用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜和分散生物膜的组合物和方法

用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜和分散生物膜的组合物和方法
【专利摘要】本公开涉及用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜3D结构和分散生物膜的组合物和方法，以便提高生物膜细胞去除和/或对其它试剂的敏感性(例如，环境或共施加处理)。具体地，本公开涉及L?精氨酸在医疗、工业、家庭或环境应用中微生物的去除和/或致感(例如，对抗微生物剂)以及细菌感染(例如，在生物膜中)的治疗中的应用。
【专利说明】用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜和分散生物膜的组合物 和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年9月24日提交的美国临时申请序列号61/881,762和于2014年 3月31日提交的美国临时申请序列号日61 /972，920的权益，其中每一个通过引用其全文的 方式并入本文。 发明领域
[0003] 本公开设及用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜3D结构和分散生物膜的组合物和 方法，W便提高生物膜细胞去除和/或对其它试剂的敏感性(例如，环境或共施加处理）。具 体地，本公开设及レ精氨酸在医疗、工业、家庭或环境应用中微生物的去除和/或致感（例 如，对抗微生物剂）W及细菌感染(例如，在生物膜中）的治疗中的应用。
[0004] 发明背景
[0005] 生物膜是粘附至表面的微生物的有机群体，并且嵌入粘液质的细胞外聚合性物质 化PS)中。EPS是由细菌细胞、细胞裂解和水解产物所产生的高分子质量的聚合物（〉10， 000Da)W及从基质吸附的有机物的复杂混合物。EPS参与到在生物膜中微生物的稳定安排 的建立中（Wolfaardt等人（1998)]?1^〇6.6(3〇1.35:213-223;通过引用其全文并入本文），并 且细胞外DNA(eDNA)是EPS的主要成分之一（Flemming等人（2001 )Water Sci . Technol.43: 9-16;Spoering等人（2006)Qirr.Opin.Microbiol.9:133-137;每个通过引用其全文并入本 文）。生活在生物膜中的细菌通常具有与相同物种的自由浮动(浮游)细菌显著不同的性质， 因为膜的致密和受保护的环境允许它们W各种方式合作和互作。运种环境的一个好处是提 高了对洗涂剂和抗生素的抗性，因为致密细胞外基质和细胞的外层保护群体的内部。在某 些情况下，抗生素抗性可W被增加千倍(Stewad等人(2001)Lance 口 58:135-138;通过引用 其全文并入本文）。可W在各种细菌物种中形成生物膜(例如，不动杆菌属(Acinetobacter sp.)(例如，贝利不动杆菌(A.baylyi)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii))、金黄色葡萄球菌 (Staphylococ州S aureus)、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)、大肠杆 菌巧scherichia coli)(例如，E.coli Κ-12)。由运些物种的生物膜形成是在定居或感染过 程中医疗结果的主要决定因素。例如，不动杆菌通常通过形成于呼吸器管道上、皮肤和伤口 部位、医用导管等上的生物膜的形成移植于在临床情况中的患者，并且是获得性肺炎的常 见原因。
[0006] 由于生物膜是由各要素形成的复杂结构，它们的去除或破坏通常需要使用分散 剂、表面活性剂、清洁剂、酶制剂、抗生素、杀虫剂、沸腾工序、腐蚀性化学品、机械清洗、使用 抗菌剂、抑制微生物附着、通过消除必需的营养物质抑制生物膜的生长、W及促进生物膜基 质的生物质分离和降解（加 en XS,P.S.:Biofilm removal caused by chemical treatments. Water Res 2000; 34:4229-4233;通过引用其全文并入本文）。然而，运种传统 的去除或破坏方法并不是在其中生物膜的形成是不需要的所有情况下都是有效的且可行 的。
[0007] 需要在生物膜中不希望的细菌的其他方法。

【发明内容】

[0008] 本公开设及用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜3D结构和分散生物膜的组合物和 方法，W便提高生物膜细胞去除和/或对其它试剂的敏感性(例如，环境或共施加处理）。具 体地，本公开设及レ精氨酸在医疗、工业、家庭或环境应用中微生物的去除和/或致感（例 如，对抗微生物剂）W及细菌感染(例如，在生物膜中）的治疗中的应用。
[0009] 本发明的实施方案提供导致W下中的一种或多种的组合物(例如，药物、商业、医 疗保健等）、系统、用途和方法:诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞 内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的Ξ维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细 胞代谢的相互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生 物膜中病原菌的比例、增加生物膜中有益菌的比例和防止生物膜中微生物的生长，其包括： 使生物膜中的细菌与至少ImM浓度的无细胞的心精氨酸接触，其中所述接触杀灭或抑制微 生物的生长和/或改变生物膜中细胞的3D排布，其可通过阻止它们与其它互作和/或将它们 暴露于有害的环境影响来破坏细菌。在一些实施方案中，微生物是细菌。在一些实施方案 中，细菌在共凝集物中。在一些实施方案中，生物膜是口腔生物膜。在一些实施方案中，细菌 在具有多个不同的细菌种类(例如，链球菌（5化691：0(30(3。3)和放线菌(4(31：；[]101]17。63)，如格 氏链球菌(S.gordonii)和口放线菌(A. oris))的共凝集物或生物膜中。在一些实施方案中， k精氨酸防止所述细菌的共凝集或促进所述细菌的脱粘附/分散。在一些实施方案中，心精 氨酸W至少ImM(例女日，至少lOmM、至少50mM、至少100mM、200mM、至少250mM、至少300mM、至少 350mM、至少400mM、至少450mM、至少 500mM、至少600mM、至少 700mM、至少 800mM、至少900mM 或 至少m)的浓度存在。在一些实施方案中，细菌在多品种口腔生物膜(例如在唾液中的牙斑） 中。在一些实施方案中，1^-精氨酸破坏唾液中生物膜的生长，没有抗菌活性。在一些实施方 案中，所述方法还包括使细菌与氯化十六烷基化晚(CPC)接触。
[0010] 另外的实施方案包括包含至少ImM浓度的k精氨酸W诱导W下一种或多种的组合 物的用途:诱导微生物细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏 细胞-细胞粘连、诱导结构的Ξ维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相 互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原 菌的比例、增加生物膜中有益菌的比例或防止生物膜中微生物的生长。在一些实施方案中， 组合物还包含氯化十六烷基化晚(CPC)。
[0011] 进一步的实施方案提供一种报告生物膜或浮游细胞群的成分的表达或浓度的质 粒，其中所述质粒包含在组成型启动子控制下的第一标记物或在由所述成分诱导的启动子 控制下的第二标记物。在一些实施方案中，所述标记物是巧光标记物（例如，GFP或 Mcherry)。在一些实施方案中，第一启动子是链球菌核糖体启动子（例如，格氏链球菌化1 50S核糖体蛋白（SG0_1192)启动子）。在一些实施方案中，第二启动子是格氏链球菌分解代 谢控制蛋白A( SG0_0773)或格氏链球菌argC或arcA启动子。
[0012] 另外的实施方案提供一种含有该质粒的链球菌细胞(如格氏链球菌）。在一些实施 方案中，细胞在生物膜中。
[0013] -些实施方案提供监测生物膜或浮游细胞培养物的成分(如精氨酸或AI-2)的浓 度的方法和用途，包括a)使链球菌细胞与本文所述的质粒接触；W及b)测量标记物的水平。 在一些实施方案中，标记物的表达水平与所述成分的水平相关。在一些实施方案中，所述方 法还包括使细胞与测试化合物(例如，杀灭或抑制细胞生长或疑似杀灭或抑制细胞生长的 药物)接触的步骤。
[0014] 本文描述了另外的实施方案。
【附图说明】
[0015] 图1示出精氨酸的牙菌斑生长中的作用。高浓度和低浓度的レ精氨酸引起生物膜 去稳定，并导致许多细胞从在死亡/破坏无响应细胞之后留下的生物膜中分散/去粘附。
[0016] 图2示出格氏链球菌argC和arcA基因表达响应于外源性心精氨酸的快速变化的调 节。（A)将格氏链球菌细胞在高（5mM)精氨酸中培养，并且在X轴上时间=0分钟处切换至无 精氨酸。（B)将格氏链球菌细胞在中间（0.5mM)精氨酸中培养至后指数生长期，当添加过量 (50mM)精氨酸时(时间=Omin)。
