毒aMPV、活的重组HVT病毒和活的减毒NDV。
[0078] 免疫原性水平可以通过本领域通常已知的疫苗剂量滴度和攻击研究技术实验测 定。这样的技术通常包括用不同剂量的疫苗接种许多动物主体，并且然后用剧毒病毒攻击 动物主体，以测定最低保护剂量。
[0079] 影响优选剂量方案的因素可以包括例如主体的物种或品种(例如禽类的物种或品 种）、年龄、重量、饮食、活动、肺大小，和状况;施用途径;使用的特定疫苗的功效、安全性和 免疫持续时间概况;是否使用递送系统；以及疫苗是否作为药物和/或疫苗组合的一部分施 用。因此，实际上采用的剂量可以对于特定动物不同，并且因此可以偏离上文所述的典型剂 量。这样的剂量调整的确定通常在使用常规方法的疫苗开发领域技术人员的技术内。
[0080] 类似地，可以与这样的剂量一起施用的体积通常在0.01 mL(滴眼应用）至2.0 mL 之间。对于肌内施用，施用体积的典型范围在0.03至1.0 mL之间，并且为约0.1至0.5 mL。
[0081] 关于向禽类主体施用给定疫苗的次数的决定中将包括所述禽类主体是否饲养用 于肉、用于产蛋或作为宠物。因此，考虑疫苗可以单次施用，或替代地经数天、数周、数月或 数年两次或更多次施用于疫苗受体。在一些实施方案中，所述疫苗施用至少两次。在某些这 样的实施方案中，例如，所述疫苗施用两次，其中第二剂量(例如加强剂量)在第一剂量后至 少2周施用。在具体实施方案中，所述疫苗施用两次，其中第二剂量在第一剂量后不长于8周 施用。在其他实施方案中，第二剂量在第一剂量后1周至2年、在第一剂量后1.5周至8周、或 在第一剂量后2周至4周施用。在其他实施方案中，第二剂量在第一剂量后约3周施用。
[0082] 在上述实施方案中，第一和后续剂量可以诸如在量和/或形式方面不同。然而，通 常，剂量在量和形式方面是相同的。当仅施用单一剂量时，该单独剂量中的疫苗量通常包含 治疗有效量的疫苗。然而，当施用超过一个剂量时，那些剂量中的疫苗量一起可以构成治疗 有效量。此外，可以初始施用疫苗，并且然后2至12周之后可以施用加强剂量，如上文所讨 论。然而，疫苗的后续施用可以在每年（1年)或每两年(2年)基础上进行，无论是否施用加强 剂量。
[0083]本发明的疫苗还可以含有抗菌剂，诸如抗生素。这样的抗生素的实例可以包括： 10-1000 yg/mL庆大霉素、0.5-5.0 ug/mL两性霉素 B、10-100 ug/mL四环素、10-100单位/mL 制霉素(制霉菌素）、10-100单位/mL青霉素、10-100 yg链霉素、10-100 yg多粘菌素 B和10-100 yg新霉素。
[0084]通过参考以下非限制性实施例，本发明可以得到更好理解，所述实施例作为本发 明的示例提供。呈现以下实施例以便更完全地说明本发明的实施方案。然而，其决不应解释 为限制本发明的宽范围。 实施例
[0085] 液体家禽病毒疫苗的稳定性 材料和方法 原料(bulk)抗原制备:冷冻原料IBV病毒抗原从生产获得并保持在〈-60°C，直到共混疫 苗时。IBV原料抗原具有约9.1 Iog1O(EID5Q)的滴度。
[0086]材料：细胞培养或更高级的鹿糖和山梨糖醇购自Fisher Scientific。具有高于 98%的纯度的分子生物学级L-精氨酸单盐酸盐购自Sigma13NZ胺(bloom 250)溶液从最好可 用的商业试剂制备。已经制备并通过高压灭菌或0.2 um过滤而灭菌以下溶液:80% (w/v)蔗 糖，70% (w/v)山梨糖醇，1.2 M L-精氨酸单盐酸盐，1.0 M磷酸钾缓冲液(pH 7.2)，胰蛋白 君系磷酸盐培养液(TPB)溶液和250 mg/mL庆大霉素。
