一种具有黏液层渗透和P?gp抑制双重作用纳米胶束的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于抗肿瘤药物口服递送的纳米胶束的制备技术，即一种具有黏液层渗透和P?gp抑制双重作用纳米胶束的制备方法，以壳聚糖、槲皮素和6磷酸葡萄糖酸为原料，通过缩合脂化法制备双亲性壳聚糖?槲皮素琥珀酸脂?6磷酸葡萄糖酸共聚物，通过自组装技术合成目标产物，该纳米胶束具有良好的黏液层渗透能力，同时兼顾P?gp抑制作用，能够有效提高抗肿瘤药物的口服递送效率。可用于医用生物材料和药物载体，具有良好的研究和开发应用前景。
【专利说明】
一种具有黏液层渗透和P-gp抑制双重作用纳米胶束的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于药剂学领域的一种具有黏液层渗透和p-gp抑制双重作用纳米胶束的制备技术。
【背景技术】
[0002]随着纳米技术在生物医药领域研究与应用的不断深入，纳米载体材料在解决疏水药物体内转运困难、胃肠道环境对药物分子活性破坏，提高生物利用度等方面呈现出独特的功效性，表现出其他制剂无法达到的效果。目前普遍认为，小肠粘膜屏障是制约纳米制剂小肠吸收效率的主要因素。带有正电荷的纳米制剂，通过静电作用与小肠上皮细胞发生粘附，促进细胞对纳米制剂的吞噬和转运，但却容易被滞留于粘膜黏液层中，而无法到达吸收部位;具有亲水表面的电中性或弱负电性纳米制剂，可以快速渗透粘膜黏液层到达小肠上皮细胞顶侧，但其电中性亲水表面却不利于小肠上皮细胞的吞噬转运。因此，如何调控纳米载体的表面性质，使其在具有黏液层渗透性的同时，增强纳米载体在小肠上皮细胞处的粘附性与透过性，是提高纳米制剂小肠吸收效率的关键。小肠粘膜上皮细胞膜上存在大量的多药耐药性蛋白，如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，同时，小肠和肝脏细胞微粒体中的细胞色素P450对大部分抗肿瘤药物具有较强的代谢作用，由此而产生的首过效应是限制抗肿瘤药物口服生物利用度的另一重要因素。如何提高纳米制剂黏液层渗透性的同时，赋予纳米制剂P-gp抑制能力，是本发明所解决的关键问题。本发明分别以碱性磷酸酶底物和P-gp抑制剂一一槲皮素对壳聚糖分子进行双亲化修饰，通过自组装技术制备具有黏液层渗透和P-gp抑制双重作用的纳米胶束。纳米胶束表面亲水性的碱性磷酸酶底物，一方面，可以保证纳米胶束具有弱负电性或电中性表面而有利于黏液层的穿透，另一方面，在小肠上皮细胞膜碱性磷酸酶的催化作用下，纳米胶束的亲水基团发生去磷酸化作用脱去磷酸基团，恢复壳聚糖基纳米胶束的聚阳离子属性，提高纳米载体对小肠上皮细胞的粘附性和透过性；槲皮素的疏水化改性，一方面作为形成稳定纳米胶束的结构基础，另一方面赋予纳米载体避免首过效应的功效，具有十分重要的理论意义和临床应用价值。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种具有黏液层渗透和P-gp抑制双重作用纳米胶束的制备方法，以弥补已有技术的不足。
[0004]本发明以壳聚糖、槲皮素和6磷酸葡萄糖酸三钠盐为原料，通过缩合脂化法制备双亲性壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6磷酸葡萄糖酸共聚物，通过自组装技术合成目标产物，即一种具有黏液层渗透和P-gp抑制双重作用纳米胶束，具体步骤如下:
(I)将槲皮素溶于二甲基亚砜中，加入丁二酸酐，40 0C下搅拌反应，加入EDC/NHS，调节pH至5.0，室温下搅拌反应，逐滴加入壳聚糖水溶液，室温下搅拌反应6小时，置于二甲基亚砜中透析2天，再于去离子水中充分透析，冻干制得壳聚糖-琥珀酸脂； (2)将6磷酸葡萄糖酸三钠盐溶解在水中，加入EDC，调节pH至5.0，40°C下搅拌反应，逐滴加入壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂，室温下搅拌反应12小时，置于去离子水中充分透析，冻干制得壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6磷酸葡萄糖酸；
(3)纳米胶束的制备:将壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸溶于稀酸溶液中，冰浴超声后冻干即得目标产物，即壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸纳米胶束。
[0005]本发明具有操作简便、制备技术工艺简单以及制造成本低廉等优点，可以通过改变投料比及反应时间来调整双亲性共聚物的取代度，进而改变纳米胶束的粒径，所形成的壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸纳米胶束为规则球形，平均粒径在30 - 50 nm。本发明的重要意义在于形成的壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸纳米胶束具有良好的黏液层渗透性，同时兼顾P-gp抑制作用，能够有效提高抗肿瘤药物的口服递送效率，具有良好的开发应用潜力，以下结合附图和实施例对本发明做出进一步说明。
【附图说明】
[0006]图1为壳聚糖、壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯、壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸的核磁共振图谱。
[0007]图2为壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸透射电镜照片。
[0008]实施例1
称取槲皮素60 mg溶于5 mL二甲基亚砜中，加入20.2 mg丁二酸酐后在40 "€下搅拌反应4小时。称取38.4 mg EDC和46 mg NHS加入到反应液中，用HCl调节反应液pH至5.0，室温下搅拌反应30分钟。称取0.2 g壳聚糖溶于5 mL水中，将壳聚糖水溶液逐滴加入反应液中，室温下搅拌反应6小时，置于二甲基亚砜溶液中透析2天，再在去离子水中充分透析，冻干制得壳聚糖-琥珀酸脂;称取6 mg 6-磷酸葡萄糖酸三钠溶解在1.5 mL水中，加入3.4 mg EDC,用HCl调节pH至5.0，40 °C下搅拌反应30分钟，称取30 mg壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂溶于3mL水中，将壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂水溶液逐滴加入反应液中，室温下搅拌反应12小时，在去离子水中充分透析，冻干制得壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6磷酸葡萄糖酸;称取2 mg壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸溶于2 mL稀酸溶液中，冰浴超声即得壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸纳米胶束。