[0017]图3示出存在或不存在0.5mM或0.5M(500mM)精氨酸(Arg)的情况下在唾液中的格 氏链球菌生物膜。
[001引图4示出arcR的中断减少了通过格氏链球菌的生物膜形成。
[0019] 图5示出k精氨酸对在合并过滤灭菌唾液中发育的唾液衍生群体的物种组成的影 响。(A)示出由口腔多品种生物膜长时间暴露至500mM k精氨酸中引起的细菌多样性(操作 分类单元，0TU)的增加。黑色柱代表衍生自在流动的非补充的唾液中发育的生物膜的分析 的数据，而灰色柱代表衍生自在500mM补充的唾液中发育的生物膜的分析的数据。（B)示出 类群的变化(颜色编码如前）D(C)示出在属（图例从左至右在柱中从底部至顶部;淋球菌，颗 粒链菌(Granul icate 1 la)，链球菌等）的组合物变化。
[0020] 图6示出在静态条件下生长多品种的生物膜对提高k精氨酸的浓度的影响。在含 有补充有不同浓度的心精氨酸单盐酸盐(LAHC1)的无细胞唾液(CFS)的静态生物膜系统中 从含细胞的唾液(CCS)的接种物生长的20小时之久的口腔生物膜的代表性3D透视图。上部 透视图(Ai-Hi)是x-y平面的。中部透视图(A2-H2)是X-Z平面的。下部透视图(A3-H3)表不斜视 图（x-y-z)。标尺代表50皿。关联表示出平均百分比细胞活力的变化。
[0021] 图7示出k精氨酸使在微流体通道中流动的条件下在唾液中生长的多品种口腔生 物膜的结构不稳定。代表性3D透视图和从在Bioflux?流动的唾液生物膜系统中在不同浓度 的心精氨酸单盐酸盐(LAHC1)中发育20小时的口腔生物膜的计算图像分析得出的生物膜特 性。
[0022] 图8示出500mM k精氨酸使预制成的多品种不同发育年龄的口腔生物膜去稳定。
[0023] 图9示出k精氨酸使预形成多品种口腔生物膜群体去稳定，并且运样做可W提高 CPC的渗透(0.01或0.05% )。具体地，该图示出500mM k精氨酸增强CPC的渗透和杀灭，使得 与当再不存在k精氨酸的情况下使用时相比需要更少的CPC。
[0024] 图10示出通过响应AI-2的哈维氏弧菌BB170的生物发光的成倍诱导。示出随着k 精氨酸的浓度增加 AI-2上产增加量。AI-2数据被标准化为"对照"（未补充唾液）。
[0025] 图11示出应用レ精氨酸而不是D-精氨酸使细菌群体的生长趋稳定并防止细菌群 落的生长。
[00%] 图12示出(A)可修饰质粒(p阳1010)w允许巧光格氏链球菌化1(GFP或Mcherry)的 产生和(B)允许在相应外源添加的AI-2的格氏链球菌DL1生物膜中GFP巧光的差异表达的评 价的两个启动子的实例。
[0027] 定义
[00%]为了便于本发明的理解，许多术语和短语定义如下：
[0029] 如本文所用的术语"生物膜"是指任何Ξ维的（例如，基质包封)微生物群落显示的 多细胞特性。因此，如本文所用，术语生物膜包括表面相关生物膜W及在悬浮液中的生物 膜，如絮凝物和颗粒。生物膜可W包括单个微生物物种或可W混合物种复合物，并且可W包 括细菌W及真菌、藻类，原生动物或其它微生物。在一些实施方案中，生物膜包括共凝集生 物体。在一些实施方案中，生物膜包括单个生物体或不共凝集的多种生物体。
[0030] 如本文所用，术语"宿主细胞"是指无论在体外还是体内的任何真核或原核细胞 (例如，细菌细胞（如大肠杆菌）、酵母细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖类细胞、植物细 胞、鱼类细胞和昆虫细胞）。例如，宿主细胞可W位于转基因动物中。
[0031] 如本文所用，术语"原核生物"是指一组通常缺乏细胞核的生物体，或任何其它膜 结合细胞器。在一些实施方案中，原核细胞是细菌。术语"原核生物"包括古细菌和真细菌。
[0032] 如本文所用，术语"受试者"是指待通过本发明的方法或组合物来处理的个体(例 如，人、动物或其他生物）。受试者包括(但不限于)哺乳动物(例如鼠类、猿猴类、马、牛、猪、 犬、猫等），最优选地包括人类。在本发明的上下文中，术语"受试者"一般是指对于由生物膜 形成的细菌的存在表征的状态，或在可能暴露于生物膜形成细菌中的期待中将接受或已经 接受治疗的个体。
[0033] 如本文所用的术语，"体外"是指人工环境和人工环境内发生的过程或反应。体外 环境包括(但不限于)试管和细胞培养。术语"体内"是指自然环境(例如，动物或细胞)和在 自然环境中发生的过程或反应。
[0034] 如本文所用，术语"毒性"是指微生物(例如，细菌或真菌)的致病性的程度，例如由 所生产的疾病的严重程度或其侵入受试者的组织的能力指示。它一般是由中值致死剂量 化化0)或中值感染剂量（I化0)实验性测量。该术语也可W用来指任何感染剂产生病理作用 的能力。
[0035] 如本文所用，术语"有效量"是指组合物（例如，包含心精氨酸的组合物)足W实现 有益的或期望的结果的量。有效量可W在一次或多次施用、应用或剂量中施用，并且不旨在 被限于特定的制剂或施用途径。在一些实施例中，有效量为至少ImM(例如，10mM、50mM、 100111]\1、200111]\1、300111]\1、400111]\1、500111]\1、750111]\1、1000111]\1或更大）。
[0036] 如本文所用，术语"施用"指给予药物、前药或其它药剂或治疗性处理(例如，包含 心精氨酸的组合物)至生理系统(例如，受试者或体内、体外、或离体细胞、组织和器官）的行 为。施用到人体的示例性途径可W通过眼睛（眼）、口腔（口）、皮肤(经皮）、鼻(鼻内）、肺(吸 入剂）、口腔粘膜(颊）、耳、通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等等）、局部施用等。
[0037] 如本文所用，术语"处理表面"是指将表面暴露于一个或多个包含心精氨酸的组合 物的行为。处理表面的方法包括(但不限于)喷涂、喷雾、浸没和涂覆。
[0038] 如本文用，术语"共施用'是指对受试者施用至少两种药剂(例如心精氨酸结合抗 微生物剂)或治疗。在一些实施例中，两种或多种药剂或治疗剂的共施用是同步的。在其他 实施例中，在第二药剂/治疗剂之前施用第一药剂/治疗剂。本领域的技术人员理解，使用的 各种药剂或治疗剂的制剂和/或施用途径可W是不同的。本领域技术人员可W容易确定用 于共施用的合适的剂量。在一些实施例中，当共施用药剂或治疗剂时，各药剂或治疗剂W比 适合于单独施用更低剂量施用。因此，共施用是在实施例中是特别合乎需要的，其中药剂或 治疗剂的共同施用降低了（一或多种)潜在的有害(例如，有毒)药剂所需剂量。
[0039] 如本文所用，术语"伤口"广义地指W不同的方式引起的包括皮肤、皮下组织，肌 肉、骨骼的组织和其他结构的伤害，所述方式例如，外科手术，（例如，打开癌症后切除伤口， 包括但不限于去除黑色素瘤和乳腺癌等），包含手术后手术伤口，压疮(例如，来自长期邸床 休息)和创伤引起的伤口。如本文所用，术语"伤口"非限制性地用于伤口的原因，是物理原 因如身体定位为在稱疮中或如用创伤或生物原因（如疾病过程、老化过程、分娩过程或任何 其他方式的生物过程）的冲击。由压力引起的伤口还可根据伤口的深度被归类为四级：i)I 级：限于表皮的伤口； ii) Π 级：延伸到真皮的伤口；化）III级：延伸到皮下组织的伤口；和 iv)IV级：其中骨头都露出来的伤口（例如，骨压点，如大转节或紙骨）。术语"部分厚度的伤 口 "是指限于表皮和真皮的伤口；任何病因的伤口都可W是部分厚度。术语"全厚度伤口 "是 指包括通过真皮延伸的伤口。
[0040] 如本文所用，"伤口部位"广泛地指(但不限于)伤口的解剖位置。
[0041] 如本文所用，术语"敷料"广义地指应用到伤口用于保护、吸收、排水、处理等的任何材 料。许多类型的敷料是市售的，包括薄膜(例如，聚氨醋薄膜)冰状胶体(结合到聚氨醋泡沫的亲 胶体颗粒)、7jC凝胶(包含约至少60%水的交联聚合物)、泡沫体(亲水或疏水)、藻酸巧(来自藻酸 巧的纤维的无纺复合物）和玻璃纸（具有增塑剂的纤维素 KKannon和Garrett(1995) Dermatol. Surg. 21:583-590; Davies (1983 )Bu;rns 10:94;每个通过引用并入本文）。本发明还提 出使用用药理化合物(如，抗生素、防腐剂、凝血酶、镇痛化合物等)浸溃的敷料的用途。多孔伤 口敷;料包括市售的材料，如Apligra愧)、Denragnil'随、Biobrane坂、Ti'ansCyLe嚴、InLeg御霞 Dermal Regeneration Template愈和QrCeU?。
[0042] 如本文所用，术语"有毒"是指与施用有毒物之前相同的细胞或组织相比，在受试 者、细胞或组织上的任何不利或有害影响。
[0043] 如本文所用，术语"药物组合物"是指活性剂(如k精氨酸)与惰性或活性载体的组 合，使得该组合物特别适用于体外、体内或离体诊断或治疗用途。
[0044] 如本文所用的术语"药学上可接受"或"药理学上可接受的"是指当施用于受试者 时基本上不产生不良反应(例如，中毒反应、过敏反应或免疫反应)的组合物。
[0045] 如本文所用，术语"局部"是指本发明的组合物施用到皮肤和粘膜细胞和组织的表 面(例如，肺泡、颊、舌、狙嚼或鼻粘膜，W及排在中空性器官或体腔中的其他组织和细胞）。