[0087] 禮定系/溶液肩/疫鹿共凝游冰源苷最终疫苗共混物的pH可对于液体中的病毒的稳 定性是至关重要的。使用非常灵敏的PH探头和仪表测量pH。所述仪表显示pH至小数点右侧 的3个有效数字。存在分开的具有仪表的温度探头，且两者均必须在溶液中，并且是稳定的。 该pH仪表能够生成5点校准曲线，其中3点是绝对最小值。在疫苗共混物制备过程中，在添加 病毒抗原前将稳定剂溶液的pH调节至目标pH，并且在混合稳定剂溶液和病毒抗原之后再次 测量pH。
[0088] 稳定系/溶液游歲播厂旦已经进行初始pH调节，使用0.2 μΜ过滤器过滤灭菌所有 制剂(仅仅由于改进的过滤器容量，PES是优选的过滤器基质）。目前使用真空进行过滤。真 空过滤的第二个益处是制剂的额外脱气。制剂已经过滤灭菌之后，将其用氩气鼓泡以增加 O2的耗竭，希望这将随时间得到制剂的较低反应性。一旦鼓泡完成，在储存前放置氩气覆盖 (argon overlay)，并进行紧密密封。制备制剂之后，在期望的温度(例如，4°C、15°C或25°C) 将pH证实/调节至pH 7.2, 即，对于本文进行的许多实验，期望的温度为4°C。如果已经正确 地进行配制和先前的程序，则pH应当接近于目标pH。在过夜孵育下，pH可能由于完成与较早 的PH调节和进一步脱气相关的化学反应而略微偏移。
[0089] 靜冻病毒原料贫展在室温（15-30°C )或在冷藏温度（2-8°C )缓慢解冻冷冻的抗 原。解冻的抗原应当在使用前在2_8°C保持不超过8小时。
[0090] 疫房龙凝游游歡备为了制备200mL疫苗共混物，首先将如表3中所列的所示体积 的各储备溶液添加至灭菌的容器，并且使用搅拌棒混合稳定剂和赋形剂。充分混合稳定剂 溶液和所有赋形剂之后，将所示体积的病毒抗原添加入容器并充分混合。在该混合步骤过 程中避免气泡和泡沫的生成。当在非常短时间段(几分钟）内添加病毒时，则可以添加病毒， 而没有任何进一步问题。当不立即添加病毒时，将氩气覆盖实施到位，以替代残余的〇 2。一 旦已经添加病毒，则在混合前将新的氩气覆盖实施到位。使用低流速将氩气添加至瓶中。疫 苗共混完成之后，将疫苗共混物保持在2-8°C，直至分配成小等分试样。
[0091] _#充疫溃將疫苗共混物以1.8 mL/小瓶分配入玻璃安瓿小瓶中。然后用氩气回填 并覆盖各小瓶。将安瓿小瓶火焰密封、标记，然后转移入盒，并在指定温度储存于培养箱中。 [0092] 在身溫肩/其廣# M禮定倥漱试將安瓿小瓶中的液体IBV疫苗分别在15°C和4 °(：储存于相应的培养箱中。在指定时间点，从各制剂取回2个或更多小瓶，并且各抗原的滴 度通过基于蛋的滴定测定进行测量，且被报道为平均蛋感染剂量(EID 50)。
[0093] 分析方法 在干净细胞环境中进行所有胚胎感染剂量测定。在II类生物安全柜中在无菌条件下进 行操作和稀释。在任何操作前将蛋表面消毒，并且所有瓶、吸管、吸头和稀释管在使用前必 须消毒。所有培养基和相关成分必须是无菌的。
[0094] 效汾/麗定:用于测定给定传染性支气管炎病毒储备物的效价的优选方 法是测定在含胚、无特定病原体的鸡蛋中的感染性。通过用含有29 yg/mL庆大霉素的胰蛋 白1:1磷酸盐培养液(TPB)中稀释的0.1 ml病毒流体将9至11日龄胚胎接种于尿囊腔中而测 定病毒储备物的几何平均滴度(GMT)。每次测试应当使用四个和六个之间的稀释度(不超过 十倍），并且每次稀释应当接种最少五个胚胎。将蛋在38 - 39°C和60-70%的相对湿度下孵 育七天，并且每天对光检查。应当忽视前24小时过程中发生的死亡，但接种后第2天和第7天 之间的死亡率被认为是病毒特异性的。各稀释度中至少四个活胚胎应当活过24小时的有效 测试。7天孵育之后，针对典型IBV感染的证据，诸如肾脏的中肾中的下沉积物或尿酸盐沉积 物（down or urate deposits)的萎缩（stunting)、卷曲（curling)、形成 t午状（clubbing)， 检查胚胎。为了比较目的，用充当阴性对照的TPB稀释剂接种最少六个蛋，并且测定制备的 具有已知滴度的IBV DE-072的参考，并将其用作阳性对照。令人满意的滴定应当具有至少 一个具有50%至100%阳性率的稀释度和至少一个具有50%至0%阳性率的稀释度。可以使用 Reed和Muench或Spearman-KSrber方法计算平均胚胎感染剂量(EID5Q)。为了更准确，推荐每 个测试的样品储备物进行至少3次重复滴定，并测定平均GMT。
