一种促进凝血的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种促进凝血的组合物，所述组合物含有下述9种游离或/和水解氨基酸：苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸；其中，所述9种氨基酸的质量分数之和不低于37％。经实验证明，本发明的组合物可以缩短血液凝固的时间，可用于制备促进凝血的药物。
【专利说明】
一种促进凝血的组合物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种促进凝血的组合物，具体涉及藏药帕查。
【背景技术】
[0002] 氨基酸不单单是蛋白质合成的原料，本身也具有相应活性，对人体营养物质代谢、 信号转导、神经内分泌调节及免疫功能等都具有调控作用。例如：
[0003] 刘继红等（蜈蚣，全蝎，地龙氨基酸含量测定，郑州大学学报医学版，2005,40(3): 483)用氨基酸自动分析仪检测出了全蝎、蜈蚣和地龙中17种氨基酸的含量。结果显示三者 的氨基酸含量及分布可能与其药理作用有关。
[0004] 李珊等（蚕蛹、蝎子、海肠中20种元素的ICP-AES测定和氨基酸含量测定[J].氨基 酸和生物资源，2006,28(3):23)，对蝎子、蚕蛹和海肠进行含量测定，结果表明牛磺酸对心 血管和中枢神经影响较大，缺乏牛磺酸则可引起多种疾病，为药材的进一步研究药用价值 提供了理论依据。
[0005] 安坤等(不同产区太子参氨基酸含量测定及多元统计分析[J].天然产物研究与开 发，2012,24(5):594-598)对不同产地太子参药材的氨基酸组成和含量进行测定，利用氨基 酸为指标，对太子参的内在品质进行研究。
[0006] 湛孝东等(蚕蛹水解氨基酸对人肝癌细胞HepG2.2.15的体外抑制作用的研究[J]. 齐齐哈尔医学院学报，2015,（4) :469-470)利用运用MTT比色法测定蚕蛹水解氨基酸对人正 常肝脏细胞株的毒性，发现蚕蛹水解氨基酸对人肝癌细胞有良好的作用，毒性小。
[0007] 帕查作为常用藏药，首次在《月王药诊》中出现："蝗虫、虎肉、猪血诸药配伍治'龙' 性疔毒"。帕查为猪科动物猪Sus scrofa domestica Brisson的干燥血，是猪血按照藏医理 论加工干燥而成，别名帕岔、帕巴、帕合等，藏医理论认为其味甘，性凉、轻，敛毒及扩散性 "木布"，治木布病扩散，中毒肝病，健胃解痉。
[0008] 帕查除了主要是藏医在使用外，也有其他少数民族(景颇族与阿昌族)使用的记载 (贾敏如，李星炜.中国民族药志药[J].北京：中国医药科技出版社，2005:59):用猪血治疗 急性支气管炎、肺炎等。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种促进凝血的组合物，所述组合物含有下述9种游离或/和水解氨 基酸：
[0010] 苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸；
[0011] 其中，所述9种氨基酸的质量分数之和不低于37%。
[0012] 进一步地，所述苏氨酸的质量分数不低于2%;缬氨酸的质量分数不低于6%;亮氨 酸的质量分数不低于9% ;苯丙氨酸的质量分数不低于5% ;赖氨酸的质量分数不低于6% ; 组氨酸的质量分数不低于5% ;精氨酸的质量分数不低于4%。
[0013] 进一步地，所述9种氨基酸的质量分数如下：
[0014] 苏氨酸:2~3%;
[0015] 缬氨酸:6~8 %;
[0016] 蛋氨酸:0~1%;
[0017] 异亮氨酸:〇~1 %;
[0018] 亮氨酸:9~12%;
[0019] 苯丙氨酸:5~7%;
[0020] 赖氨酸:6~8 %;
[0021] 组氨酸：5~8 %;
[0022] 精氨酸:4~6 %。
[0023] 进一步地，所述组合物含有下述17种游离或/水解氨基酸：
[0024] 苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天 冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸；
[0025]其中，所述17种氨基酸的重量分数之和大于等于70%。
[0026] 进一步地，所述17种氨基酸的质量分数如下：
[0027] 苏氨酸：2~3%;
[0028] 缬氨酸:6~8 %;
[0029] 蛋氨酸:0~1%;
[0030] 异亮氨酸:0~1%;