[0046] 如本文所用，术语"药学上可接受的载体"是指任何标准的药物载体，包括(但不限 于)憐酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如，例如油/水或水/油乳液），W及各种类型的润湿 剂、任何和所有溶剂、分散介质、包衣、月桂基硫酸钢、等渗和吸收延迟剂、崩解剂(例如马铃 馨淀粉或淀粉径基乙酸钢)等等。该组合物还可W包括稳定剂和防腐剂。为对于载体、稳定 剂和佐剂的实例。（参见例如，Mar tin，雷明顿药物科学（Remington ' S Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack化bl .Co. ,Easton,化.（1975)，其通过引用并入本文）。在某些实 施例中，本发明的组合物可W配制用于兽医、园艺或农业用途。此类制剂包括薩剂，喷雾剂， 拌种剂，干细胞注射剂、喷雾剂和雾剂。在某些实施例中，本发明的组合物可w用于任何应 用中，其中理想的是改变(例如，抑制)生物膜的形成，例如，食品工业应用；消费品（例如，医 疗产品、用于受损或发育免疫系统的消费者(例如，婴儿、儿童、老年人、患有疾病或处于疾 病风险的消费者)的产品等等。
[0047] 如本文所用，术语"医疗设备"包括例如，在医学治疗(例如，对于疾病或损伤)过程 中，在患者的身体上、在患者的身体中或通过患者的身体使用的任何材料或设备。医疗设备 包括(但不限于)此类物品，如医疗用植入物、伤口护理设备、药物递送设备和体腔和个人保 护设备。所述医疗用植入物包括(但不限于)尿导管、血管内导管、透析分流器、伤口引流管、 皮肤缝合线、血管移植物、可植入网眼、眼内设备、屯、脏瓣膜等等。伤口护理设备包括(但不 限于)一般伤口敷料、生物移植材料、胶带封口和敷料W及手术切割被单。药物递送设备包 括(但不限于)针、药物递送皮肤贴剂、药物递送粘膜贴剂和医用海绵。体腔和个人保护设备 包括(但不限于）棉塞、海绵、手术和检验手套、隐形眼镜和牙刷。节育装置包括(但不限于） 子宫内避孕器(IUD)、隔膜和避孕套。
[0048] 如本文所用，术语"治疗剂"是指降低受试者(例如，通过形成生物膜的微生物接触 的受试者）中感染、发病率和发病死亡率，或预防在通过形成生物膜的微生物接触的宿主中 感染、发病率或发病死亡率的组合物。如本文所用，治疗剂包括预防性使用的药剂，例如在 缺乏形成生物膜的生物体中，鉴于将来可能暴露于形成生物膜生物体。此类药剂另外可包 含药学上可接受的化合物(例如佐剂、赋形剂、稳定剂、稀释剂等）。在一些实施例中，本发明 的治疗剂W外用组合物、可注射的组合物、可摄取组合物等形式施用。当途径是局部的时， 形式可为(例如)溶液、乳膏、软膏、药膏或喷雾。
[0049] 如本文所用，术语"病原体"是指在宿主中引起疾病状态(例如，感染、癌症等）的生 物药剂。"病原体"包括(但不限于)病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、航病毒和寄 生生物。
[0050] 如本文所用，术语"微生物(microbe)"是指微生物，并且旨在包括单独的生物体或 包含任何数量的生物体的制品两者。
[0051] 如本文所用，术语"微生物"是指任何物种或类型的微生物，包括(但不限于)细菌、 古细菌、真菌、原生动物、支原体和寄生生物。
[0052] 如本文所用，术语"真菌"当使用时设及真核生物，如霉菌和酵母菌，包括双态性真 困。
[0053] 术语"细菌"（bacteria/bacterium)是指包括在原核生物界中的所有口中的所有 原核生物。运意味着术语包括被认为是细菌的所有微生物，包括支原体、衣原体、放线菌、链 霉菌和立克次体。所有形式的细菌都包括在定义内，包括球菌、杆菌、螺旋体、原生质球、原 生质体等。也包括在术语内的是革兰氏阴性或革兰氏阳性原核有机体。"革兰氏阴性"和"革 兰氏阳性"是指革兰氏染色过程的染色模式，其在本领域中是公知的。（参见Finegold和 Ma;rtin，Dia即ostic Microbiology,第6版，CV Mosby St.Louis,第13-15页（1982))。"革兰 氏阳性细菌"是保留在革兰氏染色中使用的主要染料的细菌，导致染色的细胞通常在显微 镜下出现深蓝紫色。"革兰氏阴性细菌"不保留在革兰氏染色中使用的主要染料，而是通过 复染剂染色。因此，革兰氏阴性菌通常出现红色。
[0054]术语"非致病性细菌（non-pathogenic bacteria/non-pathogenic bacterium)" 包括所有已知的和未知的非致病性细菌(革兰氏阳性或革兰氏阴性)和已突变或转化为非 致病性细菌的任何致病性细菌。此外，本领域技术人员认识到，一些细菌可能对特定物种是 致病的，但对其它物种是非致病的；因此，运些细菌可W在其中它是非致病或突变的物种中 使用，使得它是非致病的。
[005引如本文所用，术语"非人动物'是指所有的非人类的动物，包括(但不限于)脊椎动 物，如晒齿类、非人灵长类动物、绵羊、牛、反当动物、兔类动物、猪、山羊、马、犬、猫、鸟类等。
[0056] 如本文所用，术语"细胞培养物"是指任何体外培养的细胞，包括(例如）原核细胞 和真核细胞。包括在该术语内的是连续的细胞系（例如，具有永生表型）、原代细胞培养物、 转化的细胞系、有限细胞系(例如，未转化的细胞）、在固体或液体培养基中或上的细菌培养 物，和任何其它体外保持的细胞群。
[0057] 如本文所用的术语"涂层"是指覆盖例如医疗设备或其部分的材料层。涂层可被施 加到表面或在植入物的材料内浸溃。
[0058] 如本文所用，术语"抗微生物剂"是指降低预防或抑制细菌和/或真菌生物生长的 组合物。抗微生物剂的实例包括例如，抗生素和防腐剂。
[0059] 如本文所用的术语"防腐剂"是指抑制微生物活性的抗菌物质，包括(但不限于)α- 祗品醇、甲基异嚷挫嘟酬、氯化十六烷基化晚、氯二甲苯酪、六氯酪、氯己定和其它阳离子双 脈、二氯甲烧，舰和舰伏（iodophores)、Ξ氯生、2-氨基乙基横酷胺（taurinamide)、巧喃妥 因、乌洛托品、醒类、丙締酸、银、苄基过氧化物、醇，W及簇酸和盐。本领域技术人员认识到， 运些抗菌剂可两种或多种组合使用，W获得协同或相加的效果。防腐剂的组合的一些 实例包括氯己定，氯己定和氯二甲酪，氯己定和甲基异嚷挫嘟酬，氯己定和(曰-祗品醇，甲基 异嚷挫嘟酬和α-祗品醇的混合物；百里酪和氯二甲苯酪;氯己定和西化氯锭；或氯己定、甲 基异嚷挫嘟酬和百里酪。运些组合提供对多种生物体的广谱的活性。
[0060] 如本文所用的术语"抗生素"被定义为抑制微生物的生长，优选不伤害宿主的物 质。例如，抗生素可W抑制细胞壁合成、蛋白质合成、核酸合成或改变细胞膜的功能。
[0061] 抗生素的类别包括(但不限于)大环内醋类(例如，红霉素）、青霉素类(例如，奈夫 西林）、头抱菌素(例如，头抱挫嘟）、碳青霉締类(例如，泰能）、单酷胺菌素(例如，氨曲南）、 其他β-内酷胺抗生素、β-内酷胺抑制剂(例如，舒己坦），酢浆草(例如利奈挫胺）、氨基糖巧 类(例如，庆大霉素）、氯霉素、横酷胺类(例如横胺甲恶挫）、糖(例如，万古霉素）、哇诺酬类 (例如，环丙沙星）、四环素类(例如，米诺环素）、夫西地酸、甲氧节晚、甲硝挫、克林霉素，莫 匹罗星、利福霉素类(例如，利福平）、链阳性菌素（例如，奎奴普下和达福普汀）脂蛋白（例 如，达托霉素）、多締(例如，两性霉素 Β)、挫类(例如，氣康挫)和棘球白素(例如，卡泊芬净醋 酸盐）。
[0062] 特定抗生素的实例包括(但不限于)红霉素、糞夫西林、头抱挫嘟、亚胺培南、氨曲 南、庆大霉素、横胺甲恶挫、万古霉素、环丙沙星、甲氧节晚、利福平、甲硝化挫、氯林可霉素、 替考拉宁、莫匹罗星、阿奇霉素、克拉霉素、氧氣沙星、洛美沙星、诺氣沙星、糞晚酸、司帕沙 星、培氣沙星、氨氣沙星、加替沙星、莫西沙星、吉米沙星、依诺沙星、氣罗沙星、米诺环素、利 奈挫胺、替马沙星、托氣沙星、克林沙星、舒己坦、棒酸、两性霉素 Β、氣康挫、伊曲康挫、酬康 挫和制霉菌素。抗生素的其他实例，如在Sakamoto等人，通过引用并入本文的美国专利第4， 642,104号中列出的那些对本领域普通技术人员将是很容易想到的。
[0063] 如本文所用，术语"样品"W其最广泛的含义使用。在某种意义上说，它是指包括获 自任何来源的标品或培养物，W及生物和环境样品。生物样品可获自动物(包括人)并包括 液体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，如血浆、血清等。然而，运样的例子不应当 理解为限制适用于本发明的样品类型。
【具体实施方式】
[0064] 本公开设及用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜3D结构和分散生物膜的组合物和 方法，W便提高生物膜细胞去除和/或对其它试剂的敏感性(例如，环境或共施加处理）。具 体地，本公开设及レ精氨酸在医疗、工业、家庭或环境应用中微生物的去除和/或致感（例 如，对抗微生物剂）W及细菌感染(例如，在生物膜中）的治疗中的应用。
[0065] 生物膜是其中细胞彼此粘附和/或粘附在表面上的微生物的聚集体。运些粘附细 胞经通常嵌入胞外聚合物化PS)的自产基质内。生物膜的EPS(也被称为粘液)是通常由胞外 DNA、蛋白质和各种结构的多糖构成且由各种组合物构成的聚合物团块。生物膜可W于活体 或非活体表面上形成，并代表在自然、工业和临床环境中微生物生命的普遍模式。在生物膜 上生长的微生物细胞生理学上不同于相同生物体的浮游细胞，其反过来是可漂浮或游在液 体培养基中的单细胞。
[0066] 响应于许多因素形成微生物生物膜包括但不限于，在表面上特异性或非特异性附 着位点的细胞识别、营养暗示，或在某些情况下，通过将浮游细胞暴露于亚抑制浓度的抗生 素中。当细胞切换到生物膜生长模式时，其经历行为上的表型转变，其中大批基因被差异调 节（Petrova等人，J.Bacteriol .2012May; 194(10) :2413-25 ;Stoodley等人，Annu Rev Microbiol.2002；56:187-209)〇
