拟杆菌在检测和治疗母乳性黄疸中的用图
【专利摘要】本发明提供了拟杆菌和/或其代谢产物及其组合物的一种新用途，即在治疗母乳性黄疸及相关疾病中的用途；本发明还提供了一种组合物，包括拟杆菌和/或其代谢产物，以及双歧杆菌和/或其代谢产物；本发明进一步提供了筛选易患母乳性黄疸的生物样品的系统，通过此筛选系统，可筛选易患母乳性黄疸的生物样品；本发明更进一步提供了治疗和辅助治疗母乳性黄疸及相关疾病中的肠道菌种和/或其代谢物的筛选方法，通过此方法可筛选出治疗和辅助治疗母乳性黄疸及相关疾病中的肠道菌种和/或其代谢物。
【专利说明】
拟杆菌在检测和治疗母乳性黄疸中的用途
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物领域，具体地，本发明涉及拟杆菌及其组合物在治疗母乳性黄疸及相关疾病中的用途。
【背景技术】
[0002]母乳性黄疸(breast milk jaundice，BMJ)指母乳喂养的婴儿在生后4?7天出现黄疸，非溶血性非结合性胆红素(UCB)升高，患儿血清胆红素水平高于生理性黄疸，但不超过12mg/dL，一般状况良好，无溶血或贫血表现，黄疸一般持续3?4周。
[0003]随着母乳喂养的普及，BMJ的发生率逐年提高，目前已达20%?30%。其发病机制至今尚未明确，多认为与新生儿胆红素代谢的肠肝循环增加有关，新生儿小肠内的葡萄糖醛酸苷酶(β-GD)含量较多，主要来源于母乳，其活性也高，可催化结合胆红素变成未结合胆红素，吸收增加，即出现BMJ。另一方面，新生儿的肠道菌群不完善，可能因肠道中缺乏以上将胆红素转化为尿胆原的菌群，进而导致肠道胆红素不能顺利转化为粪胆原，从而引起胆红素肠肝循环增加，出现BMJ。严重的BMJ患者可出现胆红素脑病，因此它可以严重影响患儿的健康以及母亲的心情，不利于母乳喂养的推广。
[0004]微生态制剂已广泛应用于降低BMJ患儿肠道中β-GD的活性。目前已有报道指出新生儿肠道菌群的定植是个复杂的过程，婴儿在出生后24h大肠杆菌占优势，双歧杆菌于生后第2天出现，增长十分迅速，第4?5天开始占优势，I周后其数量可达细菌总数的98%。现有研究表明双歧杆菌可能与BMJ有关，补充利用双歧杆菌制成的微生态制剂可能会有效治疗BMJ，但目前对BMJ患者的肠道菌群的研究还不全面。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供拟杆菌和/或其代谢物及其组合物在制备治疗和辅助治疗母乳性黄疸或其相关疾病的产品上的用途，本发明还提供一种筛选易患母乳性黄疸的生物样品的系统以及一种用于治疗和辅助治疗母乳性黄疸的肠道菌种和/或其代谢物的筛选方法。
[0006]本发明第一方面公开了拟杆菌和/或其代谢物在制备治疗和辅助治疗母乳性黄疸或其相关疾病的产品上的用途。
[0007]在一优选例中，所述的拟杆菌为脆弱拟杆菌或者多形拟杆菌，亦或者为脆弱拟杆菌和多形拟杆菌。
[0008]在一优选例中，本发明第一方面所述的产品为药物或食品。
[0009]本发明第二方面公开了包含拟杆菌和/或其代谢产物的组合物在制备治疗和辅助治疗母乳性黄疸或其相关疾病的产品上的用途。
[0010]在一优选例中，所述的组合物包括:(a)安全有效量的本发明第一方面所述的拟杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。
[0011]在一优选例中，本发明第二方面所述的产品为药物和食品。
[0012]在一优选例中，所述的拟杆菌为脆弱拟杆菌或者多形拟杆菌，亦或者为脆弱拟杆菌和多形拟杆菌。
[0013]在一优选例中，所述的组合物可进一步包括:益生菌和/或益生元。更为具体地，所述的益生菌为双歧杆菌。
[0014]在一优选例中，本发明第一方面、第二方面所述的产品所述的产品为口服制剂。
[0015]在一优选例中，本发明第一方面、第二方面所述的产品所述的产品为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。
[0016]在一优选例中，本发明第一方面、第二方面所述的产品所述的产品的剂型选自下组:粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、和舌下含片。
[0017]在一优选例中，本发明第一方面、第二方面所述的产品所述的产品包括乳液制品、?谷液制品、粉末制品、或悬浮液制品。
[0018]在一优选例中，本发明第一方面、第二方面所述的产品所述的产品包括乳品、乳粉、或乳液。
[0019]在一优选例中，本发明第一方面、第二方面所述的产品所述的液态制剂选自下组:?谷液制品或悬浮液制品。
[0020]本发明第三方面公开了一种组合物，包括拟杆菌和/或其代谢产物，以及双歧杆菌和/或其代谢产物。
[0021 ]在一优选例中，所述拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌；