[0031] 亮氨酸：9~12%;
[0032] 苯丙氨酸:5~7%;
[0033] 赖氨酸:6~8%;
[0034] 组氨酸：5~8 %;
[0035] 精氨酸:4~6 %;
[0036] 天冬氨酸:7~10%;
[0037] 丝氨酸：2~4%;
[0038] 谷氨酸:6~9 %;
[0039] 甘氨酸:2~4%;
[0040] 丙氨酸:4~6 %;
[0041] 半胱氨酸:0~5 %;
[0042] 酪氨酸:〇~2 %;
[0043] 脯氨酸：1~4%。
[0044] 进一步地，所述游离或/和水解氨基酸来源于猪血。
[0045] 进一步地，所述猪血是藏药帕查。
[0046] 本发明还提供了所述组合物在制备促进凝血类药物中的用途。
[0047] 本发明还提供了猪血在制备促进凝血类药物中的用途。
[0048] 本发明还提供了藏药帕查在制备促进凝血类药物中的用途。
[0049] 经实验证明，本发明的组合物可以缩短血液凝固的时间，可用于制备促进凝血的 药物。
[0050] 在本发明中，"水解氨基酸"指的是将本发明组合物中蛋白质水解之后的得到的氨 基酸，与组合物本身含有的游离氨基酸相区别。
[0051]在本发明一种具体的实施方式中，测定所述水解氨基酸的含量按照下述方式进 行：
[0052]样品中蛋白质经盐酸水解成游离氨基酸后，经氨基酸分析仪的磺酸型阳离子交换 柱分离后，在135°C下加热氨基酸与茚三酮混合反应，伯胺与茚三酮生成蓝紫色化合物，仲 胺与茚三酮生成黄色化合物，分别在570nm和440nm波长下检测两种衍生产物，保留时间定 性，外标法定量。
[0053]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0054] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0055] 实验所用16批药材，加工方法不同。经成都中医药大学药学院蒋桂华教授鉴定为 猪科动物猪Sus scrofa domestica Brisson的干燥血。具体如下： 样品编号采集时间 采集地点 加:工方法 来源 1 2013.3.14 成都荷花池中药材市场一一 2 2013.6.22 成都荷花池中药材市场 一 一 3 2013.4.26 四川崇州 烘干 猪 4 2013.4.26 四川崇州 阴干 猪 5： 2013.5.25 河南商丘 阴干 猪 6 2013.6.09 四川甘孜州泸定 阴干 猪 7 2013.6.10 四)丨|甘孜州康定 阴千 豬
[0056] 8 2013.3.15 青海西宁 一 - 9 2013.3.11 四川温江 烘千 猪 10 2014.3.11 四川甘孜州藏医院 加青稞酒风干藏猪 11 2013.12.12 四川阿坝州茂县 阴干 藏猪 12 2013.12.12四川阿坝州茂县 煮后烘干 藏猪 13 2014.1.15 四川甘孜州得荣 风千 藏猪 14 2013.4.26 四川崇州 煮后烘干 猪 1:5 2013.6.09 四川甘孜州泸定 煮后烘千 猪 16 2013.12.12四川阿坝州茂县 烘千 藏猪
[0057]注："一"表示加工方法、来源不详
[0058] 除第1、2、8、10号为购买样品外，其余11批药材均按照不同的加工方法自制，烘干 及煮后烘干均是烘箱低温干燥。
[0059] 实施例1藏药帕查对胃蛋白酶活性的抑制试验
[0060] 1、供试品的配制
[0061 ] 取帕查粉末，用纯水溶解，帕查高、中、低给药浓度分别为:0.15g/mL，0.0750g/mL， 0.0375g/mL〇
[0062] 2、阳性对照组药物制备
[0063]阳性对照药物溶液制备：取酚磺乙胺注射液，用移液枪吸取2mL，置于50mL容量瓶 中，加纯水稀释至50mL，混匀作为对照品溶液。
[0064] 3、方法
[0065]采用小鼠玻片法、小鼠毛细玻璃管法测凝血时间，进行实验。
[0066] 3.1小鼠玻片法测凝血时间
[0067]本次试验采用小鼠玻片法测凝血时间，将ICR小鼠60只，体质量(20±2)g，雌雄各 半，适应性喂养三天后随机分为5组，即空白组、帕查低剂量组、帕查中剂量组、帕查高剂量 组、酚磺乙胺组，每组12只，雌雄各半。
[0068]各组实验动物根据以上分组给药，每天给药1次，0.2mL/10g，连续给药8d，空白组 给予等体积蒸馏水。第7d给药后，在末次给药前禁食不禁水12h。实验八天，将小鼠的一侧眼 球用弯镊迅速取出。将流出的血滴两滴在载玻片的两端(开始的第1~2滴弃去），血滴直径 大约5mm。每隔5s，试着用干燥的针头从血液的边缘向里轻轻拨动，一直到能用针头纤维蛋 白丝挑起来。从采血开始计时，到挑起纤维蛋白丝止，所历时间即为凝血时间tl。