[0067] 虽然本发明不受任何类型的生物膜限定，但是生物膜的形成通常始于自由浮动的 微生物对表面的附着。运些第一寄生物最初通过微弱的可逆的范德华力粘附到表面。如果 寄生物不立即从表面分离，那么它们就可W使用细胞粘附结构如菌毛更永久地自我固定。
[0068] 最初的寄生物普遍通过提供更多样化的粘附位点并开始构建有共同生物膜的矩 阵促进其他细胞的到来。一些物种不能自身连接到表面，但往往能够自我错定到基质或直 接错定到更早的寄生物。在运种定殖期间细胞能够通过群体感应来通信，例如使用此类化 合物作为N-酷基高丝氨酸内醋(AHL)。一旦定植开始，生物膜通过细胞分裂和更新的组合来 增长。生物膜形成的最后阶段被称为发育，虽然本文中术语"形成"和"发育"可互换使用。在 此最后阶段，生物膜建立，并且可W仅在形状和尺寸上发生变化。生物膜的发育可使聚合细 胞集落(或群体）日益增加抗生素抗性。
[0069] 来自生物膜集落的细胞的扩散是生物膜的生命周期的重要阶段。扩散使生物膜扩 散且定值到新表面。降解生物膜的细胞外基质的酶(如dispersin B和脱氧核糖核酸酶)可 在生物膜分散中起作用(Whitchurch等人(2002)Science 295:1487;通过引用将其全文并 入本文）。生物膜基质降解酶可W用作抗生物膜试剂化apian等人（2004)Antimicrobial Agents and Qiemo1:herapy 48(7) :2633-6;Xavie;r等人（2005)Mic;robiology 151 (Pt 12): 3817-32;其每个通过引用将其全文并入本文）。脂肪酸信使(顺式-2-癸締酸)可诱导分散和 抑制生物膜集落的生长。通过铜绿假单胞菌分泌，运种化合物诱导在细菌的几个物种和酵 母白色念珠菌中分散(Davies等人（2009)Jou;rnal of Bacteriology 191(5): 1393-403;通 过引用将其文并入本文）。
[0070] 生物膜是普遍存在的，并且通常在浸没在或暴露于某些水溶液的固体基质上发 现，尽管它们可W形成为在液体表面并还在叶片的表面上的浮动垫，特别是在高湿度的气 候条件下。如果有足够的能源用于生长，生物膜将会迅速增长至肉眼可见。许多类型的微生 物可W形成生物膜，例如细菌、古细菌、原生动物、真菌和藻类。生物膜可W包含单一类型的 微生物(单种群落的生物膜），或者通常为多种类型。在一些混合物种生物膜中，每组执行特 定的代谢功能。
[0071] 生物膜形成的环境包括(但不限于）：在自然水域(例如，河流、池塘、溪流、海洋、矿 泉）中的基质（例如，岩石、碟卵石）；极端环境(例如，溫泉，包括极酸或极碱性抑的水域;冰 川）；住宅和工业环境，其中固体表面暴露于液体中（例如，淋浴器、水和污水管道、在食品制 备或加工区的地板和柜台、冷却水系统、海洋工程系统）;船体及海洋船舶的内饰;污水及自 来水处理设施(例如，水过滤器、管道、保溫水箱）；受污染的水域;在活生物体内或在活生物 体上(例如牙斑、例如皮肤的表面定植或感染、组织或器官或体腔或在伤口部位的表面;植 入表皮;植入物内部）；在植入设备如导管、假体屯、脏瓣膜、人工关节和子宫内设备的惰性表 面;等。
[0072] 生物膜参与身体中各种各样的微生物感染。其中生物膜设及的感染过程包括(但 不限于）：尿道感染、导管感染、中耳感染、牙菌斑和牙銀炎的形成、隐形眼镜污染（Imamura 等人（2008)Antimic;robial Agents and Qiemotherapy 52(1): 171-82;通过引用将其文并 入本文），和不常见但更致命过程，例如屯、内膜炎、囊性纤维化感染和永久留置设备(如关节 假体和屯、脏瓣膜）的感染(Xewis等人（2001)Antimic;robial Agents and Qiemotherapy 45 (4) :999-1007;F*arsek等人（2003)Annual Review of Microbiology 57:677-701;每个通 过引用其全文并入本文）。细菌生物膜可W损害皮肤伤口愈合，并且减少愈合或治疗感染的 皮肤伤口的局部抗菌效率(Davis等人（2008)Wound Repair and Regeneration 16(1 ):23- 9;通过引用其全文并入本文）。
[0073] 共凝集是通过在共凝集细胞表面上的互补蛋白粘附素和多糖受体介导的通常不 同细菌的高度特异性识别和附着力化〇lenbrande;r，Annu Rev Microbiol 54,413-437， 2000;Rickard等人，Trends Microbiol 11,94-100,2003a)。运个现象不同于自动聚集，运 是遗传上相同的细菌彼此识别和粘附化hemaleelakul等人，J Endod 32,312-318,2006; Rickard等人，FEMS Microbiol Lett 220,133-140,2003b;Van Houdt&Michiels，Res Microbiol 156,626-633,2005)。共凝集在 1970 年的人牙菌斑的细菌（Gibbons&Nygaard， Arch化al Biol 15,1397-1400,1970)之间首次描述，在过去二十年的工作已经表明，它也 发生在在废水絮凝体和淡水生物膜中从人体肠道、人类泌尿生殖道分离的细菌之间 (Ledder等人，FEMS Microbiol Ecol 66,630-636,2008Jhuong等人J Biotechnol,2011; Reid等人，Can J Microbiol 34,:344-351,1988;Rickard等人，A卵 1 linviron Microbiol 66,431-434,2000;Simoe等人，Appl Environ Microbiol 74，1259-1263,2008)。共凝集也 已经显示出发生在许多分类学上不同的淡水物种间（Rickard等人，Appl Environ Microbiol 68,3644-3650,2002;Rickard等人，2003b,同上；Rickard等人，A卵 1 Environ Microbiol 70,7426-7435,2004b;Simoes等人，A卵 1 Environ Microbiol 74,1259-1263， 2008)和在浮游和生物膜群中（Rickard等人 J Appl Microbiol 96,1367-1373,2004a)。銷 氨醇单胞菌泳池(芽单胞菌)和藤黄微球菌之间共凝集的研究证明物种共凝集的能力改变 在流动和静态环境两者中双物种生物膜发育(Min&Rickard,Appl Environ Microbiol 75, 3987-3997，2009 ;Min等人，Biofoul ing 26，931-940，2010)。共凝集可介导生物膜的发育、 结构变化W及在物种组成上的改变（Hojo等人，J Dent Res 88,982-990,2009; Kolenbrander等人，Periodontol 2000 42,47-79,2006 ;Rickard等人，2003a，同上）。此外， 共凝集可W在促进或阻碍致病菌种与淡水成生物膜一体化中发挥作用(Buswell等人，Appl Environ Microbiol 64,733-741,1998)。支持运种可能性的证据可W被发现在牙菌斑生物 膜的研究中，其中诱导共凝集W促进口腔病原体如牙銀化嘟单胞菌（Porphyromonas gingival is)的整合化olenbrander等人，Periodontol 2000 42,47-79,2006 ;Whitmore& Lamont,Mol Microbiol 81,305-314,2011)。
[0074] 牙菌斑是由上百种可W共同引起口腔和全身性疾病的细菌组成（Jakubovics等 人，Oral diseases. 2010; 16(8) :729-39;Kuo等人，Public Health. 2008; 122(4) :417- 33.)。在牙菌斑发育期间，细菌感知和响应改变它们在运些生物膜内自我建立的能力的多 种外源性细菌或环境衍生的化学物质。
[0075] 口腔生物膜形成整个工业化和发展中国家的主要问题。从最近的调查数据表明， 23.7 %的美国成年人有未经治疗的離齿，而38.5 %的成年人有中度至重度牙周炎 (National Center for Health Statistics.Health,United States,2011:With Special Feature on Socioeconomic Status and Health . Hyattsvi 1 le ,MD : 2012 ;Eke等人， Journal of den化 1 research.2012;91(10):914-20)。.未经治疗的離齿还会影响 15-20% 的孩子长达19年，而牙周炎是中老年人群中的主要问题，其中64%的65岁W上的成年人患 有严重形式的运种病征（National Center for Health Statistics.Health,United States,2011 :With Special Feature on Socioeconomic Status and Health.Hyattsville,MD:2012;E；ke等人，Journal of dental research.2012;91(10): 914-20)。显然，迫切需要用于控制牙菌斑相关的疾病的新方法。
