一种多孔细胞外基质支架制备技术的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种孔径可控且高度连通的细胞外基质支架制备技术，解决细胞外基质支架材料孔径小、细胞化差的问题。具体是将可降解聚合物微球聚集体植入到宿主皮下、肌肉或者腹腔后，宿主细胞会迁移到微球聚集体孔隙内部从而实现细胞化，先后将细胞化的微球聚集体支架材料进行聚合物洗脱和脱细胞处理后，即可得到细胞外基质支架。该工艺可以通过控制的聚合物微球大小来控制支架孔径大小，同时也可以通过控制聚合物微球粘接程度来控制支架的连通度。本发明所制备的多孔细胞外基质支架在干细胞移植，软骨修复，皮肤修复等组织工程领域具有良好的应用前景。
【专利说明】
一种多孔细胞外基质支架制备技术
技术领域
[0001]本发明涉及一种组织工程领域多孔支架制备技术，具体说是一种孔径可控且高度连通的细胞外基质支架制备技术。
【背景技术】
[0002]支架材料是组织工程三要素之一，根据来源不同主要分为人工合成材料和天然材料两大类。其中天然材料来源于生物组织或器官，与人工合成材料相比，具有更好的生物相容性，因而一直是组织工程研究的热点。细胞外基质支架是一类独特的天然材料，是通过物理或化学的方法将器官或组织中的免疫原成分去除得到的。细胞外基质结构成分较复杂，主要包括胶原、蛋白多糖、弹性蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等，根据组织、器官及种属的来源不同，其基本结构成分也有所不同。此外，大量研究表明虽然经过复杂脱细胞处理，脱细胞基质材料仍保留了部分天然组织中的一些重要生物活性物质，如透明质酸酶、纤维结合蛋白、硫酸软骨素、VEGF、TGF-13、EGF及BMP-4等。这些生物活性物质在支架材料植入体内后，随着材料降解缓慢释放，参与调节多种与组织修复密切相关的细胞的迀移、增殖和分化，在促进组织修复、重建与血管再生方面发挥重要作用。同时，细胞外基质支架能够为组织和细胞的生长提供力学支持。
[0003]在支架材料植入体内后需要与器官组织实现整合并完成血管化，从而发挥其修复功能，这就需要支架材料具有可控且连通的孔结构，以使得植入部位周围组织细胞能够迀移到支架内部。然而，目前所制备的脱细胞基质支架材料普遍存在结构不可控、孔径过小且连通差的问题，从而限制了细胞迀移以及营养物质和代谢物的传输，进而影响修复组织器官的重塑和再生。
【发明内容】
[0004]针对细胞外基质支架材料存在的问题，本专利发明了一种孔径可控且高度连通的细胞外基质支架制备方法。由于宿主本身也是生物反应器，在将聚合物材料模板植入到宿主皮下，肌肉或者腹腔后，宿主细胞会迀移到聚合物支架材料孔隙内部从而实现细胞化，将细胞化的支架材料进行聚合物洗脱和脱细胞处理后，可以得到细胞外基质支架。微球或粒子致孔在制备组织工程支架材料方面有广泛的应用，可以通过控制微球或粒子大小来控制支架孔径大小，同时可以通过控制微球或粒子粘接程度来控制所制备支架的连通度。基于此本发明所采用的技术方案包括以下步骤:
[0005]步骤一，以生物可降解高分子为原料，通过乳化溶剂挥发方法制备具有不同粒径大小的聚合物微球，将不同粒径的微球加入到聚四氟乙烯圆孔中，恒温加热一定时间，使微球之间相互粘接形成微球聚集体支架；
[0006]步骤二，将上述微球聚集体支架埋植到实验动物包括猪，狗，羊，兔子，大鼠，小鼠皮下、肌肉或者腹腔部位2周到3个月时间，宿主细胞会向微球聚集体支架孔隙内部迀移，从而使其细胞化;在埋植一定时间后将动物暂时麻醉，将实现细胞化的微球聚集体支架取出，缝合切口；
[0007]步骤三，将步骤二中完成细胞化的聚合物支架，用梯度乙醇脱水后，再将其置于三氯甲烷或者二氯甲烷中振荡一定时间除去聚合物，得到含有细胞的基质支架；
[0008]步骤四，将步骤三得到的含有细胞的基质支架，利用SDS和核酸酶等进行脱细胞处理，再经过冷冻干燥处理，便可得到多孔的脱细胞支架，以用于组织修复或研究。