[0069] 3.2小鼠毛细玻璃管法测凝血时间
[0070]将ICR小鼠60只，体质量（20 ± 2) g，雌雄各半，适应性喂养三天后随机分为5组，即 空白组、帕查低剂量组、帕查中剂量组、帕查高剂量组、酚磺乙胺组，每组12只，雌雄各半。 [0071]各组实验动物根据以上分组给药，每天给药1次，0.2mL/10g，连续给药8d，空白组 给予等体积蒸馏水。第7d给药后，在末次给药前禁食不禁水12h。实验第八天，取小鼠，把毛 细玻璃管插入小鼠眼睛内眦球后的静脉丛中，深度约5mm，自从血液流进毛细玻璃管中，计 时开始，直到血液充满玻璃管后，才把毛细玻璃管取出。平放在桌面上，每隔5s，折断玻璃管 大约5mm左右，缓慢的向左右拉开，观察折断处有无血凝丝的出现。一直到血凝丝的出现，出 现血凝丝后，立马把玻璃管的另一端折断，进行验证。平均两端出现血凝丝的时间，即为凝 血时间t2。
[0072] 5、数据分析
[0073]数据用SPSS 19.0进行数据分析，所有指标均以x±S表示，采用单因素方差分析比 较组间差异，采用P<〇.05时差异有统计学意义。
[0074] 6、结果
[0075] 结果如表1所示：
[0076] 表1帕查对凝血时间的影响
[0077]
[0078] 注：与空白组对比*P<0 · 05，林P<0 · 01。
[0079] 以上结果表明，与空白对照组相比，无论是玻片法还是毛细管法，各剂量组凝血时 间均缩短：帕查高剂量组能显著缩短凝血时间（P<〇.05)，而帕查中剂量组和低剂量组，也 能缩短凝血时间。
[0080] 实施例2藏药帕查的氨基酸含量分析及组合物
[0081] 1仪器设备及试剂
[0082]仪器:氨基酸自动分析仪：日立L-8900;分析天平(德国赛多利斯BP211D);移液器： 量程分别为10yL~100yL，20yL~100yL及200yL~1000yL;烘箱（精宏XMTD-8222，上海精宏 实验设备有限公司）；DJW-2000高精全自动交流稳压电源（上海全力电器有限公司）；抽滤 瓶，安培瓶，酒精喷灯等。
[0083]试剂:氨基酸标准品（纯度>98%，安捷伦科技有限公司，生产批号：5061-3331);柠 檬酸锂（四水），盐酸，氯化锂，柠檬酸，氢氧化锂，硼氢化钠，无水乙酸钠，茚三酮，无水乙醇， 硫代双乙醇，聚氧乙烯月桂醚，辛酸，苯甲醇，乙二醇甲醚和冰乙酸均为优级纯，氮气为高纯 氮(纯度多99.999 % )。快速定量滤纸;0.45μπι水相滤膜和0.45μπι有机相滤膜。
[0084] 2 原理
[0085] 样品中蛋白质经盐酸水解成游离氨基酸后，经氨基酸分析仪的磺酸型阳离子交换 柱分离后，在135°C下加热氨基酸与茚三酮混合反应，伯胺与茚三酮生成蓝紫色化合物，仲 胺与茚三酮生成黄色化合物，分别在570nm和440nm波长下检测两种衍生产物，保留时间定 性，外标法定量。
[0086] 3混合氨基酸标准工作液配制
[0087]精密称取各氨基酸对照品适量，用纯水溶解，配制成混合溶液。混合标准溶液中的 17种氨基酸的浓度为1.25μη?01/mL，作为氨基酸混合母液。
[0088] 17种氨基酸混合母液用水稀释到2nmo l/20yL，进样测定。氨基酸标准工作溶液现 配现用。
[0089] 4流动相配制
[0090] 4.1 流动相B1 (pH 2.8)配制
[0091] 准确称取柠檬酸锂（四水)5.73g，氯化锂1.24g，柠檬酸19.90g，溶于700mL纯水中， 加入30.0 mL无水乙醇，5. OmL硫代双乙醇，4. OmL聚氧乙稀月桂醚，再加入0. lmL辛酸，转移至 1000mL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μπι水相滤膜备用。
[0092] 4.2 流动相Β2(ρΗ 3.7)配制
[0093] 准确称取柠檬酸锂（四水)9.80g，氯化锂6.36g，柠檬酸12.00g，溶于700mL水中，加 入30 . OmL无水乙醇，5 . OmL硫代双乙醇，4. OmL聚氧乙稀月桂醚，再加入0 . lmL辛酸，转移至 lOOOmL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μπι水相滤膜备用。
[0094] 4.3流动相83(?!13.6)配制