[0076] 牙菌斑是良好平衡的稳态细菌群体(Marsh等人，Periodontology 2000.2011; 55 (I) : 16-35)。本发明的实施例提供了广泛作用的干预，例如改变此类口腔细菌群体的平衡， 并且在控制牙菌斑有关的疾病上比目标个体物种的战略更为有效。牙菌斑含有微生物的互 动"意识"群体。在清洁牙齿表面上，牙菌斑通过微生物繁衍发育（Jakubovics等人，同上； Kolenbrander等人,Nature reviews Microbiology. 2010; 8(7): 471-80;Kolenbrander等 人，Periodontology 2000.2006; 42:47-79 23，24)。最初的寄生物，主要是链球菌属，粘附 到唾液表膜并且产生生物膜层，其通过共凝集、细胞-细胞信号传导和代谢物识别支持其他 物种的整合（Jakubovics 等人，同上；Kolenbrander 等人，Nature reviews Microbiology.2010;8(7):471-80;Hojo等人，Journal of dental research.2009;88 (II) : 982-90 ; Rickard等人，Trends Microbiol .2003:11(2): 94-100 ; Bowden等人， Advances in dental research. 1997; 11(1) :81-99)。共凝集设及细菌间的特异性识别和 粘附，并使不同物种紧密靠犹。运增加了交换细胞-细胞信号传导分子或代谢物的潜能 化olenbrander等人，Nature reviews Microbiology. 2010; 8(7): 471-80 ;Ho jo等人，同 上）。例如，信号传导分子自体诱导物-2(AI-2)介导共凝集伴侣口腔链球菌和放线菌的互惠 生长，并有利于含有共凝集伴侣格氏链球菌和口腔链球菌的生物膜的发育（化a化a-Saenz 等人，Microbiology. 2012; 158(Pt 7) : 1783-95;Rickard 等人，Molecular microbiο 1 ogy. 2006; 60 (6): 1446-56.)。重要代谢物的例子包括过氧化氨，其由一些链球菌 产生并且抑制其它物种(包括变形链球菌）（Zhu等人，Oxid Med Cell Longev.2012;2012: 717843),?及乳酸，其由链球菌产生并通过共凝集用于能源的韦荣球菌属(Veillonella) 物种使用化gland等人，Proceedings of the 化tional Academy of Sciences of the United States of America, 2004; 101(48): 16917-22)。精氨酸对代谢物交换很重要 (化kubovics等人，同上），但不同于其它通信机制，它还会破坏口腔细菌之间的共凝集和看 起来具有对生物膜结构产生重大影响（Edwards等人，Oral microbiology and immunology.2007;22(4):217-24;Sato等人，J Microbiol Immunol Infect.2012;Ellen等 人，Oral microbiology and immunology.1992;7(4):198-203.)。
[0077]因此，虽然到目前为止精氨酸接受有限的注意力，但是它是生物膜发育的重要的 全局调节物和诱发離齿或牙周疾病的关键组分(化scimento等人，Oral microbiology and immunology. 2009:24(2):89-95) /'营养毒力，"即获取来自主机的营养细菌系统被认为是 关键因素发病机理，运一概念正逐渐成为感染性疾病的一个重要范例（Abu Kwaik等， Cellular microbiology. 2013; 15(6) :882-90)。尤其是氨基酸通常时对细菌的生长限制资 源。即使当物种具有对于氨基酸生物合成所需的所有基因时，它们在一定的条件下可W是 功能性营养缺陷型。例如，金黄色葡萄球菌(S化曲ylococcus aureus)具有编码来自k谷氨 酸的k精氨酸生物合成的完整遗传途径，但在体外无 k精氨酸的情况下不能生长(Nuxoll 等人，PLoS pathogens. 2012; 8(11): e 1003033)。同样，格氏链球菌可W厌氧生物合成1^-精 氨酸，但是在需氧条件下为官能精氨酸营养缺陷型(化kubovics等人，同上）。口腔链球菌在 体外具有对氨基酸的各种不同需要（Cowman等人，Applied microbiology. 1975;30(3): 374-80;Cowman等人，Journal of dental research. 1978;57(l):48;Te;rleckyj等人， Infect Immun. 1975; 11(4) :656-64)，并且不能很好地理解运些营养缺乏型如何限制牙菌 斑增长。早期定植菌从唾液获得大部分营养物质（Bowden等人，Advances in dental research. 1997; 11( 1) :81-99)。人的唾液可含有高达40μΜ游离精氨酸(Van Wuyclduiyse等 人，Journal of den1:al research. 1995;74(2) :686-90)。格氏链球菌无法在<25μΜ k精氨 酸下需氧生长(Jakubovics等人，同上）。格氏链球菌生长的精氨酸限制可W通过与口放线 菌的共凝集来克服(Jakubovics等人，同上）。与单一培养物相比，格氏链球菌精氨酸生物合 成基因的表达强烈下调共凝集，表明共凝集减轻低精氨酸应力。此外，在精氨酸受限的条件 下，口放线菌的共凝集支持格氏链球菌增长。因此，细菌间的相互作用对于唾液中生长是重 要的。
[007引I.治疗方法
[0079] 在本公开内容的实施例的发展过程中进行的实验表明：高浓度的精氨酸消除通过 格氏链球菌的生物膜形成。生物膜的形成W剂量依赖方式对精氨酸毫摩尔水平高度敏感。
[0080] 唾液中精氨酸浓度被认为保留低的，由于连续摄取到细胞中和通过细菌精氨酸酶 系统(ADS)旋转，运分解精氨酸至ATP，氨和心谷氨酷胺(Van Wuyclduiyse等人，Journal of dental research. 1995;74(2) :686-90)。氨的产生增加斑块的局部抑，运能防止離齿化iu 等人，International journal of oral science.2012;4(3) :135-40.)。机会性病原体铜 绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的ADS在生物膜上被上调，并且运些系统对保护细胞免受氧 和糖酵解衍生的簇酸(39,40)是必不可少的。口腔链球菌的ADS已经显示在混合物种系统中 影响生物膜形成，其中由S.中间型ADS的レ精氨酸的清除抑制由牙周病原菌牙銀化嘟菌 (P. gingival is)的生物膜形成（Cugini等人，Microbiology. 2013; 159(Pt 2): 275-85) oADS 的产生在转录水平上由ArgR/AhrC家族调节子（如ArcR)调控化iu等人，Applied and environment al microbiology . 2008 ; 74 (16 ) : 5023-30 ; Zeng等人，Journal of bacteriology.2006:188(3) :941-9))eArcR在营养丰富的培养基中格氏链球菌生物膜形成 是重要的。
[0081] 本文所述的进一步的实验证实心精氨酸通过减少生物膜的生物量和减少病原菌 的总量和比例来降低生物膜的致病潜力（例如，没有直接的抗微生物活性）；并且k精氨酸 扩大/增强抗菌微生物(如CPC)的活性。运是通过由通过松动生物膜并且还改变细菌的生长 速率来提高抗菌微生物的进入;心精氨酸导致细胞-细胞信号传导失调;1^-精氨酸是组合治 疗，其上调代谢、改变细胞-细胞信号传导并且抑制细胞-细胞粘连;并且k精氨酸增加可W 对付潜在病原体如变形链球菌的负面影响的有益细菌的比例。
[0082] 因此，本发明的实施例提供了含有心精氨酸(例如，单独或与CPC共组合)的组合物 (例如，药物或研究的组合物或试剂盒），W及在治疗或预防细菌感染(例如，牙菌斑）中和在 表面的去污(例如，医疗器械的表面)中使用k精氨酸的药物、工业或研究方法。
[0083] 在一些实施例中，本公开内容提供了组合物W及用于使用k精氨酸W破坏生物膜 内的细胞-细胞相互作用（附着力）、扰乱细菌稳态、诱导细胞损伤和杀灭、破坏导致稳态的 失调/损失的细胞内过程、破坏生物膜细胞-细胞粘连、诱导结构的3D重排、破坏细胞-细胞 信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用和/或破坏对表面的粘附的组合物和方法。
[0084] 在一些实施例中，1^-精氨酸单独和集体地诱导一种或多种上述的和运些任务，W 杀灭和/或降低细胞活性和减少生物膜生物质。在一些实施例中，运也允许对抗微生物剂 (如k精氨酸-抗微生物剂或混合物)改进的杀灭。
[0085] 在一些实施例中，本发明提供了包含k精氨酸单独或与药学上可接受的载体或其 它期望的缓释材料(例如，清洁剂或消毒剂等)组合的组合物。
[0086] 在一些实施例中，本公开提供了组合物（例如，牙科护理组合物如牙膏、漱口水 等），其包含k精氨酸与例如CPC组合。
[0087] 用于局部施用的药物组合物和制剂可W包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴 剂、栓剂、喷雾剂、液体、漱日水和粉末。常规的药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等 可能是必要的或期望的。