[0022]在一优选例中，该组合物还包括食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。
[0023]本发明第四方面公开了一种筛选易患母乳性黄疸的生物样品的系统，包括:
[0024]核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品中提取核酸样本；
[0025]核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的序列；以及
[0026]判断装置，所述判断装置与所述测序装置相连，基于所述核酸样本的序列对其肠道菌群所含的拟杆菌进行分析，根据分析结果判断所述生物样品是否易患母乳性黄疸；
[0027]在一优选例中，所述拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌；
[0028]在一优选例中，所述核酸序列确定装置进一步包括:
[0029]文库构建单元，所述文库构建单元用于基于所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及
[0030]测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，对所述文库进行测序，以便确定所述核酸样本的序列，
[0031]在一优选例中，所述文库构建单元进一步包括:
[0032]PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置拟杆菌的特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行扩增。
[0033]本发明第五方面公开了一种用于检测生物样品中拟杆菌和/或其代谢产物水平的检测试剂盒在筛选易患母乳性黄疸的生物样品中的应用；
[0034]在一优选例中，所述拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌。
[0035]本发明第六方面公开了一种用于检测生物样品中拟杆菌和/或其代谢产物，以及双歧杆菌和/或其代谢产物的检测试剂盒在筛选易患母乳性黄疸的生物样品中的应用；
[0036]在一优选例中，所述拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌。
[0037]本发明第七方面公开了一种筛选易患母乳性黄疸的生物样品的系统，包括:
[0038]用于治疗和辅助治疗BMJ的肠道菌种和/或其代谢物的筛选方法，包括以下步骤:
[0039]I)分别收集母乳性黄疸患儿和正常婴儿的粪便，提取粪便中DNA;
[0040]2)将提取的DNA建库测序，获得DNA测序结果；
[0041]3)根据DNA测序结果对肠道菌群进行分类并对菌群进行功能分析，获得功能分析结果；
[0042]4)根据功能分析结果统计菌群种类、丰度的差异，获得差异信息；
[0043]5)根据差异信息将其中具有显著差异的肠道菌种和/或其代谢物作为候选菌种和/或候选菌种代谢物；
[0044]所述候选菌种和/或候选菌种代谢物含有拟杆菌和/或其代谢物。
[0045]在一优选例中，所述的拟杆菌为脆弱拟杆菌或者多形拟杆菌，亦或者为脆弱拟杆菌和多形拟杆菌;所述的代谢物为脆弱拟杆菌或多形拟杆菌的代谢物，亦或者为脆弱拟杆菌和多形拟杆菌的代谢物。
[0046]本发明具有以下有益效果:
[0047]本发明首次发现母乳性黄疸的致病与拟杆菌和/或其代谢物有关，因此可将拟杆菌和/或其代谢物及其组合物作为母乳性黄疸及其相关疾病的检测标志物，或者将拟杆菌和/或其代谢物及其组合物制备成产品应用于母乳性黄疸及其相关疾病的治疗。
【附图说明】
[0048]图1是母乳性黄疸(BMJ)和对照组菌群丰度及种类对比图。其中左图是样品菌种丰度的分布情况，右图是菌群种类的分布情况，纵轴均取1glO后的数据结果，每个点代表一个样品。
[0049]图2是母乳性黄疸(BMJ)和对照组差异显著细菌热图。图中每列代表一个样品，每行代表有统计学差异(P<0.05)的菌种。其中颜色浅的代表低表达，颜色深的代表高表达。
【具体实施方式】
[0050]本文所用术语“拟杆菌”和“Bacteroides”可互换使用；“脆弱拟杆菌”和uBacteroides fragilis”可互换使用；“多形拟杆菌”和“Bacteroides theta1taomicron”可互换使用；“母乳性黄疸”和“BMJ”可互换使用。
[0051 ] 实施例一
[0052]1.样品来源
[0053]16例母乳性黄疸(BMJ)患儿:男14例，女2例，年龄32-80天，平均46.6 ± 13.4天。足月15例，早产I例，顺产及剖腹产均8例，均为母乳喂养。血清总胆红素为73.7-330.7umol/l，平均212.2 ± 65.9umo 1/1,大便金黄，糊状，无粘液脓血。BMJ样品名称分别为:BMJ1、BMJ1、BMJ3、BMJ4、BMJ5、BMJ6、BMJ7、BMJ8、BMJ9、BMJ10、BMJ11、12、BMJ13、BMJ14、BMJ15、BMJ16。