[0095] 结果和结论 IBV的几种潜在的液体稳定的制剂显示于表2中。这些制剂用于评估不同的稳定剂和赋 形剂对于液体中的IBV稳定性的贡献。稳定剂#17是由于低稳定性而在<-50°C冷冻销售的商 业产品的制剂。稳定剂#17含有3.3% (w/v) NZ胺和3.3% (w/v)蔗糖作为稳定剂。制剂P-Ol、 P-02和P-03是三种含有糖添加剂（山梨糖醇和蔗糖)和L-精氨酸作为稳定剂的制剂。表2显 示对于各制剂的最终疫苗共混物中的各稳定剂或赋形剂的最终浓度。所有制剂都使用1 〇 mM KP04作为缓冲液以提供约7.2的pH值，且所有四种制剂都含有1.0 mg/mL庆大霉素作为 防腐剂。所述制剂的目标pH为7.2，且与IBV抗原共混之后的实际pH为约pH 6.8至7.2。制剂 P-Ol含有15% (w/v)山梨糖醇和0.3 M L-精氨酸作为稳定剂。制剂P-02含有15% (w/v)山梨 糖醇和0.45 M L-精氨酸作为稳定剂。制剂P-03含有15% (w/v)山梨糖醇、10% (w/v)蔗糖和 0.3 M L-精氨酸作为稳定剂。TPB用作用于调节至最终目标体积的填料溶液。
[0096] 通过在清洁罩中将一起来自储备溶液的稳定剂、赋形剂和防腐剂组合入无菌瓶中 而制备200 mL实验性疫苗的批次。对于稳定剂#17,将67 mL 3X稳定剂#17 [10%蔗糖(w/v) 和10% NZ胺(w/v)]与65.2 mL ?ΤΒ溶液和0.8 mL 100-250 mg/mL庆大霉素溶液充分混合。 对于制剂P-0UP-02和P-03,以表3中所示的指定体积分配各稳定剂(蔗糖、山梨糖醇、L-精 氨酸）、赋形剂(KP04、TPB)与防腐剂(庆大霉素）。充分混合稳定剂、赋形剂和防腐剂之后;将 67 mL解冻的IBV抗原添加至各制剂并充分混合。然后将各疫苗共混物以1.8 mL/小瓶等分 入玻璃安瓿小瓶中。将疫苗小瓶用氩气回填，火焰密封，然后进行在15 °C或4°C的稳定性测 试。
[0097] 在于15°C和4°C孵育之后的指定时间点，从培养箱取回最少各制剂两个小瓶，并使 用基于EID5q的效价测定法测定IBV的滴度。表4和5分别显示在15°C储存长达17周和在4°C储 存长达12个月之后各制剂中的IBV样品的平均滴度。如表4中所示，在15°C储存过程中，制剂 稳定剂#17中的IBV病毒滴度从第0天至第4.5周下降2.8 log。形成鲜明对比的是，当在15°C 储存时，其他三种制剂(P-01、P_〇2和P-03)中的IBV相对于第0天都是稳定的。所有三种制剂 在15°C在第1周、第2周和4.5周相对于时间0的滴度变化都在效价测定变化(0.5 log)之内。 表4中的数据证实，在15°C，IBV在当前产品制剂(例如，稳定剂#17)中是不稳定的，但在制剂 ?-01、？-02和?-03中稳定长达4.5周。
[0098] 此外，还收集在4°C的实时稳定性数据[表5]。如15°C稳定性数据所见，在4°C，稳定 剂#17中的IBV显示到第一时间点（3个月）的滴度的显著损失，并且到第二时间点（即，在6个 月）基本上无活性，而所有三种制剂（即，P-0UP-02和P-03)均提供显著改进的稳定性。4°C 稳定性数据表明，P-Ol、P_〇2和P-03提供了比目前制剂稳定剂#17改进的IBV稳定性，而制剂 P-03是三者中的最佳候选，显示在4°C与第0天相比基本上没有滴度变化，直到储存7个月。