[0088] 用于口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒剂、在水或非水介质中的悬浮液或 溶液、胶囊剂、小药囊或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是期 望的。
[0089] 用于肠胃外、銷内或脑室内施用的组合物和制剂可包括也可W含有缓冲剂、稀释 剂和其它适合的添加剂的无菌水溶液，所述添加剂例如(但不限于)渗透增强剂、载体化合 物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
[0090] 本公开的药物组合物包括(但不限于)溶液、乳剂和含脂质体的制剂。运些组合物 可由多种组分组成，所述组分包括(但不限于)预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。
[0091] 药物制剂，其可W方便地W单位剂量形式存在，可根据制药工业中熟知的常规技 术来制备。
[0092] 组合物可W另外包含在药物组合物中常规发现的其他辅助组分。因此，例如，组合 物可含有额外的、相容的、药学活性材料，如（例如)止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂， 或可W含有在W物理上配制各种剂型的组合物的其它材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗 氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加此类材料时，不应该不适当地与组合物的组 分的生物活性干设。如果需要，该制剂可W是灭菌的并且与助剂混合，所述助剂例如润滑 剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳 香物质等，其不有害地与制剂的活性剂相互作用。
[0093] 在一些实施例中，药物组合物包含3化-精氨酸，和b)-种或多种用于杀灭或预防 微生物生长(例如，抗生素)或影响在生物膜的生长、形成或健康影响或微生物的其它试剂。
[0094] 在一些实施例中，本发明提供了使用k精氨酸治疗或预防细菌感染或存在于表面 上的生物膜(如，牙菌斑)的试剂盒、医药组合物或其它施用系统。所述试剂盒可包括任何和 所有的用于研究或治疗用途必要的、有用的或足够的组分，包括(但不限于化-精氨酸、药物 载体和有用的，W及用于疗或预防细菌感染有用的、必需的或足够的其它组分。在一些实施 例中，试剂盒提供所需组分的子集，其中预期使用者将提供剩余的组分。在一些实施例中， 试剂盒包含两个或更多个分离的容器，其中每个容器容纳带递送的组分的子集。任选地，组 合物和试剂盒包含其它活性成分W达到所希望的治疗效果。
[00M]在一些实施例中，1^-精氨酸用来杀灭在共凝集或生物膜中的细菌。包含本文所述 的心精氨酸的组合物发现在杀灭或抑制多种微生物(例如，病原性细菌或真菌)的生长的用 途。在一些实施例中，k精氨酸或含有k精氨酸的组合物发现在身体中或在身体上的细菌 感染(例如，在共凝集或生物膜的细菌感染)的治疗中的用途。在一些实施例中，1^-精氨酸或 其组合物用于治疗伤口的细菌感染、败血症、在胃或肠中的致病细菌感染等。
[0096] 在一些实施例中，药物组合物W维持或持续的方式施用（例如，每天一次或多次， 每天两次或更多次，每周一次或多次，等等）。在一些实施例中，组合物被连续施用(例如，通 过皮肤贴剂、細带或时间释放制剂）。在一些实施例中，组合物施用一次、两次、五次、十次或 更多次。在一些实施例中，组合物施用几周、几月、几年或无限期的时间。
[0097] 在一些实施例中，1^-精氨酸或包含レ精氨酸的组合物发现在医疗设备（例如，导 管、窥器等)或可植入医疗设备(如，起搏器、内部除颤器、人造关节或骨头等)的去污中的用 途。
[0098] 在一些实施例中，k精氨酸或包含k精氨酸的组合物发现在表面(如，包括生物膜 的表面）的去污中的用途。实例包括(但不限于)家居表面、医院或临床表面(如，检查表，操 作室等），等等。
[0099] 在一些实施例中，k精氨酸或包含心精氨酸的组合物发现在食品或食品准备区的 去污或保护中的用途。例如，在一些实施例中，在收货后将k精氨酸施加到食品，W使免受 未来的污染或处理现有的污染。
[0100] 在一些实施例中，1^-精氨酸或包含レ精氨酸的组合物发现在治疗和/或预防離病 和牙銀疾病中的用途。在一些实施例中，心精氨酸被加入到漱口水、牙膏或其它口腔护理产 品中。
[0101] II.筛选组合物和方法
[0102] 本公开的实施例提供用于确定在生物膜或浮游细胞种的生物膜组分(例如精氨酸 或AI-2)的水平的组合物和方法。精氨酸被链球菌内源化并通过Ξ个不同但相关的调节蛋 白的作用感测:ArcR、AhrC和Ar曲。当他们结合精氨酸时，运些改变它们的结构，使得它们结 合到启动子序列或由启动子释放。
[0103] 因此，本公开的实施例提供报告在生物膜或浮游细胞培养物中的组分的表达或浓 度的质粒。在一些实施例中，所述质粒包括在组成型表达的细菌启动子的控制下的第一可 检测(例如，巧光)标记物或第二标记物(例如，不同颜色的巧光标签），所述第二标记物由在 生物膜中的组分(例如，在生物膜或细胞培养物中的精氨酸或AI-2)诱导。本公开不限于特 定的启动子或报告基因。巧光标记的实例包括(但不限于)巧光素酶、氯霉素乙酷转移酶、绿 色巧光蛋白（GFP)或Mcherry。在一些实施例中，启动子是链球菌启动子(例如，在格氏链球 菌中有活性的启动子，如（例如）格氏链球菌化1 50S核糖体蛋白（SG0_1192)、格氏链球菌 argC或arcA启动子或分解代谢物控制蛋白A(SG0_0773))。在一些实施例中，50S核糖体蛋白 启动子或其它链球菌核糖体启动子或乳酸乳球菌启动子(如USP45)用作控制第一标记物的 组成型表达的启动子。在一些实施例中，分解代谢物控制的蛋白A启动子是AI-2。在一些实 施例中，argC或arcA启动子响应于精氨酸。
[0104] 在一些实施例中，本公开提供使用本文所述的质粒来监控生物膜的组分(例如，精 氨酸或AI-2)或浮游的细胞群(例如，在链球菌属如格氏链球菌）的浓度的方法，其包括:a) 使链球菌细胞与本文所述的启动子接触;和b)测定标记物的水平。在一些实施例中，在由外 部生物膜组分诱导的启动子或组成型启动子控制下来自标记物的信号水平与来自组分的 已知量/浓度信号的水平相比（例如，标准曲线）。在一些实施例中，然后巧光的水平在巧光 计或成像系统中相关。
[0105] 在一些实施例中，报告质粒和方法发现在研究、筛分(例如，药物筛选)和诊断应用 中的用途。例如，在一些实施例中，将测试化合物(例如，抗微生物药物)加入到生物膜或浮 游细胞群中，并且测定测试化合物对生物膜组分(例如，精氨酸)的水平的影响。
[0106] 实验
[0107] 为了证明和进一步说明本发明的某些优选实施例和方面，提供W下实例，并且W 下实例不应当被理解为限制其范围。
[010引 实例1
[0109] 本实例设及由单一物种的细菌形成的生物膜。在运些系统中，1^-精氨酸对细菌基 因调控、表型、代谢和生物膜形成具有不同的影响。
[0110] 精氨酸感应触发基因调控。
[0111] 格氏链球菌包含用于k精氨酸的生物合成的完整遗传途径。然而，像金黄色葡萄 球菌，在实验室条件下其时官能精氨酸营养缺陷型（Jakubovics等人，同上，Nuxoll等人， PLoS pathogens . 2012; 8( 11): e100 3033)。从精氨酸充满的培养基到精氨酸缺乏的培养基 的转变导致格氏链球菌的表型显着变化。除了先前示出由共凝集进行调节的基因外，存在 几个充分表征的细胞表面黏附素的表达的显著降低(表1)。在一般情况下，代谢物随着精氨 酸生物合成途径(其是强烈上调的）的异常而减少（图2)。在营养限制情况下，运些数据与特 异的生物膜分散细胞的状态的发育一致，类似于由二态水生细菌新月柄杆菌产生的 化ngland等人，Journal of bacteriology.2010;192(3) :819-33.)。本实例设及由单一物 种的细菌形成的生物膜。在运些系统中，精氨酸对细菌基因调控、表型、代谢和生物膜形 成具有不同的影响。
[0112] 生物膜形成在环境有密切关系的微生物膜系统中。
[0113] 格氏链球菌生物膜的精氨酸依赖性施用的效果在改性Bioflux微流体系统进行评 估。从>6不同志愿者中收集和合并人的唾液(Cua化a-Saenz等人，Microbiology. 2012; 158 (Pt 7): 1783-95)，稀释至25%，并且根据模拟不同的条件的需要添加额外补充成分(如薦 糖、氯化血红素、BHI)。请注意，在即使不补充唾液的情况下我们强劲生长生物膜，并且合并 的唾液最下化唾液成分的变化。为了获得在合并唾液中游离精氨酸水平的指示，在>3种不 同合并的唾液样品中使用标准技术测量精氨酸(Jakubovics等人，同上;化η Wuyc化uyse等 人，Journal of dental research. 1995;74(2) :686-90)。该Bioflux系统的24个通道都涂 有唾液，用单一培养的格氏链球菌(或收获自唾液的多品种生物膜)接种，并且用无细胞唾 液在37°C下发育生物膜。20小时后，用活/死染色剂染色细胞，并使用Leica SPE化SM可视 化。使用C0MSTAT(Heydorn 等人，Microbiology. 2000; 146 (Pt 10) :2395-407 )、ImageJ (Co 11 ins, Biotechniques. 2007; 43 (IS叩pi) :25-30) W 及IMARIS 软件（Bitplane, Switzerland)量化生物质和结构生物膜参数。图3示出高浓度的精氨酸巧OOmM)显著降低存 在的生物膜的程度。