[0009]实施例2
称取槲皮素150 mg溶于5mL二甲基亚砜中，加入40.4mg丁二酸酐后在40 °C下搅拌反应4小时。称取76.8 mg EDC和9.2 mg NHS加入到反应液中，用HCl调节反应液pH至5.0，室温下搅拌反应30分钟。称取0.2 g壳聚糖溶于5 mL水中，将壳聚糖水溶液逐滴加入反应液中，室温下搅拌反应6小时，置于二甲基亚砜溶液中透析2天，再在去离子水中充分透析，冻干制得壳聚糖-琥珀酸脂;称取20 mg 6-磷酸葡萄糖酸三钠溶解在2 mL水中，加入22.4 mg EDC，用HCl调节pH至5.0，40°C下搅拌反应30分钟，称取28 mg壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂溶于4 mL水中，将壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂水溶液逐滴加入反应液中，室温下搅拌反应12小时，在去离子水中充分透析，冻干制得壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6磷酸葡萄糖酸;称取3 mg壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸溶于10 mL稀酸溶液中，冰浴超声即得壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸纳米胶束。
[0010]实施例3 称取槲皮素7.6 mg溶于7.6 mL二甲基亚砜中，加入3 mg丁二酸酐后在40 °〇下搅拌反应4小时。称取11.6 mg EDC和7 mg NHS加入到反应液中，用HCl调节反应液pH至5.0，室温下搅拌反应30分钟。称取0.1 g壳聚糖溶于5 mL水中，将壳聚糖水溶液逐滴加入反应液中，室温下搅拌反应6小时，置于二甲基亚砜溶液中透析2天，再在去离子水中充分透析，冻干制得壳聚糖-琥珀酸脂;称取2 mg 6-磷酸葡萄糖酸三钠溶解在2 mL水中，加入11.2 mg EDC，用HCl调节pH至5.0，40°C下搅拌反应30分钟，称取9.6 mg壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂溶于4 mL水中，将壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂水溶液逐滴加入反应液中，室温下搅拌反应12小时，在去离子水中充分透析，冻干制得壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6磷酸葡萄糖酸;称取2 mg壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸溶于4 mL稀酸溶液中，冰浴超声即得壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸纳米胶束。
【主权项】
1.一种具有黏液层渗透和P-gp抑制双重作用纳米胶束的制备方法，其特征在于分别利用槲皮素和6磷酸葡萄糖酸对壳聚糖分子进行双亲性修饰，通过自组装技术制备得到壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6磷酸葡萄糖酸纳米胶束，具体步骤如下: (1)壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂制备:将槲皮素溶于二甲基亚砜中，溶液浓度浓度为I?30 mg/mL，加入丁二酸酐，其中槲皮素与丁二酸酐的摩尔比为0.8 - 1.2: 1,40 °C下搅拌反应4小时，加入EDC/NHS，pH调至5.0，其中EDC与丁二酸酐摩尔比为I?2:1，EDC与NHS摩尔比为0.5?5:1，室温下搅拌反应30分钟，逐滴加入壳聚糖水溶液，其中壳聚糖水溶液浓度为20?40 mg/mL，壳聚糖分子量为1500?5000Da，壳聚糖与槲皮素摩尔比为1.55?31:1，调节pH至5.0，室温下搅拌反应6小时，置于二甲基亚砜中透析2天，再于去离子水中充分透析，冻干制得壳聚糖-琥珀酸脂； (2)壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6磷酸葡萄糖酸制备:将6磷酸葡萄糖酸三钠盐溶解在水中，溶液浓度为I?10 mg/mL，加入EDC，其中EDC与6磷酸葡萄糖酸三钠盐的摩尔比为I?10: 1，调节pH至5.0，40°C下搅拌反应30分钟，逐滴加入壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂水溶液，其中壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂水溶液浓度为2?7mg/mL，壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂与6磷酸葡萄糖酸的摩尔比为2?10: 1，室温下搅拌反应12小时，置于去离子水中充分透析，冻干制得壳聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6磷酸葡萄糖酸； (3)纳米胶束的制备:将壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸溶于稀酸溶液中，溶液浓度为0.3?I mg/mL，冰浴超声后冻干即得壳聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6磷酸葡萄糖酸纳米胶束。2.根据权利要求1所述的具有黏液层渗透和P-gp抑制双重作用纳米胶束的制备方法，其特征是在纳米胶束的制备中，稀酸溶液为I %醋酸或I %的盐酸。
【文档编号】A61P35/00GK106038485SQ201610494581
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】冯超, 穆愈之, 陈西广, 孔明, 程晓杰, 刘雅
【申请人】中国海洋大学