[0095] 准确称取柠檬酸锂（四水)8.79g，氯化锂26.62g，柠檬酸11.27g，溶于700mL水中， 加入100mL无水乙醇，3 . OmL苯甲醇，4 . OmL聚氧乙稀月桂醚，再加入0 . lmL辛酸，转移至 lOOOmL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μπι水相滤膜备用。
[0096] 4.4 流动相Β4(ρΗ 4.1)配制
[0097] 准确称取柠檬酸锂（四水)9.80g，氯化锂38.15g，柠檬酸3.30g，溶于700mL水中，加 入4.OmL聚氧乙烯月桂醚，再加入0. lmL辛酸，转移至lOOOmL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μ m水相滤膜备用。
[0098] 4.5流动相B5配制
[0099]流动相B5为经0.45μπι水相滤膜过滤后的一级超纯水。
[0100] 4.6流动相Β6配制
[0101] 准确称取氢氧化锂8.40g，溶于700mL水中，加入30.0 mL无水乙醇，4. OmL聚氧乙烯 月桂醚，再加入0 . lmL辛酸，转移至lOOOmL容量瓶中，用超纯水定容，过0.45μπι水相滤膜备 用。
[0102] 5柱后衍生化反应溶液配制
[0103] 5.1反应溶液R1配制
[0104] 准确称取茚三酮39.0g，溶于979mL乙二醇甲醚中，超声溶解5min，过0.45μπι有机相 滤膜，加入硼氢化钠81. Omg，氮气鼓泡30min，放置过夜使用。
[0105] 5.2反应溶液R2配制
[0106] 准确称取无水乙酸钠204.(^，加入30011^水，1231^冰乙酸，4011^乙二醇甲醚，超声 至溶解，转移至l〇〇〇mL容量瓶中，用水定容，过0.45μπι有机相滤膜，氮气鼓泡10min，备用。 [0107] 5.3反应溶液R3配制
[0108] 准确移取无水乙醇50mL于lOOOmL溶量瓶中，用纯水定容至1000mL，摇匀后利用 0.45μπι有机相滤膜过滤，备用。
[0109] 6 方法
[0110] 6.1样品制备
[0111 ]称取20mg样品，精密称定，于安培瓶中，加入6mol/L盐酸5mL，反复抽真空，置于安 瓿瓶中冲氮用酒精喷灯封口，放入恒温至11 〇°C的烘箱中水解24h，取出，冷却。过滤至10mL EP管中，吸取100yL样品加109.5yL 6mol/L NaOH中和，过0.45μπι滤膜，衍生，上机待测。
[0112]衍生操作：用移液枪移取制备好的样品溶液或标准溶液1 OyL于洁净的内插管中， 加入配置好的衍生用缓冲液70此，再加入衍生试剂20yL，立即用漩涡混合仪混合10s，加盖 密封于进样瓶中，室温下静置lmin，转移至事先预热好的55°C烘箱中加热10min，取出待测。 [0113] 6.2仪器分离体系运行条件
[0114] 流动相配制见1.4,流动相流速为0.35mL/min，流动相及温度梯度条件如表1所示， 进样体积为20yL。
[0115] 表2氨基酸分析仪分离梯度条件程序 )
[0116；
[0117] 6.3反应检测体系运行条件
[0118] 反应液配制见5部分，反应柱温度为135°C，反应液流速为0.30mL/min，反应液梯度 条件见表3。检测器检测波长570nm和440nm。
[0119] 表3氨基酸分析仪反应体系条件程序
[0120]
[0121] ~6.4绘制校正曲线
[0122] 启动氨基酸自动分析仪，设定工作参数，待基线稳定后，分别吸取不同梯度浓度的 混合氨基酸标准工作溶液，注入氨基酸自动分析仪进行测定，分别得到17种氨基酸的峰面 积。分别以各氨基酸峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，建立校正曲线。通过保留时间识别各 氨基酸出峰顺序。
[0123] 7样品测定
[0124] 用氨基酸分析仪测定样品溶液，分别得到样品中各氨基酸色谱峰面积，代入校正 曲线计算含量。以超纯水作为空白样品，在相同测定条件下进行测定，计算空白样品中各氨 基酸本底值。样品测定值扣除空白样品中各氨基酸本底值，即得各样品中氨基酸净含量。选 择10批具有代表性药材进行测定。
[0125] 8结果计算与表示
[0126] 按式(1)计算样品中各游离氨基酸的含量。
[0127]
[0128] 式中：
[0129] ffi一一试样中各氨基酸组分的含量，单位为毫克每100克(mg/100g)。
[0130] C--试样溶液中由校正曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升(nmol/ mL) 〇