[0114] 精氨酸和细菌生物膜的形成。
[0115] 精氨酸已经显示在生物膜形成和由革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的宿主定植中起 关键作用。例如，在囊性纤维化疲中发现的生理浓度下，精氨酸促进铜绿假单胞菌 (P.aeruginosa)生物膜的形成（Bernier等人，Research in microbiology. 2011; 162(7): 680-8)。精氨酸是阻止铜绿假单胞菌分群的唯一氨基酸，因此，在此物种中促进固着生活方 式中起着关键作用(Bernier等人，同上）。在金黄色葡萄球菌中，在精氨酸生物合成途径中 的最终基因，argH，是在小鼠肾脏脈肿模型中对于毒性必需的，表明精氨酸被限制在体内 (Nuxoll等人，同上）。许多口腔链球菌是营养缺陷型或对精氨酸条件性营养缺陷型 (Jakubo vies等人，同上，Cowman等人，A邮 1 ied microbiology .1975;30(3): 374-80 ; Terleckyj 等人，Infect Immun . 1975; 11(4) :656-64; Co wman等人，App 1 i e d microbiology. 1974；27(1) :86-92；Rogers#A,Journal of general microbiology. 1990:136(12) :2545-50)。使用a巧H突变和补充株调查格氏链球菌精氨酸生 物合成途径对在唾液生物膜的生长的重要性。本发明并不限于特定的机理。实际上，机制的 理解对于实践本发明不是必须的。尽管如此，可W预期的是精氨酸为对于心精氨酸的生物 合成缺陷型链球菌生长为在唾液生物膜中的单一物种菌落的限制性营养物。此外，可W预 期的是，与生物膜中的其它物种的共凝集克服k精氨酸限制的效果，但是通过添加升高量 的心精氨酸而受破坏。
[0116] 在生物膜中的精氨酸分解代谢。
[0117] 与浮游细胞相比，由于在编码精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)的基因的表达的增加，在 铜绿假单胞菌的生物膜细胞中，精氨酸代谢被上调(Xu等人，PloS one. 2013; 8(2): e57050; Sauer等人，Journal of bacteriology. 2002; 184(4): 1140-54) eADS是在该生物体中无氧 代谢的重要组分。转换到ADS介导的厌氧发酵与铜绿假单胞菌对环丙沙星和妥布霉素的增 加的易感性相关（Borriello等人，Antimicrobial agents and chemotherapy.2004;48 (7) :2659-64) dADS在金黄色葡萄球菌的致病中也是重要的。实际上，金黄色葡萄球菌的 USA300致病谱系已经获得了遗传元素，称为精氨酸分解代谢移动元件(ACME),其中包含编 码ADS途径的基因，并且被认为是促进在皮肤上生长和存活的关键因素（Otto等人， International journal of medical microbiologyJJMM.2013)。运样，ACME可W对于 USA300菌株的高透射性非常重要。
[0118] 高浓度的精氨酸负面地影响某些口腔细菌定植口腔生物膜的能力。精氨酸已经示 出抑制口腔细菌之间的若干不同的共凝集相互作用化dwards等人，Oral microbiology and immunology . 2007 ; 22 (4 ) : 217-24 ; George等人，Oral microbiology and immunology .1992:7(5):285-90. PubMed PMID:1494452; Kaplan等人，Molecular microbiology . 2009 ; 71 ( 1 ) : 35-47 ; Takemoto等人，Journal of periodontal research. 1993;28(1) :21-6.;化gata等人，Journal of dental research. 1990;69(8): 1476-9.)。本文所述的数据表明，口腔生物膜内的共凝集的破坏导致细菌从生物膜的释放。 营养成分诱导铜绿假单胞菌生物膜的扩散，并且运种现象设及精氨酸代谢所需的基因 (Sauer等人，Journal of bacteriology. 2004186(21): 7312-7326)。图4示出在格氏链球菌 中编码ArcR的基因中，精氨酸脱亚胺酶系统的基因调节子对于由格氏链球菌的生物膜形成 是必须的，由于缺乏arcR基因的菌株不形成强生物膜。因此，心精氨酸是生物膜形成的中屯、 调节子。
[0119]
[0120] 表1.选择跟随低精氨酸的转变强烈调节的格式链球菌基因。
[0121] 对于多基因位点，显示通过基因座的平均倍数变化。
[0122] 实例2
[0123] 本实施例描述k精氨酸对包含在代表人类口腔的条件下生长的物种的口腔生物 膜的影响。使用基于微流体的方法，使用人唾液作为接种物并且25%的过滤灭菌的人唾液 作为营养源，证明Η化-均衡的k精氨酸(LA肥L) W浓度依赖性的方式使口服生物膜不稳定。 去稳定表示为生物膜结构的损失和细菌群落成员的变化，由激光共聚焦显微镜和454焦憐 酸测序确定。非常有限的抗菌效果是显而易见的，并仅检测为生物膜扰动的结果，W及对去 稳定的最佳浓度为50mM至500mM。由于使用肥1平衡的k精氨酸化-精氨酸单盐酸盐)和人唾 液的缓冲能力，记录到pH值没有实质性的变化。
[0124] 由于传统的控制口腔生物膜的方法在很大程度上依赖于抗微生物剂，心精氨酸被 证实去稳定效应，与其他抗微生物剂具有协同效应W更有效地对灭活生物膜细胞进行研 究。混合k精氨酸与西化氯锭(CPC)导致至少五倍大的生物膜失活(通过活/死染色）。总的 来说，证实k精氨酸在代表人类口腔的条件下具有广阔的口腔生物膜去稳定影响。运种影 响用来去除生物膜或加强传统的基于CPC的抗菌治疗战略。
[0125] 结果示于图5至图11中。图5示出在k精氨酸（500mM)处理生物膜的群体组分的变 化。图6示出在静态(不流动)微孔板系统中k精氨酸(CLSM)对在合并的过滤灭菌唾液中发 育的唾液衍生群体的细菌的多品种生物膜的影响。50〇11^的心精氨酸去稳定多品种口腔生 物膜群体W减少生物膜的生物量及因此细菌(包括病原体)的总数），也使生物膜相对于 结构更加扩散。虽然在指示非响应死/受损细胞留在生物膜中的红色"信号"中存在轻微的 统计学显著，但并没有观察到实质性的杀灭。
[0126] 图7示出代表性3D透视图和从在Bioflux?流动的唾液生物膜系统中在不同浓度的 k精氨酸单盐酸盐化AHC1)中发育20小时的口腔生物膜的计算图像分析得出的生物膜特 性。绿色信号表示存活的活细胞，且红色信号表示受损/死细胞。关联表显示在细胞活力、生 物膜的生物量、厚度和粗糖度的变化。从跨Ξ个实验和标准偏差的至少18个透视图中衍生 的数据示于括号内。冲<0.05; *冲<0.01; *冲<0.001:来自WS控制的显著差异。
[0127] 图8示出500mM k精氨酸使预制成的多品种不同发育年龄的口腔生物膜去稳定。
[0128] 图9示出k精氨酸使多品种口腔生物膜群体去稳定，W提高CPC的渗透。结果，低 CPC浓度用于实现相同水平的杀灭/灭活/细胞损伤。
[0129] 图10示出在哈维氏弧菌报告菌株BB170标准化为阳性对照(BB152)的巧光素酶产 生的成倍诱导。用给定浓度的精氨酸的纯CFS(无细胞唾液)控制运行与微流体流出进行比 较，其包含具有用给定浓度的心精氨酸生长的细菌的任何分泌的分子。首先通过取每个浓 度4个试验的平均值并用对于阴性对照的平均除W它们，产生感应数来产生值。从多品种生 物膜产生的AI-2的量随着用于治疗他们的精氨酸浓度增加而增加。运表明心精氨酸激发细 菌群体，因为AI-2是用于代谢的代理。高AI-2也可对群体具有去稳定影响，运可W解释或有 助于在生物膜中可见的结构变化。
[0130] 图11示出应用心精氨酸破坏细菌生物膜群体，而D-精氨酸不具有相同的效果。因 此，精氨酸的去稳定影响对L型是特异的。
[0131] 总之，运些实例证明心精氨酸通过减少生物膜的生物量和减少病原菌的总量和比 例来降低生物膜的致病潜力;1^-精氨酸扩大/增强抗菌微生物(如CPC)的活性。运是通过由 通过松动生物膜并且还改变细菌的生长速率来提高抗菌微生物的进入;1^-精氨酸导致细 胞-细胞信号传导失调;k精氨酸是组合治疗，其上调代谢、改变细胞-细胞信号传导并且抑 制细胞-细胞粘连;并且k精氨酸增加可W对付潜在病原体如变形链球菌的负面影响的有 益细菌的比例。韦荣球菌(Veillonella)物种的比例在生物膜中增加，如非離齿链球菌的比 例。
[0132] 实例3