[0054]16例儿保科体检的正常婴儿:男11例，女5例，年龄为40-80天，平均50.4 ± 14.6天，均为足月儿，顺产13例，剖腹产3例，母乳喂养14例，配方奶喂养2例。对照样品的名称分别为:HAF1、HAF2、HBF1、HBF2、HBF3、HBF4、HBF5、HBF6、HBF7、HNF1、HNF2、HNF3、HNF4、HNF5、HNF6、HNF70
[0055]两组婴儿年龄及性别均无显著性差异。所有婴儿均要求出生后没有应用抗生素和微生态制剂。
[0056]2.粪便采集与DNA提取
[0057]在收集婴儿粪便之前，由家长签知情同意书。住院患儿在入院后6小时内完成。粪便收集在一个容量为30ml的带有旋转盖子的干净的塑料盒中，收集大便约15克，编号登记后随即放入-80°C低温冰箱保存直到DNA提取。正常对照组婴儿大便收集则在儿保科门诊体检完成后收集，处理同前。所有粪便标本收集完后采用北京康为世纪生物科技有限公司提供的粪便DNA提取试剂盒(StoolGen DNA kit)进行DNA的提取。
[0058]3.宏基因组建库和鸟枪法宏基因组测序
[0059]取2ul已提取的DNA样品进行定量，所用的试剂盒为美国赛默飞世尔公司提供的试剂盒(Qubit dsDNA BR assay kit)。利用美国Illumina公司生产的Truseq DNA建库试剂盒进行建库，文库插入片段大小为200-500bp，该试剂盒连接在美国贝克曼库尔特公司生产的自动化SPRI工作站上。每个文库构建完成后，采用美国安捷伦科技公司生产的Agilent2100生物分析仪进行质控(QC,quality control)。通过QC后，S卩文库浓度需在3ng/yl以上，该文库用于后期测序，测序所用的平台为Illumina HiSeq 2500测序平台，测序方式为150bp双端测序。每个样本测得IG以上的数据。
[0060]4.菌群分类和基因功能注释
[0061]首先，过滤掉接头序列和一些质量差的测序reads。其次，所有测定的序列均对照人类参考基因组Hgl9以剔除人基因组序列。再次，采用最新的MEGAN软件(S卩MEGAN5)(http://ab.1nf.un1-tuebinge η.de/software/megan5/下载)对鸟枪法宏基因组数据进行菌群分类及基因功能分析。最后，分类分析和基因功能注释结果应用KEGG(http://www.genome.jp/kegg/keggl.html)和eggNOG数据库进行功能注释，得到的菌种和基因功能通路等数据用于后续的统计分析。
[0062]5.统计学分析
[0063]鸟枪法宏基因组测序得到的数据，菌群的丰度和种类进行独立T检验;菌群的丰度标准化(即均一化为一百万条测序序列)后分别应用wilcoxon秩和检验和DESeq2(DESeq2的使用可参考文献Love MI ,Huber ff ,Anders S.Moderated estimat1n of fold changeand dispers1n for RNA-seq data with DESeq2[J].Genome B1logy,2014,15(12):550)计算;KEGG注释的功能通路得到的数据采用wilcoxon秩和检验进行分析。
[0064]结果:
[0065]1.BMJ组和对照组在菌群丰度和菌群种类的总体水平上无显著差异。
[0066]通过测序所得的样品菌群丰度及种类情况(如图1)，采用独立T检验，BMJ组和对照组的数据无显著差异(P>0.05)。
[0067]2.BMJ组和对照组在菌群种类上有细微差异，能检测到一些差异显著的菌种。
[0068]菌种数据标准化后(即均一化为一百万条测序序列)，用wilcoxon秩和检验的方法，将得到的P值小于等于0.05的菌种，用DESeq2计算组间log2(样品组/对照组)差异绝对值不小于I的菌种，然后，选择样品中菌群平均表达量不小于100的菌种，最后将这些菌种画出热图，见图2。结果显示双歧杆菌、拟杆菌(包括脆弱拟杆菌、多形拟杆菌)在BMJ组中明显少于对照组(P<0.05)，而罗氏菌属比BMJ组多，因此实际应用中可以通过补充特定的菌群(拟杆菌和/或双歧杆菌)或其代谢产物来治疗母乳性黄疸。
[0069]3.BMJ和对照组在菌群功能通路水平上有差异
[ΟΟΤ?]利用KEGG数据库对基因进行功能注释后，选取第三级的功能通路(kegg pathwaylevel 3)的数据，先标准化后(即均一化为一百万条测序序列)，然后进行wilcoxon秩和检验，将差异显著(P< = 0.05)的通路绘成热图，能发现在BMJ和对照组占比有差异的功能通路，而且，大多是BMJ组的表达高于对照组，如甘油脂质代谢、花生四烯酸代谢、磷酸肌醇代谢及苯乙烯降解等功能。
[0071 ] 4.寻找BMJ和对照组代谢通路基因水平的差异