[0009]其中，生物可降解高分子可以是合成高分子聚乳酸(PLA)，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)，聚己内酯(PCL)，聚羟基脂肪酸酯(PHA)，聚氨酯(PU)中的一种或几种。
[0010]本发明专利与现有脱细胞基质支架材料相比，突出的优点在于:1、目前的脱细胞基质支架结构致密，且细胞迀移困难，进而影响组织修复，本发明利用聚合物微球聚集体支架为模板来制备孔径可控且连通的细胞外基质支架，成功解决了细胞外基质支架材料致孔的问题;2、免疫排斥是目前所有组织工程支架都存在的问题，本发明利用聚合物洗脱和脱细胞方法，洗脱掉聚合物微球和核酸等具有免疫原性的物质，从而使所得到支架没有免疫原性;3、可以通过控制植入聚合物微球聚集体支架的微球粒径的大小、热熔时间长短来控制细胞外基质支架孔径大小和联通度。
【具体实施方式】
[0011 ]实施例1:以PCL微球聚集体为模板制备可控孔结构的细胞基质支架
[0012]PCL微球制备:采用乳化-溶剂挥发法制备PCL微球。称取10.0克分子量为80000的PCL，加入到200ml 二氯甲烷中，室温搅拌溶解至澄清，制得浓度分数为5 % (m/v)的PCL溶液。将上述PCL溶液加入到1800ml的2%聚乙烯醇(PVA)溶液中，在100rpm条件搅拌，室温下挥发去除二氯甲烷，静置沉淀收集底部微球，蒸馏水洗涤5次去除残余PVA，将收集的微球粒子冷冻干燥得到PCL微球。
[0013]PCL微球聚集体的制备:将0.5克PCL微球置于聚四氟乙烯板上直径为1.0cm，高度为0.8cm的圆孔中，在80°C条件下恒温加热I小时，使微球间相互粘接熔融，得到PCL微球聚集体。
[0014]PCL微球聚集体皮下埋植:将直径为1.0cm PCL微球聚集体支架用75%医用酒精灭菌I小时，再用无菌生理盐水洗涤。将大鼠用10% (m/v)水合氯醛麻醉后，背部两侧脱毛
1.5cm X 1.5cm大小面积，剪开长约1.2cm的切口，用平头剪刀将皮层与肌肉组织分离出1.5cm大小的空腔，将PCL微球聚集体支架置于到皮下空腔中，缝合切口后消毒饲养。
[0015]细胞外基质支架的制备:在皮下埋植I个月后，将大鼠用异氟烷短暂麻醉，在植入材料附近部位脱毛切口，将细胞化的微球聚集体支架与周围组织剥离后取出，缝合切口后消毒。将细胞化的微球聚集体支架置于生理盐水中洗涤并去除周围多余组织，再将其依次置于50%、70%、无水乙醇中脱水各2小时，最后置于三氯甲烷中振荡72小时，以洗掉聚合物PCL。真空干燥后再于I % SDS中震荡洗涤48小时，再用浓度为0.2g/L的DNA酶和浓度为
0.02g/LRNA酶的溶液37°C震荡24小时去除核酸，最后用生理盐水洗涤5次，冷冻干燥后环氧乙烷灭菌备用。
[0016]实施例2:以PLA微球聚集体为模板制备可控孔结构的细胞基质支架
[0017]PLA微球制备:称取8.0克分子量为200000的PLA，加入到200ml三氯甲烷中，室温搅拌溶解至澄清，制得浓度分数为4% (m/v)的PLA溶液。将上述PLA溶液加入到1800ml的3 %聚乙烯醇(PVC)溶液中，在SOOrpm条件搅拌，室温下挥发去除三氯甲烷，静置沉淀收集微球，蒸馏水洗涤5次去除残余PVA，将收集的微球粒子冷冻干燥得到PLA微球。
[0018]PLA微球聚集体的制备:将0.4克PLA微球置于聚四氟乙烯板上直径为1.0cm，高度为0.8cm的圆孔中，在200°C条件下恒温加热I小时，使微球间相互粘接熔融，得到PLA微球聚集体。
[0019]PLA微球聚集体皮下埋植:将得到直径为1.0cmPLA微球聚集体支架用75%医用酒精灭菌I小时，再用无菌生理盐水洗涤。将兔子用30% (m/v)乌拉坦麻醉后，背部两侧脱毛1.4cmX 1.4cm大小面积，剪开长约1.3cm的切口，用平头剪刀将皮层与肌肉组织分离出1.5cm大小的空腔，将PLA微球聚集体支架置于到皮下空腔中，缝合切口后消毒饲养。