[0133] 质粒(参见例如图12)被用来监测在精氨酸或AI-2的存在下报告基因的表达。对描 述于England等人（Proc 化tl Acad Sci U S A. 2004 Nov 30; 101(48) :16917-22.Epub 2004NOV 16)中的pPElOlO主链进行修饰，W在格氏链球菌化1或其它物种的链球菌中表达 巧光基因如GFP或Mcherry。具体地讲，将来自差异调节的基因的启动子插入隐匿在pPElOlO 上的GFP或Mcher巧基因的上游(或类似的链球菌质粒穿梭载体系统）W差异表达（图12A和 12B)。实例（图12B)执行示出当暴露于外源添加的自体诱导物-2(AI-2)时，由50S核糖体蛋 白（SG0_1192;负责高度丰富的50S核糖体蛋白L10的基因 rplj)最小化差异表达与由分解代 谢物控制蛋白A(SG0_0773;ccpA)的不同差异基因表达的比较。该质粒提供用于监测在生物 膜中的细菌的组成型产生的巧光探针和可在生物膜(例如在牙斑生物膜中发现的那些）中 报告精氨酸(或AI-2)的浓度的报告系统。
[0134]所有出版物、专利W及在上述说明书中提及的专利申请和登记号通过引用其全文 并入本文。尽管已经结合具体实施例对本发明进行了描述，但是应当理解的是所要求保护 的本发明不应不适当地局限于此类具体实施例中。实际上，对本发明的描述的组合物和方 法的各种修改和变型对本领域的普通技术人员将是显而易见，并且旨在在W下权利要求的 范围内。
【主权项】
1. 一种诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作 用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原菌的 比例、增加生物膜中有益菌的比例和/或防止生物膜中微生物的生长的方法，所述方法包 括： 使生物膜中的细菌与至少ImM浓度的无细胞的L-精氨酸接触，其中所述接触导致以下 一种或多种:诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细 胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互 作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、增加生物膜中有益菌的比例和防止所述 微生物的生长。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是细菌。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述细菌在共凝集物中。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述生物膜是口腔生物膜。5. 根据权利要求2所述的方法，其中所述细菌在具有多个不同的细菌种类的共凝集物 或生物膜中。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述L-精氨酸防止所述细菌的共凝集 或脱粘附/分散。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述L-精氨酸以至少lOOmM的浓度存 在。8. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述L-精氨酸以至少200mM的浓度存 在。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述L-精氨酸以至少500mM的浓度存 在。10. 根据权利要求5所述的方法，其中所述细菌种类是链球菌属和放线菌属。11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌种类是格氏链球菌和口放线菌。12. 根据权利要求1所述的方法，还包括使所述细菌与氯化十六烷基吡啶(CPC)接触。13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述生物膜在唾液中，并且所述L-精氨酸破坏所 述生物膜没有抗微生物活性。14. 包含至少ImM浓度的L-精氨酸以导致以下一种或多种的组合物的用途:诱导细胞损 伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的 三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用、破坏对表面的粘附、 减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原菌的比例、增加生物膜中有益 菌的比例和防止生物膜中微生物的生长。15. 根据权利要求14所述的用途，其中所述微生物是细菌。16. 根据权利要求15所述的用途，其中所述细菌在共凝集物中。17. 根据权利要求14至16中任一项所述的用途，其中所述生物膜是口腔生物膜。18. 根据权利要求15所述的用途，其中所述细菌在具有多个不同的细菌种类的共凝集 物或生物膜中。19. 根据权利要求14至18中任一项所述的用途，其中所述L-精氨酸防止所述细菌的共 凝集或脱粘附/分散。20. 根据权利要求14至19中任一项所述的用途，其中所述L-精氨酸以至少1 OOmM的浓度 存在。21. 根据权利要求14至20中任一项所述的用途，其中所述L-精氨酸以至少200mM的浓度 存在。22. 根据权利要求14至21中任一项所述的用途，其中所述L-精氨酸以至少500mM的浓度 存在。23. 根据权利要求18所述的用途，其中所述细菌种类是链球菌属和放线菌属。24. 根据权利要求23所述的用途，其中所述细菌种类是格氏链球菌和口放线菌。25. 根据权利要求14所述的用途，其中所述组合物还包含CPC。26. 根据权利要求14的用途，其中所述生物膜在唾液中，并且所述L-精氨酸破坏所述生 物膜没有抗微生物活性。27. -种诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细 胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互 作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原菌 的比例、增加生物膜中有益菌的比例和/或防止生物膜中微生物的生长的方法，所述方法包 括： 使生物膜中的细菌与至少ImM浓度的无细胞的L-精氨酸与CPC的组合接触，其中所述接 触导致以下一种或多种:诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过 程、破坏细胞-细胞粘连、诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代 谢的相互作用、破坏对表面的粘附、减少生物膜的致病潜力、增加生物膜中有益菌的比例和 防止所述微生物的生长。28. 包含至少ImM浓度的L-精氨酸与CPC的组合导致以下一种或多种的组合物的用途： 诱导细胞损伤、杀灭细胞、破坏导致稳态的失调/损失的细胞内过程、破坏细胞-细胞粘连、 诱导结构的三维重排、破坏细胞-细胞信号传导、破坏细胞-细胞代谢的相互作用、破坏对表 面的粘附、减少生物膜的致病潜力、减少生物膜质量、降低生物膜中病原菌的比例、增加生 物膜中有益菌的比例和防止生物膜中微生物的生长。29. -种报告生物膜或浮游细胞群的成分的表达或浓度的质粒，其中所述质粒包含在 组成型启动子控制下的第一标记物或在由所述成分诱导的启动子控制下的第二标记物。30. 根据权利要求29所述的质粒，其中所述标记物是荧光标记物。31. 根据权利要求30所述的质粒，其中所述焚光标记物是GFP或Mcherry。32. 根据权利要求29所述的质粒，其中所述第一启动子是链球菌核糖体启动子。33. 根据权利要求32所述的质粒，其中所述启动子是格氏链球菌DL1 50S核糖体蛋白 (SG0_1192)启动子。34. 根据权利要求29所述的质粒，其中所述第二启动子是格氏链球菌分解代谢控制蛋 白A(SG0_0773)或格氏链球菌argC或arcA启动子。35. -种链球菌细胞，其包含权利要求29至34中任一项所述的质粒。36. 根据权利要求35所述的链球菌细胞，其中所述细胞是格氏链球菌。37. 根据权利要求35所述的链球菌细胞，其中所述细胞存在于生物膜中。38. -种监测生物膜的成分的浓度的方法，所述方法包括： a) 使链球菌细胞与权利要求29至34中任一项所述的质粒接触；以及 b) 测量所述标记物的水平。39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述成分是精氨酸或AI-2。40. 根据权利要求38所述的方法，其中所述第一或第二标记物的表达水平与所述成分 的水平相关。41. 根据权利要求38所述的方法，还包括使所述细胞与测试化合物接触的步骤。42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述测试化合物为药物。43. 根据权利要求29至34中任一项所述的质粒监测生物膜或浮游细胞培养物的成分的 浓度的用途。44. 根据权利要求43所述的用途，其中所述成分是精氨酸或AI-2。45. 根据权利要求43所述的用途，其中所述第一或第二标记物的表达水平与所述成分 的水平相关。46. 根据权利要求43所述的用途，还包括使所述细胞与测试化合物接触的步骤。47. 根据权利要求46所述的方法，其中所述测试化合物为药物。
【文档编号】A61K31/198GK106029062SQ201480064187
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2014年9月24日
【发明人】A.里卡, N.贾库博维奇, D.S.萨马里安, E.科尔德曼
【申请人】密执安大学评议会, 泰恩河畔纽卡斯尔大学