[0131 ] Ck--空白试样溶液中由校正曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升 (nmol/mL)〇
[0132] V一一试样总体积，单位为毫升(mL)。
[0133] Μ一一氨基酸的摩尔质量，单位为克/摩尔(g/mol)。
[0134] m--试样质量，单位为克(g)。
[0135] mi--试样干物率，测定方法见GB 8303。
[0136] (1)各个样品的测测定结果见表4。
[0137]表4帕查样品氨基酸测定结果（％，n = 2)
[0138]
[0139] 注:*为人体必须的氨基酸
[0140] 从表4中可以看出，帕查中含有天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、异亮 氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、组氨酸、苏氨酸、精氨酸、缬氨酸、 脯氨酸等17种氨基酸。不同来源和加工方法帕查中均含有上述17种氨基酸，含量较为稳定， 仅略有差异，总氨酸含量73.67 %~86.94%。结合实施例1的活性试验结果，证明本发明组 合物可以降低胃酸的酸度
[0141 ] (2)不同加工方法对氨基酸含量影响见表5:
[0142] 表5不同加工方法对氨基酸含量影响（.x'is,%)
[0143]
[0144] 注:Λ为必须氨基酸，与阴干法相比，*p < 0.05，#p < 0.01;与煮后烘干法相比#p < 0·05，##ρ<0·01
[0145] 可以看出，风干法在总氨基酸含量、必须氨基酸含量均高于其他几种加工方法，这 与传统藏医理论相符。
【主权项】
1. 一种促进凝血的组合物，其特征在于:所述组合物含有下述9种游离或/和水解氨基 酸： 苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸； 其中，所述9种氨基酸的质量分数之和不低于37%。2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于:所述苏氨酸的质量分数不低于2%;缬氨 酸的质量分数不低于6% ;亮氨酸的质量分数不低于9% ;苯丙氨酸的质量分数不低于5% ; 赖氨酸的质量分数不低于6% ;组氨酸的质量分数不低于5% ;精氨酸的质量分数不低于 4%〇3. 根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于:所述9种氨基酸的质量分数如下： 苏氨酸:2~3 %; 缬氨酸:6~8 %; 蛋氨酸:〇~1%; 异亮氨酸:〇~1%; 亮氨酸:9~12 %; 苯丙氨酸:5~7 % ; 赖氨酸:6~8 % ; 组氨酸:5~8 %; 精氨酸:4~6 %。4. 根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于:所述组合物含有下述17种 游离或/水解氨基酸： 苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸； 其中，所述17种氨基酸的重量分数之和大于等于70%。5. 根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于:所述17种氨基酸的质量分数如下： 苏氨酸:2~3 %; 缬氨酸:6~8 %; 蛋氨酸:〇~1%; 异亮氨酸:〇~1%; 亮氨酸:9~12 %; 苯丙氨酸:5~7 % ; 赖氨酸:6~8 % ; 组氨酸:5~8 %; 精氨酸:4~6 %; 天冬氨酸:7~10 %; 丝氨酸:2~4 %; 谷氨酸:6~9 %; 甘氨酸:2~4 %; 丙氨酸:4~6 %; 半胱氨酸:〇~5 %; 酪氨酸:〇~2 % ; 脯氨酸:1~4 %。6. 根据权要求1~5任一项所述的组合物，其特征在于:所述游离或/和水解氨基酸来源 于猪血。7. 根据权利要求6所述的组合物，其特征在于:所述猪血是藏药帕查。8. 权利要求1~7任一项所述的组合物在制备促进凝血类药物中的用途。9. 猪血在制备促进凝血类药物中的用途。10. 藏药帕查在制备促进凝血类药物中的用途。
【文档编号】A61P7/04GK105997999SQ201610380142
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】蒋桂华, 连艳, 兰志琼, 卢先明, 邓晶晶, 刘晓芬, 陈玲, 陈虹宇, 尹显梅, 王潇霖, 郑潇潇, 黄凤
【申请人】成都中医药大学