[0099] 基于表4中的15°C稳定性数据，使用第一阶多项式回归分析各制剂中的IBV的稳定 性。使用从回归分析生成的方程，计算在15°C下降1.0 log滴度所需要的时间，并将其列于 表6的最下面一行。制剂稳定剂#17、？-01、？-02和?-03中，18￥下降1.0 1呢滴度所需要的时 间分别是1.6、16.6、22.7和49.8周。该分析表明，制剂P-Ol、P-02和P-03中的稳定剂作出不 同的贡献。制剂P-ο 1和P-02的比较表明，将L-精氨酸的浓度从0.3M升高至0.45 M没有显著 改进IBV稳定性。制剂P-Ol和P-03的比较表明，额外的10 %蔗糖没有显著改进IBV稳定性。P-01、P-02和P-03制剂相对于稳定剂#17的显著稳定效果表明山梨糖醇、蔗糖和L-精氨酸的组 合对于液体制剂中的IBV稳定性可以是有利的。表5中的在4°C的IBV实时稳定性数据与从15 °C稳定性数据生成的预计相对稳定性一致，并且进一步证实所有三种新制剂（即，P-OUP-02和P-03)表现比稳定剂# 17显著更好。进一步，P-03制剂在标准冷藏温度提供最好的稳定 性。
[0100] 表 2
注： ?对于各制剂(制剂)列出的浓度是疫苗共混物中的最终浓度。 ? KP04是磷酸钾溶液，其含有产生7.2的pH的体积比中的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。 ?对于NZ胺、山梨糖醇和蔗糖，浓度单位是重量体积比(w/v);对于精氨酸和KP04,浓度 单位分别是摩尔浓度和毫摩尔浓度。 ?所有制剂都还在最终疫苗共混物中含有I mg/mL庆大霉素。
[0101] 表 3
注： ?为了制备制剂稳定剂#17,将67 mL稳定剂#17 (含有10% NZ胺和10%蔗糖）与65.2 mL TPB、0.8mL庆大霉素（250 mg/mL)和67 mL IBV原料病毒共混。 ?对于所有疫苗共混物，在将病毒添加至制剂之前首先共混稳定剂（山梨糖醇、蔗糖、 L-精氨酸）、赋形剂(TPB、KP04)和防腐剂(庆大霉素）。
[0102] 表 4 不同制剂中在15 °C储存过程中的IBV疫苗的稳定性
注： ?各时间点的疫苗的滴度是来自各制剂的最少2个小瓶的样品的平均值。 ?每次病毒滴定中总是包括IBV病毒阳性对照，并且其用于验证各时间点的病毒效价 测定。 ?该基于EID5q的病毒效价测定的变化为0.5 log或更小。
[0103] 表 5
注： ?各时间点的疫苗的滴度是来自各制剂的最少2个小瓶的样品的平均值，（除了*表示 仅一个小瓶用于专门测量稳定剂#17)。 ?每次病毒滴定中总是包括IBV病毒阳性对照，并且其用于验证各时间点的病毒效价 测定。
[0104] 表 6 注：
?表4中的稳定性数用于预测不同制剂中的IBV稳定性。 ?非线性第一阶多项式回归用于从表4中的数据生成预测，其中IBV滴度作为y值且储 存时间（周数)作为X值。 ? IBV稳定性斜率是每周的滴度变化[Log1O(EID5Q)]，且Y-截距是基于回归方程的在时 间〇的滴度。 ?基于回归方程（IBV滴度变化相对于储存时间），对于各制剂计算从时间0下降1.0 log滴度所需要的预计时间，并将其列于的表格的最后一行。
[0105]本发明不应被本文所述的具体实施方案限制范围。事实上，除了本文描述的那些 以外，本发明的各种改变对于本领域技术人员而言，从前面的描述中将变得显而易见。这样 的改变意欲落入所附权利要求的范围之内。
【主权项】