[0020]细胞外基质支架的制备:在皮下埋植I个月后，将兔子用异氟烷短暂麻醉，在植入材料附近部位脱毛切口，将已经细胞化的微球聚集体支架与周围组织剥离后取出，缝合切口后消毒饲养。将细胞化的微球聚集体置于生理盐水中洗涤并去除周围多余组织，再将其依次置于60%、80%、无水乙醇中脱水各2小时，最后置于二氯甲烷中振荡96小时，以洗掉聚合物PLA。真空干燥后再于I % SDS中震荡洗涤72小时，再用浓度为0.25g/L的DNA酶和浓度为
0.025g/LRNA酶的溶液37°C震荡48小时去除核酸，最后用生理盐水洗涤7次，冷冻干燥后环氧乙烷灭菌备用。
[0021]实施例3:以PLGA微球聚集体为模板制备可控孔结构的细胞基质支架
[0022]PLGA微球制备:称取10.0克分子量为20000的PLGA，加入到10ml三氯甲烷中，室温搅拌溶解至澄清，制得浓度分数为1 % (m/v)的PLGA溶液。将上述PLGA溶液加入到1900ml的I % PVA溶液中，在1200rpm条件搅拌，室温下挥发去除三氯甲烷，静置沉淀收集微球，蒸馏水洗涤5次去除残余PVA，将收集的微球粒子冷冻干燥。
[0023]PLGA微球聚集体的制备:将1.0克PLGA微球置于聚四氟乙烯板上直径为2.0cm，高度为0.8cm的圆孔中，在60°C条件下恒温加热40分钟，使微球间相互粘接熔融，得到PLGA微球聚集体。
[0024]PLGA微球聚集体皮下埋植:将得到直径为2.0cmPLGA微球聚集体支架用75%医用酒精灭菌I小时，再用无菌生理盐水洗涤。将羊用速眠新麻醉后，背部两侧脱毛3.3cmX
3.3cm大小面积，剪开长约2.2cm的切口，用平头剪刀将皮层与肌肉组织分离出2.5cm大小的空腔，将PLGA微球聚集体支架置于到皮下空腔中，缝合切口后消毒饲养。
[0025]细胞外基质支架的制备:在皮下埋植I个月后，将羊用异氟烷短暂麻醉，在植入材料附近部位脱毛切口，将已经细胞化的微球聚集体支架与周围组织剥离后取出，缝合切口后消毒饲养。将细胞化的微球聚集体支架置于生理盐水中洗涤并去除周围多余组织，再将其依次置于70%、90%、无水乙醇中脱水各2小时，最后置于二氯甲烷中振荡48小时，以洗掉聚合物PLGA。真空干燥后再于I %SDS中震荡洗涤48小时，再用浓度为0.2g/L的DNA酶和浓度为0.02g/L的RNA酶溶液37 °C震荡24小时去除核酸，最后用生理盐水洗涤5次，冷冻干燥后环氧乙烷灭菌备用。
【主权项】
1.本专利发明了一种孔径可控且高度连通的细胞外基质支架制备技术。本发明所采用的技术方案包括以下步骤: 步骤一，以生物可降解高分子为原料，通过乳化溶剂挥发方法制备具有不同粒径大小的聚合物微球，将不同粒径的微球加入到聚四氟乙烯圆孔模具中，恒温加热一定时间，使微球之间相互粘接形成微球聚集体支架； 步骤二，将上述微球聚集体支架埋植到实验动物包括猪，狗，羊，兔子，大鼠，小鼠皮下、肌肉或者腹腔部位2周到3个月时间，宿主细胞会向微球聚集体支架孔隙内部迀移，从而使其细胞化;在埋植一定时间后将动物暂时麻醉，将已细胞化的微球聚集体支架取出； 步骤三，将步骤二中完成细胞化的聚合物支架，用梯度乙醇脱水后，再将其置于三氯甲烷或者二氯甲烷中振荡一定时间除去聚合物，得到含有细胞的基质支架； 步骤四，将步骤三得到的含有细胞的基质支架，利用SDS和核酸酶等进行脱细胞处理，再经过冷冻干燥处理，便可得到多孔的脱细胞支架。2.根据权利要求1所述的多孔细胞外基质支架制备方法，其中，所述的生物可降解高分子可以是合成高分子聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)，聚L-丙交酯-己内酯(PLCL)，聚羟基脂肪酸酯(PHA)，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)，聚氨酯(PU)中的一种或几种。
【文档编号】A61L27/36GK105999423SQ201610588945
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】朱美峰, 孔德领, 王恺, 李雯
【申请人】南开大学