[0072]将BMJ组和对照组中KEGG数据库里面注释到的第二级通路数据(KEGG pathwaylevel 2)绘画成盒子图，发现BMJ和对照组在不同的功能通路水平有差异，尤其是糖生物合成和代谢通路。为了进一步验证BMJ和对照组中糖合成和代谢的功能通路，我们将这部分数据提取出来，进行了 wilcoxon秩和检验，发现BMJ和对照组菌群中参与糖合成和代谢的基因数有显著差异(P<0.05)，BMJ组菌群参与糖合成和代谢的基因数明显少于对照组。
【主权项】
1.一种拟杆菌和/或其代谢产物在制备治疗或辅助治疗母乳性黄疸或其相关疾病的产品上的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌； 任选的，所述的产品为药物或食品。3.—种包含拟杆菌和/或其代谢产物的组合物在制备治疗或辅助治疗母乳性黄疸或其相关疾病的产品上的用途； 任选的，所述组合物包括:(a)安全有效量的拟杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体； 任选的，所述的产品为药物或食品。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌。5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述组合物还包括:益生菌和/或益生元； 任选的，所述益生菌为双歧杆菌。6.一种组合物，其特征在于，包括拟杆菌和/或其代谢产物，以及双歧杆菌和/或其代谢产物； 任选的，所述拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌； 任选的，该组合物还包括食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。7.一种筛选易患母乳性黄疸的生物样品的系统，其特征在于，包括: 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品中提取核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的序列；以及 判断装置，所述判断装置与所述测序装置相连，基于所述核酸样本的序列对其肠道菌群所含的拟杆菌进行分析，根据分析结果判断所述生物样品是否易患母乳性黄疸； 任选的，所述拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌； 任选的，所述核酸序列确定装置进一步包括: 文库构建单元，所述文库构建单元用于基于所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，对所述文库进行测序，以便确定所述核酸样本的序列， 任选地，所述文库构建单元进一步包括: PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置拟杆菌的特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行扩增。8.用于检测生物样品中拟杆菌和/或其代谢产物水平的检测试剂盒在筛选易患母乳性黄疸的生物样品中的应用； 任选的，所述拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌。9.用于检测生物样品中拟杆菌和/或其代谢产物，以及双歧杆菌和/或其代谢产物的检测试剂盒在筛选易患母乳性黄疸的生物样品中的应用； 任选的，所述拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌。10.—种用于治疗或辅助治疗母乳性黄疸的肠道菌种和/或其代谢物的筛选方法，包括以下步骤: 分别收集母乳性黄疸患儿和正常婴儿的粪便，提取粪便中的DNA; 将DNA建库测序，获得DNA测序结果； 根据DNA测序结果对肠道菌群进行分类并对菌群进行功能分析，获得功能分析结果； 根据功能分析结果统计菌群种类、丰度的差异，获得差异信息； 根据差异信息将其中具有显著差异的肠道菌种和/或其代谢物作为候选菌种和/或候选菌种代谢物； 所述候选菌种和/或候选菌种代谢物包含有拟杆菌和/或其代谢物； 任选的，所述的拟杆菌为脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌。
【文档编号】C12Q1/68GK106038609SQ201610583576
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月13日 公开号201610583576.4, CN 106038609 A, CN 106038609A, CN 201610583576, CN-A-106038609, CN106038609 A, CN106038609A, CN201610583576, CN201610583576.4
【发明人】周少明, 王明帮, 代东伶, 王艳, 蔡华波, 周建利
【申请人】深圳市儿童医院, 深圳市英马诺生物科技有限公司