1. 液体稳定的疫苗，其包含活家禽病毒、5-40% (w/v)糖醇和0.15至0.75 Μ的选自精 氨酸、谷氨酸和甘氨酸的氨基酸;其中所述液体稳定的疫苗具有6.0至8.0的pH;其中所述活 家禽病毒选自减毒病毒、重组家禽病毒载体和减毒家禽病毒的重组病毒载体;且其中所述 重组家禽病毒载体或减毒家禽病毒的重组病毒载体可以进一步编码异源抗原。2. 权利要求1的液体稳定的疫苗，其中所述糖醇是山梨糖醇。3. 权利要求2的液体稳定的疫苗，其中所述氨基酸是精氨酸。4. 权利要求3的液体稳定的疫苗，其中所述活家禽病毒选自家禽传染性支气管炎病毒 (IBV)、传染性法氏囊病病毒（IBDV)、新城疫病毒(NDV)、马立克氏病病毒(MDV)、禽偏肺病毒 (aMPV)、火鸡疱疹病毒(HVT)及其任何组合。5. 权利要求1的液体稳定的疫苗，其进一步包含作为非糖醇的糖添加剂，其中所述液体 稳定的疫苗中的糖醇和非糖醇的总量为15-40% (w/v)。6. 权利要求5的液体稳定的疫苗，其中所述非糖醇选自蔗糖和海藻糖。7. 权利要求1的液体稳定的疫苗，其进一步包含缓冲液。8. 权利要求7的液体稳定的疫苗，其中所述缓冲液包含2.5至50 mM磷酸钾。9. 权利要求1的液体稳定的疫苗，其中所述氨基酸是精氨酸。10. 权利要求4的液体稳定的疫苗，其中所述活的减毒病毒是IBV。11. 权利要求10的液体稳定的疫苗，其中所述IBV选自Delaware毒株、Mass毒株、 Arkansas毒株、Connecticut毒株、Georgia毒株及其任何组合。12. 权利要求11的液体稳定的疫苗，其进一步包含活的减毒imw。13. 权利要求12的液体稳定的疫苗，其进一步包含活的减毒NDV。14. 权利要求13的液体稳定的疫苗，其进一步包含活的减毒MDV或编码异源抗原的重组 减毒的MDV载体。15. 权利要求14的液体稳定的疫苗，其进一步包含活HVT或编码异源抗原的重组HVT载 体。16. 权利要求15的液体稳定的疫苗，其进一步包含活的减毒aMPV。17. 权利要求4的液体稳定的疫苗，其进一步包含灭活的家禽病毒。18. 权利要求4的液体稳定的疫苗，其进一步包含细菌。19. 权利要求18的液体稳定的疫苗，其中所述细菌选自活的减毒多杀巴斯德氏菌 (Pasiet/reDa 皿/_/iocic/a)、活的减毒肠炎沙门氏菌（e/3ie_riiic/is)、活的减毒 副鸡禽杆菌（cie_rij〇a_ragai/3a_rt/?)、活的减毒鸡败血支原体（ifyc〇j〇_/asffia gaDisejCiiic?)、活产气荚膜梭菌（C7osiric/i? j〇er_fri/^e/3s)及其任何组合。20. 权利要求1 8的液体稳定的疫苗，其中所述细菌选自灭活多杀巴斯德氏菌 (Pasiet/reDa 皿/_/iocic/a)、灭活肠炎沙门氏菌e/3ie_riiic/is)、灭活副鸡禽杆 菌(Avibacterium paragallinarum)、灭活%%败版支原、体（Mycoplasma gallisepticum)、 产气荚膜梭菌（C/osirit/it? joer/riog'aos)的灭活类毒素及其任何组合。21. 针对传染性支气管炎病毒（IBV)、传染性法氏囊病病毒（IBDV)、新城疫病毒(NDV)、 马立克氏病病毒(MDV)、禽偏肺病毒(aMPV)或火鸡疱疹病毒(HVT)接种禽类的方法，其包括 向所述禽类施用权利要求17的液体稳定的疫苗。22. 权利要求21的方法，其中所述施用通过皮下注射进行。23. 针对家禽病毒接种禽类的方法，其包括向所述禽类施用权利要求1的液体稳定的疫 苗。24. 权利要求23的方法，其中所述施用通过喷雾或饲喂进行。25. 制备液体稳定的疫苗的方法，其包括组合治疗有效量的活的减毒家禽病毒与5-40% (w/v)糖醇和0.15至0.75 Μ精氨酸;其中所述液体稳定的疫苗具有6.0至8.0的pH。26. 权利要求1或2的液体稳定的疫苗，其中所述氨基酸是精氨酸。27. 权利要求1、2或26的液体稳定的疫苗，其中糖醇的量为10-30% (w/v)。28. 权利要求1、2、26或27的液体稳定的疫苗，其中所述活的减毒家禽病毒选自传染性 支气管炎病毒（IBV)、传染性法氏囊病病毒（IBDV)、新城疫病毒(NDV)、马立克氏病病毒 (MDV)和火鸡疱疹病毒(HVT)。29. 权利要求1、2、26、27或28的液体稳定的疫苗，其进一步包含作为非糖醇的糖添加 剂，其中所述液体稳定的疫苗中的糖醇和非糖醇的总量为15-40% (w/v)。30. 权利要求29的液体稳定的疫苗，其中所述液体稳定的疫苗中的糖醇和非糖醇的总 量为25-40% (w/v)。31. 权利要求29或30的液体稳定的疫苗，其中所述非糖醇选自蔗糖和海藻糖。32. 权利要求1、2、26-30或31的液体稳定的疫苗，其进一步包含缓冲液。33. 权利要求32的液体稳定的疫苗，其中所述缓冲液包含2.5至50 mM磷酸钾。34. 权利要求1、2、27-32或33的液体稳定的疫苗，其中所述氨基酸是谷氨酸。35. 权利要求1、2、26-33或34的液体稳定的疫苗，其中所述活的减毒病毒是IBV。36. 权利要求35的液体稳定的疫苗，其中所述IBV选自由以下组成的类型：Delaware、 Massachusetts、Arkansas、Connecticut 和Georgia 毒株。37. 权利要求1、2、26-35或36的液体稳定的疫苗，其进一步包含活的减毒MDV。38. 权利要求1、2、26-36或37的液体稳定的疫苗，其进一步包含活的减毒NDV。39. 权利要求1、2、26-37或38的液体稳定的疫苗，其进一步包含活的减毒MDV或编码异 源抗原的重组减毒的MDV载体。40. 权利要求1、2、26-38或39的液体稳定的疫苗，其进一步包含活HVT或编码异源抗原 的重组HVT载体。41. 权利要求1、2、26-39或40的液体稳定的疫苗，其进一步包含活的减毒aMPV。42. 权利要求1、2、26-40或41的液体稳定的疫苗，其进一步包含灭活的家禽病毒。43. 权利要求1、2、26-41或42的液体稳定的疫苗，其进一步包含细菌。44. 权利要求43的液体稳定的疫苗，其中所述细菌选自活的减毒多杀巴斯德氏菌 (Pasiet/reDa 皿/_/iocic/a)、活的减毒肠炎沙门氏菌（e/3ie_riiic/is)、活的减毒 副鸡禽杆菌、活的减毒鸡败血支原体(ifyc〇j〇_/as_ffla gaDisejCiiic?)、活的减毒产气荚膜梭菌（C/osiric/i? jOer/riogaos)及其任何组合。45. 权利要求44的液体稳定的疫苗，其中所述细菌选自灭活多杀巴斯德氏菌 (Pasiet/reDa 皿/_/iocic/a)、灭活肠炎沙门氏菌e/3ie_riiic/is)、灭活副鸡禽杆 菌（Avibacterium paragallinararimi)、灭活%%败in支爵、体（Mycoplasma gallisepticimi)、 产气荚膜梭菌（C/osirit/it? joer/riog'aos)的灭活类毒素及其任何组合。46. 权利要求1、2、26-44或45的液体稳定的疫苗，其进一步包含寄生虫。47. 权利要求46的液体稳定的疫苗，其中所述寄生虫是艾美球虫。48. 接种传染性支气管炎病毒（IBV)、传染性法氏囊病病毒（IBDV)、新城疫病毒(NDV)、 马立克氏病病毒(MDV)、禽偏肺病毒(aMPV)和火鸡疱疹病毒(HVT)或其任何组合的方法，其 包括向家禽施用权利要求1 -20、26-46或47的液体稳定的疫苗。49. 权利要求48的方法，其中所述施用通过喷雾、卵内、滴眼、经口或经鼻途径进行。50. 制备权利要求1 -20、26-46或47的液体稳定的疫苗的方法，其包括组合治疗有效量 的活的减毒家禽病毒与5-40% (w/v)糖添加剂。
【文档编号】A61P31/04GK105992593SQ201580008951
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月16日
【发明人】乔志松, S.库克, K.奥康内尔, I.塔佩伊
【申请人】英特维特国际股份有限公司